We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

الحيوانات: النوع البري C57BL / 6J الفئران ولدت في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA). وكانت جميع الحيوانات بين 11-17 أسابيع من العمر، وشملت الذكور وإناث الفئران. وكانت جميع الفئران يضم مجموعة وصيانتها في ضوء دورة 0:12 / مظلمة مع بالمال وبالشهرة أيضا الغذاء والماء الإعلانية. أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من جامعة كاليفورنيا وجمعية البحوث في الرؤية وبيان العيون لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. ملاحظة: جميع الأدوية وكلاء عن طريق الحقن هي الولايات المتحدة أدوية (USP) درجة. 1. إعداد الجراحي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 8 ملغ / كغ زيلازين في مزيج ملحي. إدارة التخدير إلى عمق بحيث الماوس لا يوجد لديه قرصة أخمص القدمين أو ردود الفعل لمس القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على درجة حرارة الجسم في 37.0 درجة مئوية مع وسادة المياه المنتشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمدد التلاميذ مع 2.5٪ فينيليفرين العين دنظام الحماية من الانقلاب وتقليم شعيرات لتسهيل التصور. توفر شعيرات المدخلات الحسية كبير على الماوس، وبالتالي، الطولي وتقليم يجب إزالة الجزء الوحيد الذي يمنع وصول واضحا للعين، وليس على قاعدة الطولي. في تجربتنا، تظهر الفئران الانتعاش الطبيعي بعد هذا الإجراء. تطبيق العين ميثيل قطرات لمنع جفاف والتقليل من مخدر الناجم عن إعتام عدسة العين عابرة 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات قبل الجراحة (أي betadine والايثانول او الخرز الساخنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد فلوريسئين المخفف (0.01٪ باستخدام المياه المالحة 0.9٪) في بيئة معقمة (أي والسلامة البيولوجية مجلس الوزراء) إذا كان سيتم تنفيذ التصور (انظر القسم 3 أدناه). </li></ol> 2. حقن إعداد الموقع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حقنة (على سبيل المثال، 5 ميكرولتر حقنة) مع حجم مناسب حقن (على سبيل المثال، 0،3-1،0 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس بحيث يواجه العين صعودا واضحة للعيان في ديssecting المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة بلطف الملتحمة الزمنية مع ملقط الرؤوس الجميلة. جعل شق كفافي ما يقرب من 90 درجة باستخدام منحني مقص Vannas. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.3 مع كبسولة لسان الكامنة و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بتر الأنسجة الضامة المحيطة يميل ملقط غرامة في حين تناوب العالم أنفيا. العمل من أجل الحقن حوالي 0.5 ملم الزمني في العصب البصري. استخدام عناية كبيرة لتجنب تعطيل الجيوب الرجعية المدارية. </li></ol> 3. بضع الصلبة وتحت الشبكية حقن ملاحظة: من المستحسن أن حقن 0.01٪ فلوريسئين في 0.9٪ المالحة أن تستخدم للمساعدة في التصور حين تعلم هذا الإجراء. توزيع الطبوغرافية من فلوريسئين يمكن أن تكون موثقة بشكل فعال مع التصوير قاع (انظر القسم 4 أدناه). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق الصلبة صغيرة في موقع الحقن بواسطة خدش بلطف فنجان العين بشفرة العيون 22.5 درجة. هذا الشق شوLD يكون فقط كبيرة بما يكفي للسماح للرأس الإبرة بالمرور الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مشطوف 33 إبرة G (الزاوية 5 - 10 درجة في بضع الصلبة مع شطبة تواجه وبالتوازي الزاوية لشبكية العين حقن حجم المطلوب (على سبيل المثال، 0،3-1،0 ميكرولتر من 0.01٪ فلوريسئين لأغراض التعلم). ملاحظة: الحفاظ على عقم حقنة عن طريق تنظيف شامل مع يغسل المتعاقبة من مذيب مناسب والمياه DI قبل كل حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضغط على المكبس ببطء (أكثر من ~ 3 ثانية) دون تحريك الإبرة وحتى مع الضغط. ملاحظة: عندما إبرة في الفضاء تحت الشبكية، سيشعر مقاومة طفيفة في حين تضغط على المكبس. لن يكون هناك لأدنى مقاومة إذا كانت إبرة يثقب شبكية العين، ومقاومة عالية إذا لم إبرة تخترق الصلبة أو RPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر عدة ثوان قبل سحب الإبرة لتقليل ارتجاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العين مع مخزنة المالحة عقيمة وضمان ح العينكما استدارة الظهر إلى وضعها الطبيعي. </li></ol> 4. تقييم الشبكية مفرزة من أكتوبر وقاع العين التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء أكتوبر التصوير مباشرة بعد الحقن لتقييم نوعية الحقن وفي الوقت المناسب يشير بعد الحقن حسب الحاجة لتقييم بنية شبكية العين. ملاحظة: أمثلة على استخدام أكتوبر في دراسات مماثلة وقد وصفت سابقا 7،14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط ومحاذاة الصورة أكتوبر لاستهداف موقع الحقن. وينبغي أن يكون في موقع الحقن خط الوسط و 0.5 ملم الزمني لرأس العصب البصري. كرر حسب الحاجة إذا كانت مفرزة خارج الإطار أو لا تركز على النحو الأمثل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور انفصال الشبكية وصبغ منطقة الحقن مع حمام وجه قاع التصوير 7،14. ملاحظة: إذا كان نظام التصوير أكتوبر غير متوفر، حقن كمية صغيرة من فلوريسئين مع ناقلا لممارسة سيسمح التصور مع أي كاميرا قاع العين التي تنفذ فلوريسئين القسطرةgraphy باستخدام نفس موجات الإثارة ومنع المرشحات. ستظهر مناطق محددة من فرط مضان تحت الأوعية الدموية وسوف الأوعية الدموية لديها حدود حادة ومتميزة إذا استهدفت الفضاء تحت الشبكية بشكل صحيح. سيتم ترسيم حافة فقاعة من الحقن التي كتبها الانتقال من فرط لمضان أوالسكتة. توفر العديد من الصكوك هذا القدرة على الماوس. ووصف الأجهزة المستخدمة هنا في أي مكان آخر (14). </li></ol> العناية 5. بعد العملية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق معطف سميك من الثلاثي كريم العيون المضاد الحيوي على سطح القرنية بالعين حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران في أقفاص الانفرادي نظيفة لتحقيق الانتعاش. لا تجمع بين الفئران التي خضعت لعملية جراحية حتى يتم استردادها بالكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة التنفس ودرجة الحرارة أثناء الانتعاش التخدير. مراقبة الحيوانات حتى يتمكنوا من الحفاظ على الاستلقاء القصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مراقبة إضافية مناسبة بعد الجراحةوالعلاج، بما في ذلك حقن تحت الجلد من كاربروفين (5 ملغ / كلغ) لإدارة الألم بعد الجراحة. </li></ol> 6. تقييم وظيفة الشبكية بواسطة تخطيط كهربية الشبكية (أرج) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل أرج قبل الحقن وفي الأوقات المناسبة بعد الحقن حسب الحاجة لتقييم وظيفة الشبكية. إذا تم إجراء حقن في الفضاء تحت الشبكية، ينبغي للانفصال الشبكية حل في غضون 72 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تقنيات أرج القياسية لتقييم وظيفة شبكية العين قبل وبعد الحقن كما هو موضح سابقا 14،15. </li></ol></li></ol> 7. 3D التعمير والكمي البثرة حجم ملاحظة: أكتوبر بالاشعة مع التباين العالي تشمل انفصال كامل في إطار الرأي والأمثل للاستخدام. يماغيج / فيجي 17،18 وImaris استخدمت، ولكن البرامج الأخرى يمكن استخدامها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير ب-فحص الفائدة، الاستيراد ليماغيج / فيجي والمحاصيل (صورة&gt; المحاصيل) جزء من الشوري أكتوبروإلى أن تكون على غرار باستخدام أداة التحديد المستطيلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التباين (صورة&gt; ضبط&gt; السطوع / التباين) وترسيم أي حدود المفقودة من خلال ربط قسمين مع خط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم خط مستقيم مع (التحول القابضة) أداة الخط الذي يمتد RPE إلى طبقة مبصرة. قياس (تحليل&gt; قياس) على طول الخط للحصول على حجم أقصى مفرزة للخطوة 7.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد الإطارات إلى برنامج 3D إعادة الإعمار اقتصاص (انظر الجدول المواد) باستخدام &quot;RGB إلى الرمادي&quot; المساعد وMATLAB مترجم وقت التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حجم فوكسل (ضمن خصائص صورة) باستخدام المعلمات معايرة من الفحص أكتوبر (س، ص، ض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ &quot;RGB إلى رمادي&quot; المساعد (تحت خصائص الصورة)، على قدم المساواة مع الترجيح لكل قناة، لإنشاء قناة الرابعة. حذف القنوات الأحمر والأخضر والأزرق الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس قناة الرمادي باستخدام تغيير التباين. متجر الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;إضافةسطح مصريات &quot;الموجود في 3D-علامة التبويب عرض، وبدء الموجهة 4 خطوة عملية لخلق السطح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين التفاصيل مستوى سطح (الخطوة 1 من 4). ملاحظة: في تجربتنا 8،0-12،0 كان نطاق الأكثر فعالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الحد الأقصى لحجم المجال (تحت اختيار الخلفية) إلى أقل قليلا من الحد الأقصى لحجم مفرزة تقاس 7.1.2. إنشاء السطح والتراجع عن الانقلاب قناة الرمادي (الخطوة 2 من 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين العتبة إلى القيمة القصوى حتى سطح المساحات السلبية خارج شبكية العين وانفصال لا تأتي في اتصال (الخطوة 3 من 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين نوع فلتر لعدد من voxels وعزل الفضاء السلبي في الموقع مفرزة من حيث الحجم. الانتهاء من السطح (الخطوة 4 من 4). ملاحظة: يوجد حجم سطح مفرزة تحت وحدة التخزين في علامة التبويب الإحصائيات. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration.">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li><li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials:+Safety+and+Efficacy.">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).</li><li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo.">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li><li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3,+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia.">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina.">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).</li><li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li><li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration.">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li><li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+(LCA)+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function.">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li><li>Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics.">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li><li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion.">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

الحقن تحت الشبكية هي الأسلوب المفضل لتسليم ناقلات فيروسية ووقف العلاج المستمدة من خلية لمعالجة خلايا مستقبلة للضوء وRPE في كل من البحوث الأساسية والعلاج السريري. في المرضى، وعادة ما يتم الحقن تحت الشبكية مع بضع الصلبة الأمامي في مسطح بارس، واستئصال الزجاجية الخلفية الأساسية والاختراق من شبكية العين عن طريق الإبرة مع رؤية مباشرة. كما هو الحال مع معظم الإجراءات استئصال الزجاجية، ومن الشائع لتشكيل إعتام عدسة العين تحدث قبل الأوان ما لم تكن العين هي بالفعل pseudophakic. في الفئران، وتتم الحقن تحت الشبكية عادة مع الجزء الأمامي بضع الصلبة لشبكية العين، وهي طريقة كثيرا ما يرتبط مع كل من الخدش للعدسة، والتي تحتل معظم التجويف الخلفي من العين، واختراق transretinal التي يمكن أن تؤدي إلى انحباس الزجاجي وكامل مفارز شبكية العين. باستخدام تقنية نهج الخلفي في الفئران يقلل هذه النتائج غير المرغوب فيها ويحسن القدرة على تفسير EFتأثيرات سلبية للتلاعب مقصود. وتشمل فوائد تقنية الحقن تحت الشبكية ذكرت هنا تأثيرات هيكلية أو وظيفية الحد الأدنى والحد من الأضرار الجانبية (على سبيل المثال، يعكر من الخدش عدسة، تسريب الزجاجي أو التهاب) التي تسمح بتقييم أسهل من النتائج التجريبية وأوقات الانتعاش بشكل أسرع. هذا الأسلوب يتطلب معالجة أكبر من العين للوصول إلى القطب الخلفي ولكن يمكن أن تكتمل في حوالي 10-15 دقيقة في العين مع نسبة نجاح عالية حيث تم رفض أي العينين من التحليل. في الغالبية العظمى من الحقن، وقد لوحظ بنية شبكية العين الطبيعي وظيفة في غضون 4 أسابيع. وعلى سبيل المقارنة، دراسات سابقة تفيد 5-8 أسابيع للتعافي من بنية ووظيفة أو لا تفيد وقت الانتعاش 6،7. ونتيجة لذلك، والتجارب يمكن أن تكتمل في وقت أقل مع عدد أقل من الحيوانات. وتشمل مضاعفات هذه التقنية حقن تحت الشبكية تشكيل ندبة وفقدانخلايا مستقبلة للضوء في ما يقرب من 10٪ من عمليات الحقن، مع ثلاث حالات فقط من العجز الهيكلية والوظيفية الهامة. الإبقاء على شبكية العين الاستجابات الطبيعية للضوء فقط مع أكبر ندبة التناقص وظيفة إلى 80٪ من استجابة مستقبلة للضوء و 77٪ من استجابة شبكية العين الداخلية مقارنة مع ما قبل الحقن. قد يتم تخفيض توقيفات في شبكية العين مع استخدام إبرة جديدة لكل الحقن، على الرغم من أن هذا لم يكن تقييمها في الدراسة الحالية. بدلا من ذلك، فإنها قد تحدث بسبب الضغط السلبي وبالتالي يكون لا مفر منه. توقيفات شائعة جدا في الحقن تحت الشبكية الإنسان، ومع ذلك، ونظرا للحجم الكبير من العين، والسجن فترات تمثل أقل الأضرار التي لحقت الكلية شبكية العين. ونتيجة لذلك، إذا تم حقن عامل علاجي، و 90٪ من العيون حقن ستكون متاحة لتقييم آثار هذا التدخل. التغير في قياسات سمك الشبكية قبل تحت الشبكية وبعد حقن يعكس استنساخ رانه أكتوبر الصك على الفئران، ودقة التوفيق بين المواقع الشبكية عبر الصور، والتغيرات في شبكية العين من حقن محلول ملحي فيزيولوجي مع جرعة منخفضة صبغة فلوريسئين. ويمكن لهذه القياسات تعمل على توجيه المحققين في حسابات السلطة لعدد من العيون والمواقع الشبكية اللازمة للكشف عن تغيرات صحيحة إحصائيا نتيجة للحقن تحت الشبكية أم لا عامل علاجي موجود. في 10 الحالات التي كانت هناك 9 نقاط الشبكة في كل بمسح شبكية العين، وتقلب من سمك الشبكية خارج موقع الحقن (5-8 نقطة في العين) كانت 7.2٪ ± 4.0٪، حتى في حالة عدم وجود سمية أو وكيل العلاجية أو ضمور الشبكية الوراثي. هذا التباين هو النظر لوضع معايير للمقارنة بين النتائج السريرية باستخدام نماذج الماوس للعلاج تحت الشبكية، وتشير بقوة إلى أن الضوابط المناسبة وتشمل حقن تحت الشبكية مركبة بدلا من العين uninjected 3. وأخيرا، فإننا نشجع investigators للقيام العديد من مسح أكتوبر من المناطق الشبكية متعددة قبل الحقن لتحسين التغطية من موقع الحقن في جميع بالاشعة. ومن المرجح أن تتحقق الكفاءة العلاجية عندما يتم تسليم وكلاء التجريبية إلى فسحة أكبر من شبكية العين. في هذه الحالات، كميات أكبر مثالية ولكن قد لا تكون ضرورية الى 0.3 حقن ميكرولتر غالبا ما تتشكل الفقاعات المسطحة التي تغطي مساحة الشبكية الكبيرة. كان شكل فقاعة لا يمكن السيطرة عليها، على الرغم من أن حقن كميات أكبر تنتج الفقاعات أكثر القبة. تصل إلى 1 ميكرولتر يمكن حقنه دون النتائج السلبية، ومع ذلك، فمن الممكن أن الفقاعات القبة تصبح بذلك بمد أن اللمسات شبكية العين ويلتزم الكبسولة الخلفية للعدسة، ولا سيما في الفئران الشباب مع وحدات التخزين زجاجي منخفضة. وعلى الرغم من حجم تسليمها من الحقنة، ويتم احتساب الحجم الفعلي تستهدف الفضاء تحت الشبكية لتكون أقل. قد يعكس هذا حجم لا يحصلون عليها في المسح أكتوبر، ولا سيما بالنسبة للالقبة أو وقد يعكس الفقاعات خطوط الطول، أو قطعة أثرية من الفحص أكتوبر والتعمير اللاحقة، ولكن خسارة حجم من ارتجاع على سحب الإبرة. وخلاصة القول، وذلك باستخدام نهج الخلفي للحقن تحت الشبكية لديها عدد أقل من المضاعفات وتحسين الانتعاش، مما أدى إلى نسبة نجاح عالية من استهداف وانخفاض معدل الاستبعاد. هذه التقنية مثالية للتلاعب الفيروسية، الدوائية، والخلوية في شبكية العين القوارض.

الحقن تحت الشبكية هي الوسيلة الأساسية لتقديم وكلاء الخلوية والفيروسية لشبكية العين من الفئران لدراسة تأثيرها على المستقبلات الضوئية وRPE الكامنة 1،2. معظم البروتوكولات حقن تحت الشبكية في الفئران تستخدم transcorneal أو transcleral موقع الحقن والأمامي من خط الاستواء (الشكل 1). هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى أضرار جانبية الأصيل الذي يشمل الخدش ويعكر الناتج من العدسة، وتعطل سلامة الجسم الزجاجي، والاختراق من الشبكية العصبي الحسي وقزحية العين، نزيف في شبكية العين والمفارز في شبكية العين كبيرة ودائمة وذمة تحت الشبكية 3-9. يجب التلاعب التجريبية التغلب على هذه الآثار من أجل تقييم آثار التدخلات العلاجية 3،7،10،11. وتقدم هذه الدراسة وصفا تفصيليا والتحقق من صحة الخلفي طريقة الحقن transcleral أن يتجنب هذه المضاعفات، يقلل الصدمة ولديها نسبة نجاح عالية من استهداف الفرعيةالفضاء في شبكية العين. حقن استهداف الفضاء تحت الشبكية في الفئران وغالبا ما تكون صعبة للغاية لأداء ومعظم المحققين تواجه ارتفاع وتيرة المحاولات الفاشلة التي يتم تسليم متجه إلى موقع غير صحيح أو هناك أضرار في شبكية العين كبير، على سبيل المثال في انفصال الشبكية كاملة 6. وعادة لا يتم إبلاغ عدد من العيون استبعادها من التحليل بسبب مضاعفات حقن في الدراسات الماوس، ولكن في واقع تجربتنا وفي مناقشة مع باحثين آخرين، وعدد من الحقن فشل يمكن أن تصل إلى 50٪ وتختلف تعتمد على الخبرة و قدرات المحقق الذي يقوم بتنفيذ الحقن. وعادة ما يتم تقييم نجاح الحقن بواسطة التصوير قاع المباشر و / أو البصرية تماسك التصوير المقطعي (أكتوبر) 7،9. طريقة يتقن بسهولة مع معدلات نجاح عالية للحقن تحت الشبكية في الفئران يمكن أن يسرع التجريب وخفض تكلفة الدراسات قبل السريرية من عطرatments لأمراض الشبكية التي هي من الأسباب الرئيسية للعمى في الولايات المتحدة. الخلفي، transcleral تقنية الحقن تحت الشبكية الموصوفة هنا هي التكيف من البروتوكولات السريرية وقبل السريرية 9،12. التقييمات التشخيصية موسع أجريت في حقن الفئران تبين أضرار خفيفة ومحلية للغاية وتفتقر إضافية عدسة ضمانات أو إصابة شبكية العين وRPE. وعلاوة على ذلك، مع القليل من الممارسة نسبيا، يمكن للمجرب تحقيق هذه النتائج مع نسبة نجاح عالية (80-90٪ أو أفضل)، وبالتالي تقليل التكاليف المرتبطة بمثل هذه الدراسات. هذا الإجراء يمكن استخدامها لتقديم التدخلات العلاجية الخلوية، فيروسية، أو الدوائية إلى المستقبلات الضوئية و / أو RPE في الدراسات قبل السريرية وتقييم بسهولة التدخلات التجريبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hamilton Model 62 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87942</td>
			<td>Syringe x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle 33G, 1.0&#34;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Needles x 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Curved Scissors</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>1347</td>
			<td>5mm Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td>
			<td>Wilson Ophthalmic Corp.</td>
			<td>91204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaject&#160;</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-609-02</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>NDC 61311-482-10</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-50</td>
			<td>0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-235-35</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Circulating Pump</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP-500 T/Pump&#160;</td>
			<td>P/N 07999-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-OCT</td>
			<td>Bioptigen</td>
			<td>R-Series</td>
			<td>Commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fundus Camera</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories</td>
			<td>MICRON III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Type 3</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>5385-3SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine</td>
			<td>Paragon BioTeck</td>
			<td>NDC 42702-102-15</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS8</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Version 8.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>V1.8.0_77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypromellose&#160;2.5%</td>
			<td>Goniovisc</td>
			<td>AX0401</td>
			<td>Methylcellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Drops (Rinse)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Saline Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>P/N 20520</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

وقد استخدمت الحقن تحت الشبكية بنجاح في كل من البشر والقوارض لتقديم التدخلات العلاجية من البروتينات، العوامل الفيروسية، والخلايا إلى interphotoreceptor / حجرة تحت الشبكية التي لديها التعرض المباشر للخلايا مستقبلة للضوء والظهارة الصبغية الشبكية (RPE). وقد أظهرت الحقن تحت الشبكية من البلازمينوجين وكذلك التجارب قبل السريرية والسريرية الأخيرة السلامة و / أو فعالية لإيصال النواقل الفيروسية والخلايا الجذعية للأفراد المصابين بأمراض الشبكية المتقدمة. نماذج الماوس من مرض في شبكية العين، وراثي ولا سيما ضمور شبكية العين، ضرورية لاختبار هذه العلاجات. إجراء الحقن الأكثر شيوعا في القوارض هو استخدام transcorneal صغيرة أو شقوق transcleral مع نهج الأمامي لشبكية العين. مع هذا النهج، وإبرة حقن تخترق الشبكية العصبي الحسي تعطيل RPE الكامنة وعلى الإدراج يمكن بسهولة نيك العدسة، مما تسبب عتامة العدسة وانخفاض قيمة imagi موسعنانوغرام. الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية عبر transcleral، نهج الخلفي يتجنب هذه المشاكل: الإبرة تعبر الصلبة حوالي 0.5 ملم من العصب البصري، دون تغلغل في شبكية العين والابتعاد عن تعطيل زجاجي. تقتصر الأضرار الجانبية لتلك المرتبطة بضع الصلبة التنسيق وآثار عابرة، المصلية انفصال الشبكية. بساطة الأسلوب يقلل من إصابة العين، تضمن إعادة المرتكز شبكية العين السريعة والانتعاش، ولديها نسبة الفشل منخفضة. والحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالشبكية وRPE يسمح للتقييم واضح لمدى فعالية والآثار المباشرة للعوامل علاجية أنفسهم. توضح هذه المخطوطة تقنية حقن تحت الشبكية الجديدة التي يمكن استخدامها لاستهداف ناقلات فيروسية، وكلاء الدوائية، والخلايا الجذعية أو خلايا الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) إلى الفضاء تحت الشبكية في الفئران مع فعالية عالية، الحد الأدنى من الضرر، والانتعاش السريع.

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach at JoVE.com

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

بديل والمصادق عليها طريقة حقن للوصول إلى الفضاء تحت الشبكية<i&gt; عبر</i&gt; نهج Transcleral الخلفي

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Views.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Video: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Novel Apparatus and Method for Drug Reinforcement

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction. Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in animal research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. For this study, we used a novel approach to studying drug reinforcement in rats by combining traditional CPP and self-administration methodologies. We assembled an apparatus using two Med Associate operant chambers, sensory stimuli, and a Plexiglas-constructed neutral zone. These modifications allowed our experiments to encompass motivational aspects of drug intake through self-administration and drug-free assessment of drug/cue conditioning strength with the CPP test. In our experiments, rats self-administered cocaine (0.75 mg/kg/inj, i.v.) during either four (e.g., the "short-term") or eight (e.g., the "long-term") alternating-day sessions in an operant environment containing distinctive sensory cues (e.g., olfactory and visual). On the alternate days, in the other (differently-cued) operant environment, saline was available for self-infusion (0.1 ml, i.v.). Twenty-four hours after the last self-administration/cue-pairing session, a CPP test was conducted. Consistent with typical CPP findings, there was a significant preference for the chamber associated with cocaine self-administration. In addition, in animals undergoing the long-term experiment, a significant positive correlation between CPP magnitude and the number of cocaine-reinforced lever responses. In conclusion, this apparatus and approach is time and cost effective, can be used to examine a wide array of topics pertaining to drug abuse, and provides more flexibility in experimental design than CPP or self-administration methods alone.

Operant drug self-administration and conditioned place preference (CPP) procedures are expansively used in research to model various components of drug reinforcement, consumption, and addiction in humans. In this report, we combined traditional CPP and self-administration methods as a novel approach to studying drug reinforcement and addiction in rats.

رواية جهاز وطريقة لتدعيم المخدرات

Animal models of reinforcement have proven to be useful for understanding the neurobiological mechanisms underlying drug addiction.  Operant drug ...

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located in the organs of the abdomen and thorax. The vagus nerve communicates information from stimuli such as heart rate, blood pressure, bronchopulmonary irritation, and gastrointestinal distension to the nucleus of solitary tract of the medulla. The cell bodies of the vagus nerve are located in the nodose and petrosal ganglia, of which the majority are located in the former. The nodose ganglia contain a wealth of receptors for amino acids, monoamines, neuropeptides, and other neurochemicals that can modify afferent vagus nerve activity. Modifying vagal afferents through systemic peripheral drug treatments targeted at the receptors on nodose ganglia has the potential of treating diseases such as sleep apnea, gastroesophageal reflux disease, or chronic cough. The protocol here describes a method of injection neurochemicals directly into the nodose ganglion. Injecting neurochemicals directly into the nodose ganglia allows study of effects solely on cell bodies that modulate afferent nerve activity, and prevents the complication of involving the central nervous system as seen in systemic neurochemical treatment. Using readily available and inexpensive equipment, intranodose ganglia injections are easily done in anesthetized Sprague-Dawley rats.

Afferent vagal signaling transmits important information to central nervous system from receptors located in organs of the abdomen and thorax. The nodose ganglia of vagus nerves contain many types of receptors that modulate vagal activity. This protocol describes a method of local injections of neurochemicals into the nodose ganglia.

وهناك طريقة العقداء العقد حقن في سبراغ داولي الفئران

Afferent signaling via the vagus nerve transmits important general visceral information to the central nervous system from many diverse receptors located ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

الحوفي-النهج تحت الشبكية حقن الفيروسية المتجهات للعلاج الجيني في الفئران الشبكية الظهارة الصبغية

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

الظروف التي تؤثر في الفضاء الاجتماعي<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

بديل بسيط لحقن المجسم لالدماغ ضربة قاضية محددة من ميرنا

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

نهج جديد يقضي على مناولة لدراسة العدوان و &quot;الخاسر&quot; تأثير في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

وثمة نهج بديل لدراسة الأحداث الرئيسية في نيوروديجينيريشن باستخدام شرائح المخ الفئران السابقين فيفو

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. Previously published protocols recommend using straight needles that should be lowered to a maximum of 1-2 mm from the dural surface. The sudden drop in resistance once the dural membrane has been punctured makes it difficult to maintain the needle in a steady position. Our method, instead, employs a needle bent at the tip that can be stabilized against the occipital bone of the skull, thus preventing the syringe from penetrating into the tissue after perforation of the dural membrane. The procedure is straightforward, reproducible, and does not cause long-lasting discomfort in the operated animals. We describe the intracisternal injection strategy in the context of genetic fate mapping of vascular leptomeningeal cells. The same technique can, furthermore, be utilized to address a wide range of research questions, such as probing the role of leptomeninges in neurodevelopment and the spreading of bacterial meningitis, through genetic ablation of genes putatively implicated in these phenomena. Additionally, the procedure can be combined with an automatized infusion system for a constant delivery and used for tracking cerebrospinal fluid movement via injection of fluorescently labelled molecules.

We describe an intracisternal injection that employs a needle bent at the tip that can be stabilized to the skull, thus eliminating the risk of damage to the underlying parenchyma. The approach can be used for genetic fate mapping and manipulations of leptomeningeal cells and for tracking cerebrospinal fluid movement.

تحريض الخلايا اللبتومينينالتي تعديل عن طريق الحقن داخل الجمجمة

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

بديل والمصادق عليها طريقة حقن للوصول إلى الفضاء تحت الشبكية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video