We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

Animali: tipo selvaggio C57Bl / 6J topi allevati presso l&#39;Università della California a Los Angeles (UCLA). Tutti gli animali erano tra 11-17 settimane di vita, e compresi i topi maschi e femmine. Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo, mantenuto in un ciclo 12:12 chiaro / scuro con cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della UCLA e l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology Dichiarazione per l&#39;uso di animali in oftalmica e Vision Research. NOTA: Tutti i farmaci e gli agenti iniettabili sono United States Pharmacopeia (USP) di grado. 1. Preparazione chirurgica <ol><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg ketamina e 8 mg / kg xylazina in un mix salina. Somministrare anestesia per una profondità tale che il mouse non ha pinch punta o riflessi tattili corneali. </li><li> Mantenere la temperatura corporea a 37,0 ° C con un pad acqua circolante. </li><li> Dilatare gli alunni con 2,5% fenilefrina occhio dROPS e tagliare le basette per facilitare la visualizzazione. Whiskers forniscono significativi input sensoriale al mouse, quindi, basette rifilatura dovrebbe rimuovere solo la parte che blocca l&#39;accesso chiaro ad occhio, e non alla base del baffo. Nella nostra esperienza, i topi mostrano normale recupero dopo questa procedura. Applicare occhio metilcellulosa scende a prevenire la secchezza e ridurre al minimo anestetici indotte cataratta transitorie 13. </li><li> Sterilizzare gli strumenti prima dell&#39;intervento chirurgico (cioè, betadine ed etanolo o perline caldi). </li><li> Preparare fluoresceina diluita (0,01% con soluzione fisiologica 0,9%), in un ambiente sterile (cioè, armadio biosicurezza) se verrà eseguita la visualizzazione (vedere la sezione 3). </li></ol> 2. Preparazione del sito di iniezione <ol><li> Preparare una siringa (ad esempio, 5 microlitri siringa) con il volume appropriato di iniezione (ad esempio 0,3 fino 1.0 mL). </li><li> Posizionare il mouse così l&#39;occhio è rivolto verso l&#39;alto e chiaramente visibile nella dissecting microscopio. </li><li> pizzicare delicatamente la congiuntiva temporale con pinza sottile a punta. Effettuare una incisione circonferenziale di circa 90 gradi con le forbici Vännäs curve. </li><li> Ripetere il passaggio 2.3 con la capsula sottostante del Tenon. </li><li> Resecare il tessuto connettivo circostante con pinza sottile a punta durante la rotazione del globo per via nasale. Lavorare per il sito di iniezione di circa 0,5 millimetri temporale al nervo ottico. Usare molta attenzione per evitare di interrompere il seno retro-orbitale. </li></ol> 3. sclerotomie e sottoretinico Iniezione NOTA: Si raccomanda che l&#39;iniezione di 0,01% fluoresceina nel 0,9% Saline essere usato per aiutare con la visualizzazione, mentre l&#39;apprendimento di questa procedura. La distribuzione topografica della fluoresceina può essere efficacemente documentato con immagini fundus (vedi sezione 4). <ol><li> Fai una piccola incisione sclerale al sito di iniezione graffiando leggermente l&#39;oculare con una lama oftalmica 22,5 gradi. Questo shou incisioneLd essere abbastanza grande da permettere alla punta dell&#39;ago di passare attraverso la sclera soltanto. </li><li> Inserire il smussato 33 ago G (angolato. 5 - 10 ° nel sclerotomie con lo smusso rivolto e angolata parallela alla retina Iniettare volume desiderato (ad esempio, da 0,3 a 1,0 ml di 0,01% fluoresceina a fini di apprendimento). NOTA: Mantenere sterilità della siringa accuratamente pulizia con lavaggi successivi di un adatto solvente e acqua deionizzata prima di ciascuna iniezione. </li><li> Premere il pistone lentamente (oltre ~ 3 sec) senza spostare l&#39;ago e con una pressione uniforme. NOTA: quando l&#39;ago è nello spazio sottoretinico, una leggera resistenza verrà sentito mentre si preme lo stantuffo. Non ci sarà per una resistenza minima se l&#39;ago perfora la retina, ed elevata resistenza se l&#39;ago non penetra la sclera o RPE. </li><li> Attendere alcuni secondi prima di estrarre l&#39;ago per ridurre al minimo il riflusso. </li><li> Lavare l&#39;occhio con soluzione salina tamponata sterile e garantire l&#39;occhio hcome ruotato nella sua posizione normale. </li></ol> 4. Valutazione di distacco retinico da Office e Retinografia <ol><li> Eseguire l&#39;imaging ottobre immediatamente dopo l&#39;iniezione per valutare la qualità della iniezione e al momento opportuno punti post-iniezione come necessario per valutare la struttura della retina. NOTA: Esempi di utilizzo dei PTOM studi simili è stata precedentemente descritta 7,14. <ol><li> Regolare e allineare l&#39;immagine di Office per indirizzare il sito di iniezione. Il sito di iniezione deve essere linea mediana e 0,5 millimetri temporale alla testa del nervo ottico. Ripetere se necessario se il distacco è fuori della cornice o meno ottimale centrata. </li></ol></li><li> Visualizza distacco della retina e tingere zona di iniezione con bagno en-face immagini fundus 7,14. NOTA: Se un sistema di imaging il PTOM non è disponibile, l&#39;iniezione di una piccola quantità di fluoresceina con un vettore per la pratica consentirà visualizzazione con qualsiasi telecamera fundus che esegue fluoresceina angiografia utilizzando le stesse lunghezze d&#39;onda di eccitazione e blocco filtri. aree localizzate di iper-fluorescenza appariranno sotto il sistema vascolare e il sistema vascolare avranno confini netti e distinti se lo spazio sottoretinico si rivolge in modo corretto. Il bordo della bozza dalla iniezione sarà delimitata dalla transizione da iper a fluorescenza ipo. Diversi strumenti forniscono questa funzionalità per il mouse; la strumentazione usata qui è descritto altrove 14. </li></ol> Cura 5. post-operatoria <ol><li> Applicare uno spesso strato di crema tripla oftalmica antibiotica alla superficie della cornea dell&#39;occhio iniettato. </li><li> Mettere i topi in gabbie pulite solitarie per il recupero. Non combinare i topi che hanno subito un intervento chirurgico fino a quando non sono completamente recuperati. </li><li> Monitorare la respirazione e la temperatura durante il recupero l&#39;anestesia. Monitorare gli animali fino a che non possono mantenere la decubito sternale. </li><li> Eseguire ulteriore monitoraggio post-operatorio adeguatoe il trattamento, compresa una iniezione sottocutanea di carprofen (5 mg / kg) per la gestione del dolore post-operatorio. </li></ol> 6. Valutazione della funzione della retina da Elettroretinografia (ERG) <ol><li> Eseguire l&#39;analisi ERG pre-iniezione e al momento opportuno dopo l&#39;iniezione come necessario per valutare la funzionalità della retina. Se l&#39;iniezione è stata fatta nello spazio sottoretinico, il distacco di retina dovrebbe risolvere entro 72 ore. <ol><li> Utilizzare le tecniche standard ERG per valutare la funzione della retina, prima e dopo l&#39;iniezione come descritto in precedenza 14,15. </li></ol></li></ol> 7. La ricostruzione 3D e quantificazione Bleb Volume NOTA: OCT scansioni con alto contrasto che comprende l&#39;intero distaccamento all&#39;interno della cornice di vista sono ottimali per l&#39;uso. ImageJ / Fiji 17,18 e Imaris sono stati utilizzati, ma altri software possono essere utilizzati. <ol><li> Esportare il B-scan di interesse, l&#39;importazione di ImageJ / Fiji e delle colture (Immagine&gt; Ritaglia) la porzione di sc ottobreuna a modellare utilizzando lo strumento di selezione rettangolare. <ol><li> Regolare il contrasto (Immagine&gt; Regola&gt; Luminosità / Contrasto) e delineare eventuali limiti mancanti collegando due sezioni con una linea. </li><li> Tracciare una linea retta con il (spostamento di mantenimento) strumento linea che attraversa il RPE allo strato dei fotorecettori. Misura (Analizza&gt; Measure) la lunghezza della linea per ottenere le dimensioni di massima distacco per la fase 7.8. </li></ol></li><li> Importa fotogrammi al software 3D-ricostruzione rifilate (Vedi tabella dei materiali) utilizzando il &quot;RGB a grigio&quot; plugin e MATLAB Compiler Runtime. </li><li> Impostare la dimensione voxel (sotto Proprietà immagine) utilizzando i parametri di calibrazione dalla scansione OCT (x, y, z). </li><li> Eseguire il plugin &quot;RGB a Gray&quot; (sotto Proprietà immagine), con uguale ponderazione di ogni canale, di creare un quarto canale. Eliminare i canali rosso-verde-blu originali. </li><li> Invertire il canale di grigio utilizzando cambiamento contrasto. Image Store. </li><li> Fare clic su &quot;aggiungi unsuperficie ew &quot;pulsante nella scheda 3D-View, e iniziare il processo guidato 4 fase di creazione della superficie. <ol><li> Impostare il livello di dettaglio della superficie (passaggio 1 di 4). NOTA: Nella nostra esperienza 8,0-12,0 era la gamma più efficace. </li><li> Impostare la dimensione della sfera massimo (in Selezione Background) leggermente inferiore alla dimensione massima di distacco misurata in 7.1.2. Creare la superficie e annullare l&#39;inversione del canale grigio (fase 2 di 4). </li><li> Impostare la soglia al valore massimo per cui la superficie degli spazi negativi esterni della retina e il distacco non venga a contatto (passaggio 3 di 4). </li><li> Impostare il tipo di filtro per il numero di voxel e isolare lo spazio negativo nel sito distaccata dimensioni. Finire la superficie (fase 4 di 4). NOTA: Il volume della superficie di distacco si trova sotto il volume nella scheda statistiche. </li></ol></li></ol>

<ol>
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A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

iniezioni sottoretiniche sono il metodo di scelta per la fornitura di vettori virali e terapia con cellule staminali di derivazione per manipolare fotorecettori e RPE sia nella ricerca di base e trattamento clinico. Nei pazienti, le iniezioni sottoretiniche sono in genere fatto con un sclerotomie anteriore alla pars plana, una vitrectomia nucleo posteriore e la penetrazione della retina per l&#39;ago con visualizzazione diretta. Come con la maggior parte delle procedure vitrectomia, è comune per la formazione di cataratta a verificarsi prematuramente a meno che l&#39;occhio è già pseudofachico. Nei topi, iniezioni sottoretiniche sono tradizionalmente realizzate con anteriore sclerotomie alla retina, un metodo frequentemente associata sia intaccare della lente, che occupa la maggior parte della cavità posteriore dell&#39;occhio, e la penetrazione Transretinal che può portare ad intrappolamento vitreo e completa distacchi di retina. Usando una tecnica postero-approccio nei topi riduce queste conseguenze indesiderate e migliora la capacità di interpretare efdifetti della manipolazione previsto. I vantaggi della tecnica di iniezione sottoretinico riportato qui includono effetti strutturali o funzionali minimi e ridotta danni collaterali (ad esempio, opacità da intaccare l&#39;obiettivo, perdite del vitreo o infiammazione), che consente una più facile valutazione dei risultati sperimentali e tempi di recupero più rapidi. Questa tecnica richiede maggiore manipolazione dell&#39;occhio per raggiungere il polo posteriore, ma può essere completata in circa 10 - 15 minuti per occhio con un alto tasso di successo senza occhi sono respinti dall&#39;analisi. Nella maggior parte delle iniezioni, normale struttura e funzione della retina è stata osservata entro 4 settimane. In confronto, gli studi precedenti riportano 5 - 8 settimane per il recupero della struttura e della funzione o non riportano un tempo di recupero 6,7. Di conseguenza, gli esperimenti possono essere completati in meno tempo con un minor numero di animali. Le complicanze di questa tecnica di iniezione sottoretinico inclusi formazione di cicatrici e la perdita difotorecettori a circa il 10% delle iniezioni, con solo tre casi di deficit strutturali e funzionali significativi. La retina mantenuto risposte normali alla luce con solo la più grande cicatrice funzione decrescente al 80% della risposta dei fotorecettori e il 77% della risposta retinica interna rispetto al pre-iniezione. incarcerazioni retiniche potrebbero essere ridotti con l&#39;uso di un ago nuovo per ogni iniezione, anche se questo non è stato valutato in questo studio. In alternativa, possono verificarsi a causa della pressione negativa e quindi inevitabile. Incarcerazioni sono molto comuni in iniezioni sottoretiniche umani, tuttavia, a causa delle grandi dimensioni dell&#39;occhio, incarcerazioni rappresentano meno danni alla retina totale. Di conseguenza, se un agente terapeutico era stato iniettato, il 90% degli occhi iniettati sarebbe disponibile per la valutazione degli effetti di tale intervento. La variabilità nelle misurazioni dello spessore della retina prima e dopo l&#39;iniezione sottoretinico riflette la riproducibilità di tha OCT strumento topi, la precisione di allineamento posizioni retiniche attraverso immagini e alterazioni retiniche da iniezione di soluzione salina fisiologica a basso dosaggio fluoresceina. Queste misure possono servire a guidare gli investigatori in calcoli di potenza per il numero di occhi e posizioni retiniche necessarie per rilevare cambiamenti statisticamente validi a causa di iniezioni sottoretiniche se non è presente un agente terapeutico. In 10 casi per i quali non sono stati 9 punti della griglia in tutte le scansioni della retina, la variabilità dello spessore retinico di fuori del sito di iniezione (5 - 8 punti per occhio) era del 7,2% ± 4,0%, anche in assenza di un tossica o agente terapeutico o di una distrofia retinica ereditaria. Tale variabilità è una considerazione per la definizione di criteri per il confronto dei risultati clinici utilizzando modelli murini per i trattamenti subretiniche, e suggerisce fortemente che i controlli appropriati includono iniezione sottoretinico del veicolo, piuttosto che un occhio uninjected 3. Infine, incoraggiamo investigratori di fare numerose scansioni OCT di più regioni della retina prima dell&#39;iniezione per migliorare la copertura del sito di iniezione in tutte le scansioni. L&#39;efficacia terapeutica sarà probabilmente raggiunto quando gli agenti sperimentali vengono consegnati ad una maggiore distesa della retina. In questi casi, i volumi più grandi sono l&#39;ideale, ma potrebbe non essere necessario in quanto 0,3 microlitri iniezioni spesso si formano vesciche piatti che hanno coperto una grande superficie della retina. La forma vescichetta non era controllabile, anche se i volumi di iniezione più grandi prodotte vesciche più a cupola. Fino a 1 microlitri può essere iniettata senza risultati negativi, tuttavia, è possibile che blebs cupola diventano così estese che i tocchi retina e aderisce alla capsula posteriore della lente, in particolare in topi giovani con bassi volumi vetrose. Nonostante il volume erogato dalla siringa, il volume effettivo mirato allo spazio sottoretinico è calcolato per essere meno. Questo può riflettere volume che non si acquisisce nelle scansioni OCT, in particolare per cupola o Fblebs lat o un artefatto della scansione di Office e successiva ricostruzione, ma possono riflettere la perdita di volume dal riflusso al momento della revoca dell&#39;ago. In sintesi, utilizzando un approccio posteriore per preparazioni iniettabili sottoretiniche ha minor numero di complicanze e miglioramenti di recupero, con un conseguente alto tasso di successo di targeting e basso tasso di esclusione. Questa tecnica è ideale per le manipolazioni virali, farmacologiche e cellulari di retine roditori.

Iniezioni sottoretinico sono il mezzo principale di diffondere agenti cellulari e virali per le retine di topi per studiare i loro effetti sui fotorecettori e RPE sottostante 1,2. La maggior parte dei protocolli di iniezione subretiniche nei topi utilizzano un transcorneal o di un sito di iniezione anteriore transcleral all&#39;equatore (Figura 1). Questo approccio può causare danni collaterali intrinseca che comprende intaccare e opacità risultante della lente, rottura dell&#39;integrità del vitreo, la penetrazione della retina neurosensoriale e iris, emorragia retinica, consistenti distacchi di retina e duratura edema sottoretinico 3-9. Manipolazioni sperimentali devono superare questi effetti al fine di valutare gli effetti degli interventi terapeutici 3,7,10,11. Questo studio fornisce una descrizione dettagliata e la validazione di un metodo di iniezione transcleral posteriore che evita queste complicazioni, riduce al minimo il trauma e ha un alto tasso di successo di mira il subspazio della retina. Le iniezioni di targeting spazio sottoretinico nei topi sono spesso molto difficili da eseguire e la maggior parte ricercatori incontrano una alta frequenza di tentativi falliti in cui il vettore è consegnato in una posizione non corretta o non vi è significativo danni alla retina, per esempio in un distacco della retina completa 6. Il numero di occhi esclusi dall&#39;analisi a causa di complicazioni di iniezione non è di solito indicata in studi sui topi, ma nella nostra esperienza e nella discussione con altri ricercatori, il numero di iniezioni falliti può essere alto come il 50% e variare a seconda del esperienza e capacità del ricercatore che sta eseguendo le iniezioni. Il successo della iniezione è di solito valutata mediante imaging fundus diretta e / o tomografia a coerenza ottica (OCT) 7,9. Un metodo facilmente masterizzato con alte percentuali di successo per le iniezioni sottoretiniche nei topi può accelerare la sperimentazione e ridurre il costo di studi preclinici di treatments per le malattie della retina che sono le principali cause di cecità negli Stati Uniti. Il posteriore, transcleral tecnica di iniezione sottoretinico qui descritto è un adattamento da protocolli clinici e preclinici 9,12. Le valutazioni diagnostiche non invasive effettuate in topi iniettati dimostrano i danni lievi e altamente localizzato e non hanno l&#39;obiettivo ulteriori garanzie, lesioni della retina e RPE. Inoltre, con relativamente poco pratica, sperimentatore può conseguire questi risultati con un alto tasso di successo (80 - 90% o superiore), riducendo così i costi associati a tali studi. Questa procedura può essere utilizzata per fornire interventi terapeutici cellulari, virali o farmacologici a fotorecettori e / o RPE in studi preclinici e valutare facilmente interventi sperimentali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hamilton Model 62 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87942</td>
			<td>Syringe x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle 33G, 1.0&#34;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Needles x 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Curved Scissors</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>1347</td>
			<td>5mm Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td>
			<td>Wilson Ophthalmic Corp.</td>
			<td>91204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaject&#160;</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-609-02</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>NDC 61311-482-10</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-50</td>
			<td>0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-235-35</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Circulating Pump</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP-500 T/Pump&#160;</td>
			<td>P/N 07999-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-OCT</td>
			<td>Bioptigen</td>
			<td>R-Series</td>
			<td>Commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fundus Camera</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories</td>
			<td>MICRON III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Type 3</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>5385-3SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine</td>
			<td>Paragon BioTeck</td>
			<td>NDC 42702-102-15</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS8</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Version 8.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>V1.8.0_77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypromellose&#160;2.5%</td>
			<td>Goniovisc</td>
			<td>AX0401</td>
			<td>Methylcellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Drops (Rinse)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Saline Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>P/N 20520</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

iniezioni sottoretinico sono stati utilizzati con successo in entrambi gli esseri umani e roditori per fornire interventi terapeutici di proteine, agenti virali, e le cellule al interphotoreceptor / vano sottoretinico che ha l&#39;esposizione diretta ai fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE). iniezioni sottoretinico di plasminogeno così come recenti studi preclinici e clinici hanno dimostrato la sicurezza e / o efficacia di erogare vettori virali e di cellule staminali per le persone con malattie della retina avanzata. modelli murini di malattie della retina, in particolare ereditaria distrofie retiniche, sono essenziali per testare queste terapie. La procedura di iniezione più comune nei roditori è utilizzare piccola transcorneal o incisioni transcleral con un approccio anteriore alla retina. Con questo approccio, l&#39;ago per l&#39;iniezione penetra la retina neurosensoriale interrompere il RPE sottostante e l&#39;inserimento può facilmente nick la lente, causando opacizzazione della lente e compromissione della imagi non invasivang. Accedere allo spazio sottoretinico attraverso un transcleral, approccio posteriore evita questi problemi: l&#39;ago attraversa la sclera circa 0,5 mm dal nervo ottico, senza penetrazione della retina ed evita interrompere il vitreo. danni collaterali è limitata a quella associata alla sclerotomie focale e gli effetti di un transitorio, sierosa distacco di retina. La semplicità del metodo minimizza lesioni oculari, assicura un rapido riattacco e recupero della retina, e ha un basso tasso di fallimento. Il minimo danno alla retina e RPE consente la chiara valutazione dell&#39;efficacia e degli effetti diretti degli stessi agenti terapeutici. Questo manoscritto descrive una tecnica di iniezione sottoretinico romanzo che può essere utilizzato per indirizzare vettori virali, gli agenti farmacologici, le cellule staminali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) allo spazio sottoretinico nei topi con elevata efficacia, danni minimi, e il recupero veloce.

Posteriori approccio iniezioni sottoretiniche transcleral sono state effettuate su 31 occhi sani da 16 topi wild type con iniezioni di 0,3 ml (n = 18), 0,5 ml (n = 8) e 1,0 ml (n = 5) di 0,01% fluoresceina. Un occhio è stato escluso dalla iniezione a causa di una opacità corneale pre-esistente che ha impedito l&#39;analisi strutturale e funzionale. Tutti gli occhi iniettati è incluso in questo rapporto. Nessun distacco della retina non intenzionali, punture della retina neurosensoriale, o perdite nel vitreo sono stati rilevati né era alcuna prova di intaccare l&#39;obiettivo, risposte infiammatorie, uveite, o infezioni post-chirurgiche in ogni occhi osservate. Struttura retinica è stata valutata pre-iniezione, 10 min dopo l&#39;iniezione e 4 settimane dopo l&#39;iniezione utilizzando l&#39;imaging OCT (figure 2 e 3). Una griglia 9 punti, con il punto centrale sovrastante il centro di distacco massimo, è stato posto sulla 10 minpost-iniezione l&#39;esplorazione del volto (Figura 2B). Usando punti di riferimento vascolari, pre-iniezione e 4 settimane scansioni post-iniezione sono stati ruotato per essere in registro con la scansione 10 minuti dopo l&#39;iniezione. Questo ha permesso l&#39;identificazione di esattamente le stesse posizioni di iniezione scansioni della retina pre e post (Figura 2A, C). Iniezioni sottoretinico provocato formazione bozza che è stato centrato lontano dal sito di iniezione, dove l&#39;ago è entrato nello spazio sottoretinico (Figura 2B freccia), e poteva essere piatta (Figura 3A), con un distacco poco profondo che si estende su una superficie estesa o cupola (Figura 3B - D) con profondo distacco in una zona vincolata (Tabella 1). Una bozza a cupola è stata definita come qualsiasi distacco che ha superato 50 micron ortogonali al RPE. Non ci sono rosette, un disegno ondulato prodotto da stiramento degli strati retinici esterni, sono stati osservati. L&#39;extenda di deposizione di iniezione è stato visualizzato con en face OCT (Figura 2D, linea tratteggiata), l&#39;imaging fundus fluoresceina (Figura 2E) e OCT B-scansioni (Figura 3). La maggior parte delle vesciche (29 su 31) estesa oltre il campo di vista delle scansioni OCT, che comprendono circa il 10% della retina mouse. Non c&#39;era alcun controllo su forma vescichetta diversa aumento della frequenza di vesciche a cupola con maggiori volumi di iniezione (Tabella 1). Tutti blebs risolti da 2 settimane (dati non riportati). Spessore della retina totale (membrana di Bruch allo strato delle fibre nervose) è stata valutata quantitativamente 4 settimane dopo l&#39;iniezione di 0,3 ml (Figura 3A), 0,5 ml (Figura 3B) e 1,0 ml (Figura 3C) volumi di iniezione in ciascun punto sulla griglia presente in corrispondente b-scansioni (Tabella 1). La differenza percentuale (% Δ) wcalcolato come differenza rispetto alle misurazioni pre-iniezione per entrambi i parametri strutturali e funzionali. Non tutti i punti della griglia sono stati acquisiti durante tutte le sessioni di imaging. Per esempio, 3 occhi avevano 1 o 2 punti, 4 occhi avevano 3 o 4 punti, e 23 occhi avevano 5 a 9 punti in tutte le scansioni. Cupola e blebs piatte, e di iniezione volumi sono stati crollati dal spessore retinico totale non era significativamente differente per pre e post-iniezioni, anche se una tendenza generale verso assottigliamento della retina è stato osservato per entrambi (Tabella 2). Un&#39;ulteriore analisi ha mostrato piccolo ma statisticamente significativo assottigliamento del 6,5% ± 1,9 complessiva (pre = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3.4, p = 0,001) (Tabella 3). Per determinare dove si è verificato l&#39;assottigliamento della retina, un sottoinsieme di 10 occhi che conteneva misure di spessore per tutti i 9 punti della griglia è stato analizzato. Simile all&#39;analisi per tutti gli occhi, lasottoinsieme di occhi anche mostrato piccolo ma significativo assottigliamento della retina complessiva (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2.4, p = 0,02). Nessun assottigliamento della retina è stata osservata nei siti distale al sito di iniezione (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1.7, p = 11). Assottigliamento della retina è stata osservata nel sito di distacco retinico massimo (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2.1, p = 0,04), il sito di iniezione senza danni (13.8 ± 6.0, pre = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2.8, p = 0,03), sedi di iniezione ad incarcerazione retina quando una piccola regione della retina è tirato attraverso la sclera al momento della revoca ago (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8.9, p = 0.001) e di iniezione siti con cicatrici (26,5% ± 1.6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5.1, p = 0,007). In totale, incarcerazioni si è verificato in 14 su 31 iniezioni, 3 dei quali hanno provocato la formazione di cicatrici della coroide con la perdita di circa la metà degli strati retinici esterni (Figura 3E). In ogni caso, tuttavia, questi erano effetti altamente localizzati. Full-campo elettroretinografia è stata eseguita prima dell&#39;iniezione e ripetuto 4 settimane dopo l&#39;iniezione con i cambiamenti relativi valutati singolarmente per ciascun occhio per valutare alterazioni funzionali (Tabella 1). Solo adattati al buio e sono state registrate le risposte asta-mediata. Funzioni di risposta di intensità sono stati dotati di equazioni di Michaelis-Menten per derivare Vmax per entrambi i fotorecettori (a -waves) e la retina centrale (B -waves). Le risposte non sono state colpite da forme vescichetta e sono stati quindi crollati (Tabella 4). C&#39;era un piccolo ma statisticamente significativo decremento Vmax suun -waves (F (1, 28) = 7.1, p = 0,013), ma non b -waves (F (1, 28) = 4.0, p = 0,055) dopo l&#39;iniezione (Tabella 4). Forme d&#39;onda rappresentative per pre e post-iniezione di 0,3 ml, 0,5 ml e 1,0 ml sono mostrati (Figura 4). C&#39;era un effetto di volume di iniezione sia a - aeb -waves (F (2, 28) = 6.2, p = 0,006 e F (2, 28) = 8.8, p = 0,001, rispettivamente). Infine, modellazione 3D è stato utilizzato per visualizzare la struttura di entrambe le vesciche a cupola e piatte. Un esempio di una bozza cupola (Figura 5A) mostra un distacco piena di liquido cupola contenuta all&#39;interno dell&#39;area di scansione. Esempi da blebs piatte (Figura 5B, C) mostrano zone poco profonde piene di liquido che si estendono oltre la regione della scansione. Quando si verifica detenzione retinica, un piccolo foro nella ricostruzione è visto (Figura 5C). confini artificiali sono mostrati ai margini di una t scansioneo consentire la ricostruzione (Figura 5C). Calcolo dei volumi vescichetta da queste iniezioni di esempio ha indicato che un minimo di 0,15 ml e 0,01 ml è stato preso di mira con successo nello spazio sottoretinico per 0,3 microlitri iniezioni conseguente blebs a cupola e piatte, rispettivamente. Il volume calcolato iniettato probabile sottostima il volume effettivo a causa della risoluzione delle immagini e ricostruzione, il riassorbimento di liquidi durante la procedura come accade in iniezioni sottoretiniche umani, e per blebs piane o cupola particolare, se l&#39;intero distaccamento non è stato rappresentato nelle scansioni OCT. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54808/54808table1.jpg" /> Tabella 1. effetti funzionali e strutturali di sottoretinico iniezioni ad occhio. Metriche dei singoli occhi e dei loro risultati da iniezioni sottoretiniche. Le risposte della retina alla luce (retina centrale b -waves e fotorecettore un -waves) e spessore della retina misure (membrana di Bruch per strato delle fibre nervose) sono date. Note: un tipo BT = Bleb, Flat (F) o cupola (D) b #GP = numero di punti della griglia misurata * Occhi utilizzati per la ricostruzione del volume di iniezione. ** Solo 1 punto della griglia a disposizione per la misurazione al cicatrice. # Occhi con la formazione di cicatrici. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo </td><td> cupola Bleb </td><td> Bleb piatto </td><td rowspan="2"></td><td> 0,3 ml </td><td> 0,5 ml </td><td> 1,0 ml </td></tr><tr><td> (micron) </td><td> (micron) </td><td> (micron) </td><td> (micron) </td><td> (micron) </td></tr><tr><td> Pre-iniezione </td&gt; <td> 194 ± 2 </td><td> 197 ± 3 </td><td></td><td> 195 ± 1 </td><td> 197 ± 1 </td><td> 197 ± 3 </td></tr><tr><td> Post-iniezione </td><td> 176 ± 8 </td><td> 188 ± 3 </td><td></td><td> 180 ± 6 </td><td> 184 ± 5 </td><td> 192 ± 5 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Effetto della sottoretinico iniezioni sul totale della retina spessore. Analisi di forma vescichetta e volume di iniezione dello spessore della retina. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="4"> Spessore (micron) </td></tr><tr><td> Luogo </td><td> n (occhi) </td><td> Pre </td><td> 4 settimane </td><td> Δ </td><td> Δ% </td&gt; </tr><tr><td> Retina (tutti i punti concordanti) </td><td> 31 </td><td> 196 ± 1 </td><td> 183 ± 4 </td><td> -13 ± 4 </td><td> -6.5 ± 1.9 </td></tr><tr><td> Retina con tutti i 9 punti della griglia * </td><td> 10 </td><td> 199 ± 1 </td><td> 179 ± 8 </td><td> -20 ± 7 </td><td> -10.3 ± 3.5 </td></tr><tr><td> Distale a iniezione * </td><td> 10 </td><td> 199 ± 2 </td><td> 185 ± 8 </td><td> -14 ± 7 </td><td> -7.2 ± 4.0 </td></tr><tr><td> Maximal distacco * </td><td> 10 </td><td> 201 ± 2 </td><td> 179 ± 10 </td><td> -22 ± 9 </td><td> -11.2 ± 5.0 </td></tr><tr><td> Iniezione senza danni * </td><td> 4 </td><td> 201 ± 1 </td><td> 173 ± 10 </td><td> -28 ± 12 </td><td> -13.8 ± 6.0 </td></tr><tr><td> Incarcerazione a iniezione * </td><td> 3 </td><td> 199 ± 1 </td><td> 171 ± 3 </td><td> -28 ± 2</td><td> -14.1 ± 1.0 </td></tr><tr><td> Cicatrice a iniezione * </td><td> 3 </td><td> 201 ± 3 </td><td> 147 ± 10 </td><td> -53 ± 10 </td><td> -26.5 ± 1.6 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Effetto di danni sulla struttura della retina. Analisi di sito-dipendente assottigliamento della retina. Note: * Analisi a partire da 10 topi con i dati provenienti da tutti i 9 punti della griglia. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Vmax (mV) </td><td> A cupola (n = 12) </td><td> Flat (n = 6) </td><td> 0,3 ml (n = 18) </td><td> 0,5 microlitri (n = 8) </td><td> 1,0 ml (n = 5) </td></tr><tr><td> a -waves </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Pre-iniezione </td><td> -338 ± 13 </td><td> -351 ± 13 </td><td> -347 ± 9 </td><td> -334 ± 16 </td><td> -425 ± 15 </td></tr><tr><td> Post-iniezione </td><td> -311 ± 8 </td><td> -321 ± 16 </td><td> -318 ± 11 </td><td> -318 ± 18 </td><td> -355 ± 29 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B -waves </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pre-iniezione </td><td> 604 ± 30 </td><td> 578 ± 11 </td><td> 595 ± 20 </td><td> 542 ± 26 </td><td> 708 ± 21 </td></tr><tr><td> Post-iniezione </td><td> 537 ± 35 </td><td> 551 ± 15 </td><td> 542 ± 24 </td><td> 538 ± 31 </td><td> 612 ± 45 </td></tr></tbody></table> entro-page = &quot;1&quot;&gt; T in grado 4. Effetti di sottoretinico iniezioni su scotopica Rod-mediata una - e B -waves. Analisi di forma vescichetta e volume di iniezione sulle risposte della retina alla luce (retina centrale B -waves e fotorecettori a -waves). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54808/54808fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di sottoretinico iniezione. A schematica dall&#39;alto di un occhio mouse nella presa mostra l&#39;approccio iniezioni tradizionali sottoretiniche, utilizzando un transcorneal (freccia a) o transcleral (freccia b) al sito di iniezione nei pressi della pars plana. Questo metodo utilizza un approccio transcleral vicino al polo posteriore (freccia C), ottenuta ruotando l&#39;occhio nasale per esporre il polo posteriore.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54808/54808fig2.jpg" /> Figura 2. Registrazione di immagini OCT consente di individuare siti retina per l&#39;analisi di spessore. AC, volto immagine ottobre di topo 1ÖS in orientamento originale en. A) Immagine di retina pre-iniezione con griglia di registrazione fuso. B) L&#39;immagine della retina 10 min dopo l&#39;iniezione. Una griglia 9-punto è stato posizionato con il punto centrale nel sito di massima distacco di retina. sito di iniezione è visibile (freccia). C) L&#39;immagine della retina 4 settimane dopo l&#39;iniezione con griglia di registrazione fuso. DE, immagini di topo 9OS. D) volto ottobre immagine di retina 4 settimane dopo l&#39;iniezione che mostra estendere di distacco sottoretinico En. E)Sovrapposizione di fondo (verde) e en face immagini OCT di retina 10 min dopo l&#39;iniezione. Barra di scala = 100 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54808/54808fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54808/54808fig3.jpg" /> Figura 3. sottoretinico Iniezioni causa provvisoria della retina Distaccamenti con il minimo della retina diradamento. Rappresentante OCT B-scansioni al sito di massimo distacco della retina sono mostrati per la pre-iniezione, 10 min dopo l&#39;iniezione e 4 settimane dopo l&#39;iniezione. A) La formazione e la risoluzione di una bozza piatta da una iniezione di 0,3 ml. B) La formazione e la risoluzione di una bozza a cupola da una iniezione di 0,5 ml. C) la formazione e la risoluzione di una bozza a cupola da una iniezione di 1,0 ml. D) Esempio di grave chocicatrici roidal e assottigliamento della retina al sito di iniezione. Barra di scala = 100 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54808/54808fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54808/54808fig4.jpg" /> Figura 4. retine Conservare normale di funzionamento dopo Bleb risoluzione. Le forme d&#39;onda per le risposte asta-mediata scotopica sono mostrati per la pre-iniezione (linea nera) e 4 settimane post-iniezione (linea rossa tratteggiata) per A) 0.3 ml, B) 0.5 ml e C) iniezioni di 1,0 microlitri a 9 intensità di illuminazione che variano da 4.37 x 10 -6 a 0,51 cd / m 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54808/54808fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5. ricostruzione 3D di vesciche. A) Software-generated ricostruzioni 3D di un rappresentante) a cupola e B, C) blebs piatti da iniezioni di 0,3 microlitri. Nervature è un artefatto di software di ricostruzione. confini artificiali sono stati collocati in C di consentire la ricostruzione. Barra di scala = 150 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54808/54808fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Views.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

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Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

Nuovo Apparato e metodo per il rinforzo della droga

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

Ricerca

Neuroscienze

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

Un metodo di nodose Ganglia iniezione in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condizioni che influiscono spazio sociale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Un nuovo approccio che elimina la gestione per lo studio Aggressione e l&#39;effetto &quot;Loser&quot; in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...