K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

1. raccogliere le uova dalle mosche con genotipi di interesse NOTA: croci ideali sono costituite da 150 mosche vergini e almeno 75 maschi. collezioni di archivio deve essere composto da almeno 200 mosche. <ol><li> Preparare piatti d&#39;uva. <ol><li> Aggiungere 37,5 g di agar a 1,5 L di acqua distillata in un matraccio 4 L. </li><li> Autoclave miscela acqua / agar per 50 min a 121 ° C (250 ° F). </li><li> Mentre l&#39;acqua / miscela agar è autoclave, aggiungere 50 g di saccarosio al succo d&#39;uva da 500 ml e mescolare con un ancoretta su un piatto mescolare fino a quando riscaldato il saccarosio si scioglie. </li><li> Spegnere il fuoco e continuare a mescolare per raffreddare la miscela succo d&#39;uva / saccarosio al di sotto di 70 ° C. Testare la temperatura interna con un termometro alcool. </li><li> Aggiungere 3 g Drosophila agente anti-fungine (ad esempio, Tegosept) per riscaldare il succo d&#39;uva miscela / saccarosio e mescolare per sciogliere. </li><li> Quando l&#39;acqua / miscela agar è fuori dell&#39;autoclave, permettono raffreddare il pallone al tatto agitando occasionalmente. </li><li&gt; Unire miscela acqua / agar e succo d&#39;uva miscela / saccarosio e mescolare fino a ben miscelati. </li><li> Utilizzare una pipetta sierologica aggiungere 8 - 10 ml della miscela dell&#39;uva al coperchio di una piccola piastra di Petri (stile 35 x 10 mm). Lasciare la miscela a corona superiore alla altezza delle pareti del coperchio per formare una forma convessa. </li><li> Lasciare le piastre uva raffreddare per 2 ore a temperatura ambiente e poi conservare in un contenitore ermetico a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare pasta di lievito. <ol><li> Aggiungere 6 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 g vivo lievito secco attivo in una provetta conica da 50 ml e mescolare con una spatola fino liscio. </li><li> Conservare lievito in pasta a 4 ° C. </li></ol></li><li> Aggiungere un piccolo ciuffo (circa 1/8 cucchiaino) di pasta di lievito per mezzo di una piastra di uva. Lisciare eventuali asperità con una spatola. </li><li> Posizionare le piastre di uva in un incubatore fino a quando non hanno raggiunto la temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le mosche di interesse in un piatto di camera di raccolta delle uova e del luogo d&#39;uva with pasta di lievito rivolta verso l&#39;interno sulla parte superiore. Nastro piatto d&#39;uva per la camera di raccolta delle uova per evitare che la piastra di cadere. Assicurati di scrivere importanti genotipo e informazioni aggiornate sulla parte inferiore della piastra di uva. </li><li> Capovolgere la camera di raccolta delle uova per consentire le mosche di deporre le uova sulla piastra di uva. </li><li> Posizionare una casella o coprire la sorveglianza delle camere di raccolta delle uova e metterli in un incubatore a 25 ° C. </li><li> Consentire mosche per deporre le uova per 4 - 6 ore. </li><li> Terminare raccolta prendendo la piastra dell&#39;uva fuori della camera di raccolta uovo e trasferire le mosche indietro nel loro bottiglia di cibo. Utilizzare una spatola per eliminare ogni pasta di lievito in eccesso dalla piastra di uva. piatto d&#39;uva Conservare in una più grande capsula di Petri in un incubatore umidificato a 25 ° C per ~ 24 ore. </li></ol> 2. Trasferimento larve di Experimental alimentari <ol><li> Preparare il cibo sperimentale. NOTA: Questa ricetta cibo è basato sulla Bloomington Stock Center ricetta 18. importanti cambiamentiincludono una maggiore quantità di lievito per ottimizzare il valore nutrizionale degli alimenti, come valutato dal tempi di vagare fase (tra 112-120 ore dopo la raccolta delle uova a 25 ° C). Mentre abbiamo trovato questa ricetta ideale per la salute e lo sviluppo del nostro larve sperimentale, ogni ricetta cibo è dato di calibrazione accettabile con controlli positivi e negativi, esempi dei quali sono elencati al punto 3.10. <ol><li> Misura 1.600 ml di acqua distillata. </li><li> Mescolare 134 g di farina di mais, 10,6 g Drosophila Agar Tipo II, e una parte dell&#39;acqua (~ 500 ml) in 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato. </li><li> Mescolare 70 g di lievito secco attivo vivo, 18,4 g di farina di soia, 84,8 g estratto di malto, e una parte dell&#39;acqua (~ 500 ml) in un altro 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato. </li><li> Agitare ogni bicchiere e versare in un pallone da 4 L. Usare l&#39;acqua residua per sciacquare i bicchieri e aggiungere nel pallone. </li><li> Misurare 140 ml di sciroppo di mais luce e aggiungere al pallone, mescolare agitando. &lt;/ Li&gt; <li> Autoclave per 50 minuti a 121 ° C (250 ° F) in ambiente liquido. </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave, versare il cibo in un 4 L bicchiere e lasciare raffreddare. Aiutare il processo di raffreddamento miscelando con un miscelatore della mano motorizzato. </li><li> Una volta che il pallone si è raffreddato abbastanza da toccare, aggiungere 8,8 ml di acido propionico e 16,8 ml di soluzione di Drosophila agente / etanolo anti-fungine. Mescolare bene. (Fare soluzione agente Drosophila anti-fungine con l&#39;aggiunta di 380 g Drosophila agente anti-fungine a 1 L 200 etanolo prova e mescolare in un piatto caldo fino sciolto, facendo attenzione che la soluzione non sia superiore a 70 ° C.) </li><li> Versare il cibo in fiale fino a quando il cibo è di circa 1 pollice profondo e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 2-3 ore. Collegare flaconi e conservare in un incubatore a 25 ° C. Utilizzare entro una settimana. </li></ol></li><li> Tuffo una spatola più volte nello strato superiore del flaconcino di cibo per segnare esso. Questo aiuterà le larve di scavare e mangimi. </li><li> 22 - 24 ore dopo la raccolta delle uova haended, utilizzare un pennello piccolo per raccogliere 50 primo stadio (L1) larve della stessa dimensione approssimativa. Posizionare larve nel cibo sperimentale. Pulire il pennello su un laboratorio wipe e garantire che non vi siano restante larve sul pennello prima di proseguire per un altro genotipo. </li><li> Mettere flacone di larve in un incubatore a 25 ° C e permettere di sviluppare. </li></ol> 3. Determinare i livelli di grassi nelle larve <ol><li> Preparare soluzioni. <ol><li> Preparare 1 L 10x PBS magazzino. <ol><li> Aggiungere 80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, e 2,4 g KH 2 PO 4-800 ml di acqua in un bicchiere 2 L contenente un ancoretta. Mescolare con nessun calore fino a quando tutti i sali sono incorporati. Portare il pH a 7,4. Aumentare il volume di 1 litro con acqua. </li></ol></li><li> Preparare 2 L 1x PBS. Aggiungere 200 ml di soluzione di PBS 10x magazzino a 1.800 ml di acqua. </li><li> Utilizzare questo stock di PBS 1x per rendere il 20% w / v di saccarosio. </li></ol></li><li> Rimuovere il flacone di larve dallaincubatore una volta ci sono 20 - 40 larve di vagare fino ai lati del flacone (generalmente il quinto giorno dopo collezioni di uova). Registrare la data e l&#39;ora del test, nonché il numero di vagare larve. </li><li> Preparare la soluzione sperimentale aggiungendo 11,5 ml di PBS e 9 ml 20% di saccarosio in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Aggiungere 20% di saccarosio al flaconcino finché è 0.5 - 1 pollice dalla parte superiore della fiala. </li><li> Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente lo strato superiore di cibo per le larve liberi che sono ancora scavando nel cibo. Tutti larve salirà alla superficie della soluzione di saccarosio. </li><li> Utilizzare pinze per trasferire delicatamente le larve nella concentrazione di saccarosio iniziale dal punto 3.3. </li><li> Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente le larve in questa soluzione. </li><li> Chiudere la provetta conica e capovolgere più volte per mescolare accuratamente la soluzione. </li><li> Togliere il tubo conico e agitare per creare un vortice gentile. </li><li> Lasciare che le larve di stabilirsi, o galleggianti alla parte superiore della soluzione o sinking al fondo. Attendere 2-5 minuti per le larve di stabilirsi. NOTA: Se ci sono ancora larve, che non sono sicuramente variabile o affondare, scegliere una linea da utilizzare come punto di taglio per etichettare le larve sia come un galleggiante o una zavorra. Applicare questo stesso criterio a tutti i genotipi. Usiamo l&#39;angolo al fondo della provetta conica come nostro confine. Adp o sir2 17 larve mutante può essere utilizzato come controllo positivo e LSD2 19 mutanti possono essere utilizzati come controllo negativo per la calibrazione del test. </li><li> Registrare il numero di larve flottante e la concentrazione specifica testato. </li><li> Aggiungere 1 ml di 20% di saccarosio alla soluzione sperimentale per aumentarne la densità. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,10. Registrare il numero di larve galleggianti e questa nuova concentrazione. </li><li> Continuare passi 3.12 e 3.13 fino ad almeno il 95% delle larve sono galleggianti. </li><li> Utilizzare pinze per raccogliere tutte le larve in un piatto dissezione pieno di PBS. </li><li> observe larve al microscopio e nota se ci sono piccole larve, pupe pre-, pupe, o qualsiasi altre differenze tra genotipi. NOTA: Idealmente, tutte le larve deve apparire omogenea e allo stesso stadio di sviluppo. Abbiamo osservato soltanto misurazioni del grasso consistenti in queste condizioni. </li><li> Registrare il numero totale di larve. </li><li> Utilizzando pinze, trasferire 10 larve di un laboratorio di pulire a secco. Etichettare una provetta e posizionare 10 larve nel tubo. </li><li> Flash congelare le larve in azoto liquido. Conservare il tubo a -20 ° C. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Ci sono una moltitudine di tecniche che sono state sviluppate per misurare i livelli di lipidi 8 - 10. Tuttavia, ciascuno di questi metodi viene fornito con alcuni importanti inconvenienti che sono indirizzati mediante il saggio galleggiamento basato descritto sopra. In primo luogo, questo test è estremamente rapido. Test di un gradiente di piena concentrazione non richiede più di 30 - 60 min. Questo è un enorme miglioramento sulla maggior parte delle tecniche attualmente in uso. Ad esempio, lipidi quantificazione da MS prende 7-9 ore per isolare i lipidi e altre diverse ore per analizzarli. Questo è un forte deterrente durante l&#39;esecuzione di uno schermo su un gran numero di animali. Misurando un fenotipo galleggiamento rapido, si può mettere a fuoco rapidamente sui genotipi che hanno il fenotipo di interesse. In secondo luogo, il saggio di densità richiede soltanto reagenti comuni quali sali (per PBS) e saccarosio. Questo rende molto più semplice ed economico per lo screening di un gran numero di larve o rapidamente testare genotipo interessante. Infine, questo mi protocollos non invasiva e le larve sono ancora vivi alla fine. Questo permette ulteriori sperimentazioni da effettuare sugli animali, come specifica quantificazione dei lipidi o trascrizione o analisi delle proteine. Inoltre, le larve recuperato può essere consentito di continuare a crescere fino all&#39;età adulta. Un ulteriore vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri viene aumentata sensibilità alle piccole variazioni di livelli di grasso in una popolazione. Eseguendo un intero gradiente di concentrazione su una popolazione di 50 larve, piccoli spostamenti nei livelli di grasso popolazione saranno identificati da un cambiamento nelle concentrazioni intermedie, sebbene la concentrazione alla quale le larve iniziano flottante e sono totalmente galleggiare non può essere diverso rispetto ai controlli . Questo piccolo spostamento nella popolazione non può sempre essere identificato da altri metodi di quantificazione grasso in quanto richiedono un grande gruppo di larve da analizzare. Il dosaggio densità invece interroga individui all&#39;interno della popolazione e può quindi identificare these piccole modifiche o cambiamenti nella distribuzione complessiva della popolazione. Poiché questa tecnica si basa sulla densità della soluzione per produrre risultati affidabili, è estremamente importante che il PBS e soluzioni di saccarosio sono fatti in modo coerente. Abbiamo scoperto che diverse ricette PBS producono differenze di densità della soluzione, portando a risultati diversi. Usiamo la ricetta sopra descritta per ottenere risultati coerenti. Inoltre, rendendo il saccarosio 20% dallo stesso lotto di 1x PBS è importante in quanto determina la stessa densità della soluzione di sfondo. Se le due soluzioni sono state fatte separatamente, leggere variazioni di densità PBS potrebbero portare variabile densità aggiuntiva oltre aggiunta di saccarosio al flaconcino conica sperimentale. Infine, l&#39;evaporazione può essere un problema, perché nel tempo le soluzioni diventeranno più concentrato con l&#39;evaporazione dell&#39;acqua. È quindi importante cap bottiglie ermeticamente e per ristabilire la soluzione ogni settimana in modo che sperimentalesoluzioni rimangono costanti. Tra i punti di cui sopra, ci sono diversi passaggi critici che se alterato, potrebbe portare a risultati non accurati da parte del test di galleggiabilità. In primo luogo, è importante che le larve trasferito nel flaconcino cibo sperimentale sia la stessa età. Trasferimento di larve che variano in dimensioni comporterà larve a diversi stadi di sviluppo al momento viene eseguito il test di galleggiabilità. Questo protocollo è stato sviluppato per determinare i cambiamenti nei livelli di grasso nel vagare L3 larve e non funzionerà in modo accurato per L3 precoce o pre-pupe o successiva. All&#39;inizio del terzo instar larve hanno la tendenza a galleggiare indipendentemente dai livelli di grasso, mentre pre-pupe e lavandino pupe anche alle più alte concentrazioni utilizzate. Per questo motivo, l&#39;età delle larve L1 trasferito è critica. Analogamente, il punto in cui viene preso il flaconcino per eseguire il test di galleggiabilità è importante. Per le stesse ragioni di temporizzazione di sviluppo di cui sopra, i flaconcini devono essere prese solo quando 20 -40 larve vagano per garantire misurazioni della densità accurate. Inoltre, il numero di L1 trasferito può influenzare risultati pure. Le ampie fiale utilizzate in questo protocollo consentono 50 larve di mangiare senza concorrenza durante lo sviluppo. Un numero molto maggiore di larve trasferito a questo si tradurrà in competizione per il cibo e può influenzare la quantità di grasso immagazzinato indipendentemente dal genotipo. Ci possono essere genotipi con tali livelli estremamente elevati di grasso che la maggior parte o tutte le larve galleggerà alla prima concentrazione. In questo caso, il protocollo può essere modificato diminuendo la concentrazione della soluzione di partenza per ottenere uno spettro completo della distribuzione della densità di popolazione. D&#39;altra parte, un genotipo specifico può essere così magra che nessuna larva galleggia in saccarosio iniziale. In questo caso, i passi iniziali possono essere omessi e una concentrazione iniziale più elevata usati. Questo test è molto flessibile e può essere modificato per adattarsi meglio un&#39;ampia gamma di livelli di grasso.Si consiglia l&#39;uso di controlli, come adeguati animali wild type (controllata per il background genetico), controlli positivi (mutanti grassi stabilito, come ADP o Sir2 17), e controlli negativi (mutanti magre pubblicati, come LSD2 19). L&#39;uso appropriato di questo protocollo permetterà futuro proiezione di collezioni per determinare nuovi regolatori del metabolismo e l&#39;obesità predisposizione. Inoltre, questo protocollo fornisce un modo semplice per i ricercatori in ogni campo per verificare se la loro manipolazione genetica di interesse provoca un cambiamento nei livelli di grassi, senza la necessità di protocolli complesse o costose attrezzature. Questo protocollo contribuirà a chiarire la complessa relazione tra la genetica e l&#39;obesità.

Drosophila melanogaster è stato utilizzato per più di un secolo nello studio della genetica e di altre questioni biologiche fondamentali. Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che la Drosophila è un potente strumento per lo studio di molte malattie umane. Il 70 - 80% di geni associati a malattie umane hanno una mosca ortologo identificata 1 - 4, Drosophila fornisce un sistema semplificato ma traducibile in cui studiare le malattie complesse. Il metabolismo, in particolare, ha beneficiato di tale studio. Non solo la genetica del metabolismo ben conservati tra le mosche e gli esseri umani, ma gli organi competenti e tipi di cellule sono molto simili a 2,5. Ad esempio, il grasso corporeo dei negozi mosca entrambi Triacilgliceroli (TAG) e di glicogeno, funzioni analoghe a quelle svolte nel fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo bianco 6. Utilizzando Drosophila come modello per l&#39;obesità umana ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di lipidiil metabolismo e la genetica di obesità 7. Lo stadio larvale di sviluppo è particolarmente utile per studiare la segregazione di nutrienti stoccaggio o utilizzo come è dedicata all&#39;alimentazione e l&#39;immagazzinamento di energia da utilizzare durante pupariation. Attualmente, ci sono molti metodi quantitativi diversi della determinazione dei livelli di stoccaggio dei grassi in Drosophila. Il metodo più diffuso è il saggio colorimetrico accoppiato (CCA) 8,9. CCA è stato sviluppato per determinare i livelli TAG nel siero umano e opera sulla premessa che glicerolo liberato dalla spina dorsale di trigliceridi subirà diverse reazioni, che si traduce in una reazione redox-coupled generando un prodotto colorato. Assorbanza di specifiche lunghezze d&#39;onda di luce viene poi misurata per determinare la quantità iniziale di glicerolo presente. Tuttavia, glicerolo può anche essere liberato da mono- e diacylglycerides oltre al TAG e quindi non può essere una misura accurata di storato grasso corporeo 9. Inoltre, l&#39;occhio del pigmento di mosche adulte schiacciati può interferire con alcune letture di assorbanza e complicare i risultati 9,10. Pertanto, CCA deve essere accompagnato e convalidato cromatografia su strato sottile (TLC), che permette la separazione delle maggior parte delle famiglie di lipidi che può essere quantificata mediante densitometria 10,11. Tuttavia, alcune classi di lipidi, come steroli non possono essere analizzati e devono essere quantificati un modo diverso 12. La spettrometria di massa (MS) è un modo preciso per quantificare tutte le classi di grandi lipidi cellulari 12,13. Tuttavia, le procedure di estrazione dei lipidi necessari per analizzare da MS sono sia in termini di tempo (più presa quasi un giorno intero) e costosa. Qui vi presentiamo un metodo alternativo per determinare rapidamente ed economicamente livelli di grasso organismal nelle larve L3 di Drosophila melanogaster. Il metodo presentato sotto sfrutta la differenza di densità tra tessuto adiposo e tessuto magro. fa mammiferit tessuto ha una densità di circa 0,9 g / ml 14 mentre il muscolo scheletrico come una densità di 1,06 g / ml 15. Questa differenza significa che gli animali con elevate riserve di grasso avranno densità inferiore rispetto agli animali con i negozi più bassi di grasso, che permetteranno loro di galleggiare meglio in una soluzione della densità fisso. Questa proprietà consente estremamente rapido lo screening di un gran numero di animali pur essendo sia poco costoso e non invasivo. Analisi di galleggiabilità-based è stato utilizzato sia per confermare i fenotipi di alterare regolatori noti di livelli di grasso, nonché di individuare nuovi regolatori genetici e neurologici di obesità 16,17.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch&#039;s Original 100% Grape Juice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Baker&#039;s yeast</td><td>Fleichmann&#039;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Corn Meal</td><td>Quaker</td><td></td><td>Enriched degerminated</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour</td><td>ADM Specialty Ingredients</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Light Corn Syrup</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate anhydrous</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm petri plate</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

La figura 1 rappresenta un esempio di come il dosaggio galleggiamento-based può rilevare sia depositi grassi superiori e inferiori in larve geneticamente manipolati. La figura 1A mostra che eccitazione o silenziamento di un certo sottoinsieme di neuroni (E347) nel cervello larvale induce grassi inferiori e superiori negozi rispettivamente. Lo stesso controllo background genetico è stato utilizzato in entrambi i casi. Figura 1B fornisce un esempio di come questo fenotipo ottenuto mediante il saggio densità viene confermata mediante estrazione dei lipidi neutri e quantificazione dal GCMS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54744/54744fig1.jpg" /> Figura 1. funzione neuronale in specifiche regioni del cervello larvale è necessario e sufficiente per il regolamento di grasso corporeo. Attività neuronale nella linea E347-GAL4 indicato è stato messo a tacere da sovraespressione di Shi DN, Oppure attivata tramite sovraespressione di NB, come indicato nei pannelli, ed effetti sul grasso corporeo sono stati valutati. (A) Percentuale di larve galleggianti all&#39;equilibrio in soluzioni di densità diverse. Cinquanta larve sono stati esaminati per campione biologico, n = 7 - 9 repliche biologiche per genotipo grasso (B) corpo Percent (lipidi neutri totali comprese triacilgliceroli e fosfolipidi divisa per il peso corporeo) come misurato dalla GCMS 17,20 (n = 8).. Le linee blu o barre rappresentano GAL4-only (senza UAS) gli animali hanno attraversato a w 1118 per controllare gli effetti del background genetico. valori di P rappresentano i risultati di test t a due code. **** P &lt;0.0001, *** P = 0,0001 al 0.001 ** P = 0,001 al 0,01, * P = 0.01 0.05. Le barre di errore mostrano SEM. Questa cifra è stata modificata 16. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54744/54744fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.

Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

8.6K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico. 

Video: A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Ricerca

Genetica

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Comportamento

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Neuroscienze

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologia

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Gut Acidification Monitoring Assay: A Technique to Study the Acidification of the Intestinal Lumen in Drosophila using Bromophenol Blue Dye

Source: Abu, F., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63141">Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to monitor gut acidification in Drosophila flies. After the ingestion of food supplemented with a pH indicator dye, the acidification of the intestinal lumen results in a change in the color of the dye. Visual inspection of the digestive tract of the flies to examine the color change provides evidence of acidification.

Saggio di monitoraggio dell'acidificazione intestinale: una tecnica per studiare l'acidificazione del lume intestinale in Drosophila utilizzando il colorante blu di bromofenolo

Source: Abu, F., et al. Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine. J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to monitor ...

Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel

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Capitoli in questo video

Quantificazione della pigmentazione addominale in

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Analisi dell'autofagia indotta dalla fame nel corpo grasso larvale di Drosophila melanogaster

Saggio di monitoraggio dell'acidificazione intestinale: una tecnica per studiare l'acidificazione del lume intestinale in Drosophila utilizzando il colorante blu di bromofenolo