We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

בעלי חיים: סוג Wild עכברים C57Bl / 6J bred באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס (UCLA). כל בעלי החיים היו בין 11 - בן 17 שבועות, וכלל זכר עכברות. כל העכברים היו שוכן קבוצה, שמור מחזור אור / חושך 12:12 עם כרצונך מזון ומים. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות של UCLA והאגודה לחקר חזון הצהרת עיניים לשימוש של בעלי חי עיניים ו Vision Research. הערה: כל התרופות והסוכנים להזרקה הן ארצות הברית Pharmacopeia (USP) ציון. 1. הכנת כירורגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 100 מ&quot;ג / קילו קטמין ו xylazine 8 מ&quot;ג / קילו תערובת מלוחה. נהל הרדמה עד לעומק כך העכבר אין קמצוץ בוהן או רפלקסים מגע קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.0 מעלות צלזיוס עם כרית מים במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתרחב תלמידים עם ד עין phenylephrine 2.5%ROPs לקצץ שפם כדי להקל להדמיה. שפם לספק קלט חושי משמעותי העכבר, ולכן, זיף זמירה צריך להסיר רק את החלק כי גישה חוסמת ברורה לעין, ולא בבסיס השערה. מניסיוננו, עכברים להראות התאוששות רגילה לאחר הליך זה. החל עין methylcellulose טיפות למניעת יובש ולמזער קטרקט חולף מושרה הרדמת 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירים לפני ניתוח (כלומר, בבטאדין ואתנול או חרוזים חמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן והעמסה מדוללת (0.01% באמצעות מי מלח 0.9%) בסביבת סטרילית (כלומר, ארון בטיחות ביולוגי) אם להדמיה תבוצע (ראה סעיף 3 להלן). </li></ol> 2. הזרקת הכנת האתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין מזרק (למשל, 5 μl מזרק) עם נפח ההזרקה המתאים (למשל, 0.3 כדי 1.0 מיקרוליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר כך העין פונה כלפי מעלה נראה בבירור dissecting מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קמצוץ הלחמית הזמני עם מלקחיים קנס היטה. לעשות חתך היקפי של כ 90 מעלות באמצעות מספרי Vannas מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.3 עם הקפסולה של שבבסיס שֶׁגֶם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות את רקמת החיבור שמסביב עם מלקחיים קנס היטה תוך סיבוב הגלובוס nasally. לפעול הזריקה כ 0.5 מ&quot;מ הזמני אל עצב הראייה. השתמש בזהירות רבה כדי למנוע שיבוש סינוס רטרו מסלולית. </li></ol> הזרקת 3. Sclerotomy ו subretinal הערה: מומלץ כי הזרקת והעמסת 0.01% ב 0.9% מלוחים לשמש כדי לסייע עם להדמיה תוך לימוד הליך זה. החלוקה הטופוגרפית של והעמסה אפשר לתעד בצורה יעילה עם הדמיה הפונדוס (ראה סעיף 4 להלן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך scleral קטן במקום הזרקה ידי גירוד עיינית בעדינות עם להב עיני 22.5 מעלות. שו חתך זהLD להיות גדול מספיק רק כדי לאפשר את קצה המחט לעבור דרך בלובן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט מהשופעת 33 G (זוויתי 5 -. 10 ° לתוך sclerotomy עם שפוע פונה ובמקביל זוויתי לרשתית להזריק נפח רצוי (למשל, 0.3 ל 1.0 מיקרוליטר של 0.01% והעמיסו למטרות למידה). הערה: לשמור על סטריליות של המזרק על ידי ניקוי יסודי עם שטיפות רצופות של ממס מתאים DI מים לפני כל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחץ על המתג לאט (מעל ~ 3 שניות) מבלי להזיז את המחט עם הפעלת לחץ. הערה: כאשר המחט נמצאת במרחב subretinal, התנגדות קלה תורגש בעוד מדכא את הבוכנה. לא יהיה התנגדות מינימאלית אם מחט מפוצצת הרשתית, עמידות גבוהה אם המחט אינה חודרת בלובן העין או רשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו כמה שניות לפני הוצאת המחט כדי למזער backflow. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העין עם בופר סטרילי ולהבטיח את h העיןכמו לסובב בחזרה למצב הרגיל שלו. </li></ol> הערכה 4. של הפרדות רשתית על ידי אוקטובר ו הפונדוס הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הדמיה אוקטובר מיד לאחר ההזרקה כדי להעריך את איכות הזריקה בשלב המתאים מצביע לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך מבנה הרשתית. הערה: דוגמאות לשימוש של אוקטובר במחקרים דומים תוארו בעבר 7,14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם וליישר את התמונה אוקטובר למקד באתר ההזרקה. הזריקה צריכה להיות קו אמצע ו -0.5 מ&quot;מ זמני אל ראש עצב הראייה. חזור לפי הצורך אם ההתנתקות היא מחוץ למסגרת או לא מרוכז בצורה אופטימלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו היפרדות רשתית לצבוע באזור ההזרקה עם הדמיה הפונדוס en פנים 7,14. הערה: אם מערכת הדמית אוקטובר אינה זמינה, הזרקה של כמות קטנה של והעמסה עם וקטור לאימון תאפשר להדמיה עם כל מצלמת הפונדוס שמבצעת angio והעמיסgraphy באמצעות אותו אורכי גל עירור וחסימת מסננים. באזורי נקודות של קרינת Hyper יוצגו מתחת בכלי הדם ואת כלי הדם יהיו גבולות חדים וברורים ככל ששטחי subretinal הוא ממוקדים בצורה נכונה. הקצה של הבועה מן הזריקה יהיה מוגדר על ידי מעבר פיגמנטציית-יתר פלואורסצנטי הצבועה. מכשירים אחדים לספק יכולת זו העכבר; המכשור משמש כאן מתואר במקומות אחרים 14. </li></ol> טיפול 5. לאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעייל עבה של קרם עיניים אנטיביוטי משולש אל פני השטח של הקרנית של העין המוזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח עכברים בכלובים בודדים נקיים להתאוששות. אין לשלב עכברים שעברו ניתוח עד שהם החלימו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג נשימה וטמפרטורה במהלך התאוששות הרדמה. צג חיות עד שהם יכולים לשמור על שכיבה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניטור שלאחר הניתוח מתאים נוסףוטיפול, כולל הזרקה תת-עורית של carprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לניהול כאב לאחר ניתוח. </li></ol> 6. הערכה של תפקוד רשתית ידי Electroretinography (ERG) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מראש הזרקת ניתוח ERG ובזמנים המתאימים לאחר ההזרקה לפי הצורך להעריך תפקוד הרשתית. אם נעשתה הזריקה לחלל subretinal, הפרדות הרשתית צריכות לפתור תוך 72 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקות ERG תקן לאבחון תפקוד רשתית לפני ואחרי ההזרקה כפי שתואר לעיל 14,15. </li></ol></li></ol> שחזור 3D 7. וכימות נפח בועה הערה: Oct סריקות עם ניגודיות גבוהה המקיפה את הניתוק כולו בתוך המסגרת של נוף הם אופטימליות לשימוש. ImageJ / פיג&#39;י 17,18 ו Imaris שימשו, אך ניתן להשתמש בתוכנה אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הסריקה-ב של עניין, לייבא ImageJ / פיג&#39;י היבול (תמונה&gt; Crop) את החלק של SC אוקטוברלהיות המודל באמצעות כלי הבחירה המלבני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוונון ניגודיות (תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות) להתוות שום גבולות חסרים על ידי חיבור שני חלקים עם קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר קו ישר עם כלי שורה (המשמרת מחזיקה) החובק את הרשתית לשכבת קולטי האור. מדוד (לנתח&gt; מדוד) אורך הקו כדי להשיג גודל של ניתוק מירבי צעד 7.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבוא קצוץ מסגרות תוכנת 3D-השחזור (ראה טבלה של חומרים) באמצעות &quot;RGB לאפור&quot; תוסף ו MATLAB מהדר זמן ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל voxel (תחת מאפייני תמונה) באמצעות פרמטרים כיול מן הסריקה אוקטובר (x, y, z). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוסף &quot;RGB כדי גריי&quot; (תחת מאפייני תמונה), עם שקלול שווה כל ערוץ, כדי ליצור ערוץ רביעי. מחק ערוצים האדום-ירוק-כחול המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הערוץ האפור באמצעות שינוי הניגודיות. Image Store. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;להוסיףEW שטח &quot;כפתור על כרטיסיית 3D-View, ולהתחיל בתהליך צעד 4 מודרך יוצר את פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפירוט פני השטח (שלב 1 מתוך 4). הערה: מניסיוננו 8.0 כדי 12.0 היה הטווח היעיל ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל כדור המרבי (תחת בחירת רקע) כדי מעט פחות מגודל הניתוק המרבי שנמדד 7.1.2. צור את השטח ולבטל היפוך ערוץ אפור (שלב 2 מתוך 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את סף לערך המקסימאלי כך את פני השטח של הרווחים השליליים מחוץ הרשתית ושל היחידה אינו באים במגע (שלב 3 מתוך 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הסוג מסנן למספר ווקסלים ולבודד את החלל השלילי באתר הניתוק לפי גודל. לסיים את פני השטח (שלב 4 מתוך 4). הערה: היקף שטח הניתוק ממוקם מתחת נפח בלשונית הסטטיסטיקה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration.">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li><li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials:+Safety+and+Efficacy.">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).</li><li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo.">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li><li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3,+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia.">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina.">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).</li><li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li><li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration.">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li><li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+(LCA)+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function.">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li><li>Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics.">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li><li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion.">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

זריקות subretinal הן את שיטת בחירה עבור המשלוח של וקטורים ויראליים גזע טיפול תאים שמקורם מניפולציה קולטני אור ואת הרשתית הוא במחקר בסיסי טיפול מרפאתי. בחולים, זריקות subretinal נעשים בדרך כלל עם sclerotomy הקדמי ליד פלאנה Pars, vitrectomy הליבה האחורי וחדירה של הרשתית על ידי מחט עם להדמיה ישירה. כמו במרבית ההליכים vitrectomy, זה נפוץ היווצרות קטרקט להתרחש בטרם עת, אלא אם העין היא כבר pseudophakic. בעכברים, זריקות subretinal נעשות באופן מסורתי עם קדמי sclerotomy לרשתית, שיטה קשורה לעתים קרובות עם שני nicking של העדשה, אשר תופסת את רוב החלל האחורי של העין, וחדירת Transretinal שיכול להוביל מלכוד זגוגי ומלא היפרדות רשתית. באמצעות טכניקה בגישה אחורית בעכברים מפחיתים השלכות לא רצויות אלה ומשפרת את היכולת לפרש EFfects של המניפולציה המיועדת. היתרונות של טכניקת ההזרקה subretinal דיווחו כאן כוללות השפעות מבניות מינימלי או פונקציונלי נזק סביבתי מופחת (למשל, ערפול מן nicking העדשה, דולף זגוגי או דלקת) המאפשר הערכה קלה של תוצאות הניסוי וזמני התאוששות מהירה יותר. טכניקה זו דורשת מניפולציה גדולה יותר של העין להגיע בקוטב האחורי אך ניתן להשלים כ 10 - 15 דקות לכל עין עם שיעור הצלחה גבוה ככל אין עיניים נדחו מניתוח. ברוב המכריע של זריקות, מבנה רשתית רגיל ותפקוד נצפו בתוך 4 שבועות. לשם השוואה, מחקרים קודמים דיווחו 5 - 8 שבועות להתאוששות של מבנה ותפקוד או לא לדווח על זמן ההחלמה 6,7. כתוצאה מכך, ניסויים יכולים להסתיים בתוך פחות זמן עם פחות בעלי חיים. סיבוכים של טכניקת הזרקת subretinal זו כללו היווצרות צלקת ואובדןקולטני אור ב כ 10% של זריקות, עם רק שלושה מקרים של גירעונות מבניים ותפקודיים משמעותיים. הרשתית שמרה תגובות נורמליות אור עם רק הצלקת הגדולה יורדת פונקציה עד 80% של תגובת קולטי אור ו -77% של תגובה ברשתית פנימית לעומת הזרקה מראש. מאסרי רשתית עשויים להצטמצם עם שימוש מחט חדשה לכל הזרקה, אם כי זה לא הוערך במחקר הנוכחי. לחלופין, הם יכולים לנבוע מלחץ שלילי ובכך להיות בלתי נמנע. מאסרים נפוצים מאוד זריקות subretinal האדם, לעומת זאת, בגלל גודלו של העין, מאסרים מייצגים פחות נזק לרשתית הכולל. כתוצאה מכך, אם סוכן טיפולי היה מוזרק, 90% מעיניים מוזרקות יהיו זמינים עבור הערכה של ההשפעות של ההתערבות. ההשתנות במדידות עובי רשתית לפני ואחרי הזרקת subretinal משקפות את השחזור של tהוא אוקטובר מכשיר על עכברים, הדיוק של יישור במקומות רשתית פני תמונות, ושינויים רשתית מ הזרקת מי מלח פיזיולוגיים עם צבע פלואורסצנטי במינון נמוך. מדידות אלה יכולים לשמש כדי להנחות חוקרים בחישובי כוח עבור מספר העיניים ובמקומות רשתית צורך לזהות שינויים תקפים סטטיסט כתוצאת זריקות subretinal אם סוכן טיפולי קיים. ב -10 מקרים בהם היו 9 נקודות הרשת בכל סריקות רשתית, ההשתנות של עובי הרשתית מחוץ הזריקה (5 - 8 נקודות לכל עין) היה 7.2% ± 4.0%, גם בהיעדר של רעילים או חומר תרופתי או ניוון רשתית תורשתי. השתנות כזו היא שיקול לקביעת קריטריונים להשוואה של תוצאות קליניות באמצעות מודלי עכבר לטיפולי subretinal, ו מצביעה בבירור על בקרות מתאימות כוללות הזרקת subretinal של רכב ולא עין uninjected 3. לבסוף, אנו ממליצים investigators לעשות סריקות אוקטובר רבות של אזורי רשתית מרובים לפני ההזרקה כדי לשפר את הכיסוי של הזריקה בכל הסריקות. יעילות טיפולית תושג סבירה כאשר סוכני ניסיוני מועברים מרחב גדול יותר של הרשתית. במקרים אלה, כמויות גדולות יותר הם אידיאליים אבל ייתכן שלא יהיה צורך כמו 0.3 זריקות μl לעתים קרובות נוצר blebs שטוח שכיסה שטח פנים רשתית גדול. צורת הבועה לא הייתה ניתן לשליטה, למרות כרכי הזרקה גדולים היוצר blebs כיפה יותר. עד 1 μl ניתן להזריק ללא תוצאות שליליות, אולם, יתכן כי blebs כיפה הופך מורחב כך נגיעות הרשתית שומר על בקפסולה האחורית של העדשה, במיוחד בעכברים צעירים עם כרכים זגוגי נמוכים. למרות הנפח נמסר מן המזרק, ההיקף בפועל ממוקד למרחב subretinal מחושב להיות פחות. זה עשוי לשקף נפח שאינו הנרכש סריקות אוקטובר, במיוחד עבור כיפה או fblebs lat, או חפץ של הסריקה אוקטובר ושחזור שלאחר מכן, אבל עשוי לשקף אובדן נפח מ backflow על משיכת המחט. לסיכום, באמצעות גישה אחורית זריקות subretinal יש פחות סיבוכים והתאוששות משופרת, וכתוצאה מכך שיעור הצלחה גבוה של מיקוד וקצב נמוך של דרה. טכניקה זו היא אידיאלית עבור ויראלי, תרופתיות, ומניפולציות הסלולר של רשתית מכרסמת.

זריקות subretinal הן האמצעי העיקרי של אספקת סוכנים הסלולר ויראלי אל הרשתית של עכברים ללמוד והשפיע על קולטני אור ואת 1,2 שבבסיס הרשתית. רוב פרוטוקולי הזרקת subretinal בעכברים להשתמש transcorneal או קדמי זריקת transcleral לקו המשווה (איור 1). גישה זו יכולה לגרום נזק סביבתי הגלום הכולל שסחב ו ערפול כתוצאה של העדשה, שיבוש של שלמות, חדירה הזגוגית של הרשתית הנוירו ואיריס, דימום ברשתית, היפרדות רשתית משמעותי ובצקת subretinal קיימא 3-9. מניפולציות ניסוייות חייבות להתגבר על תופעות אלה על מנת להעריך את ההשפעות של התערבויות טיפוליות 3,7,10,11. מחקר זה מספק תיאור מפורט ואימות של שיטת הזרקה אחורית transcleral כי תמנע סיבוכים אלה, ממזער טראומה בעל שיעור הצלחה גבוה של מיקוד המשנהשטח הרשתית. זריקות מיקוד במרחב subretinal בעכברים הן בדרך כלל מאוד קשות לביצוע רוב החוקרים נתקלים בתדירות גבוהה של ניסיונות כושלים שבו הווקטור מועבר על מיקום לא נכון או שיש פגיעה ברשתית משמעותית, למשל היפרדות רשתית מלאה 6. מספר העיניים מחוץ ניתוח עקב סיבוכי הזרקת בדרך כלל אינו מדווח במחקרי עכבר, אבל הניסיון שלנו והן בדיון עם חוקרים אחרים, מספר זריקות נכשלו יכולה להיות גבוהים ככל 50% ולגוון תלוי הניסיון יכולות של החוקר שמבצע את הזריקות. ההצלחה של ההזרקה נבחנת בדרך כלל על ידי הדמיה הפונדוס ישירה ו / או טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 7,9. שיטה לשלוט בקלות עם שיעורי הצלחה גבוהים עבור זריקות subretinal בעכברים יכול לזרז ניסויים ולהפחית את העלות של מחקרים פרה של טרהatments למחלות רשתית כי הם הגורמים העיקריים לעיוורון בארצות הברית. האחורי, טכניקת הזרקת subretinal transcleral המתוארת כאן היא עיבוד פרוטוקולים קליניים פרה-קליניים 9,12. הערכות האבחנתיות פולשנית שבוצעו עכברים שהוזרקו להדגים ניזק עדין מאוד מקומי וחסרי עדשה בטוחה נוספת ברשתית ופגיעת רשתית. יתר על כן, עם קצת אימון יחסית, נסיין יכול להשיג את התוצאות הללו עם שיעור הצלחה גבוה (80 - 90% או יותר), ובכך להפחית את העלויות הכרוכות מחקרים כאלה. הליך זה יכול לשמש כדי לספק הסלולר, ויראלי, או התערבויות טיפוליות תרופתיות כדי קולטני אור ו / או רשתית במחקרים פרה-קליניים להעריך התערבויות ניסיוני בקלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hamilton Model 62 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87942</td>
			<td>Syringe x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle 33G, 1.0&#34;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Needles x 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Curved Scissors</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>1347</td>
			<td>5mm Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td>
			<td>Wilson Ophthalmic Corp.</td>
			<td>91204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaject&#160;</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-609-02</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>NDC 61311-482-10</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-50</td>
			<td>0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-235-35</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Circulating Pump</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP-500 T/Pump&#160;</td>
			<td>P/N 07999-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-OCT</td>
			<td>Bioptigen</td>
			<td>R-Series</td>
			<td>Commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fundus Camera</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories</td>
			<td>MICRON III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Type 3</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>5385-3SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine</td>
			<td>Paragon BioTeck</td>
			<td>NDC 42702-102-15</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS8</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Version 8.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>V1.8.0_77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypromellose&#160;2.5%</td>
			<td>Goniovisc</td>
			<td>AX0401</td>
			<td>Methylcellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Drops (Rinse)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Saline Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>P/N 20520</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

זריקות subretinal שימשו בהצלחה בשני בני אדם ומכרסמים לספק התערבויות טיפוליות של חלבונים, סוכנים ויראלי, ותאי לתא interphotoreceptor / subretinal כי יש חשיפה ישירה קולטני האור ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). זריקות subretinal של plasminogen וכן ניסויים פרה-קליניים וקליניים האחרונים הוכיחו בטיחות ו / או יעילות של מתן וקטורים ויראליים ותאי גזע ליחידים עם מחלת רשתית מתקדמת. מודלים עכבר של מחלת רשתית, במיוחד dystrophies רשתית תורשתי, חיוניים לבדיקת לטיפולים אלה. הליך ההזרקה הנפוץ ביותר במכרסמים הוא להשתמש transcorneal הקטן או חתכי transcleral עם גישה קדמית לרשתית. עם גישה זו, מחט הזריקה חודר הרשתית הנוירו לשבש את הרשתית הבסיסית ועל החדרת יכול בקלות ניק העדשה, גרימת עכירות העדשה וירידת ערך Imagi פולשניתng. גישה למרחב subretinal באמצעות transcleral, גישה אחורית תמנע בעיות אלה: המחט חוצה את בלובן העין כ 0.5 מ&quot;מ מן עצב הראייה, ללא חדירת רשתית ונמנעה לשבש את הזגוגית. נזק סביבתי מוגבל כי הקשורים מוקדי sclerotomy ואת ההשפעות של חולף, היפרדות רשתית הצפק. הפשטות של השיטה ממזער פגיעה עינית, מבטיחה שחיבור רשתית מהיר והתאוששות, ויש לו שיעור כישלון נמוך. הניזק המינימאלי רשתית הרשתית מאפשר הערכה ברורה של יעילויות התרופות ותופעות ישירות של הסוכנים הטיפוליים עצמם. כתב יד זה מתאר טכניקת ההזרקה subretinal הרומן, שניתן להשתמש בהם כדי למקד וקטורים ויראליים, סוכני תרופתי, תאי גזע או גזע מושרים (iPS) תאים למרחב subretinal בעכברים עם יעילות גבוהה, נזק מינימלי, והתאוששות מהירה.

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach at JoVE.com

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Views.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Video: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

שיטה של ​​הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

גישה חדשה שמבטל טיפול לחקר תוקפנות והשפעת &quot;לוזר&quot; ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

שיטה של הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

גישה חדשה שמבטל טיפול לחקר תוקפנות והשפעת "לוזר" ב

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

רומן Apparatus ואת שיטת חיזוק והתרופות

שיטה של ​​הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש

הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

גישה חדשה שמבטל טיפול לחקר תוקפנות והשפעת "לוזר" ב

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

אינדוקציה של שינוי תאי לטומנאנואל באמצעות הזרקה בתוך החלק האחר

שיטה של הזרקת Nodose הגרעינים בSprague-Dawley עכברוש