We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato animale istituzionale a Research Foundation dei bambini di Cincinnati. Per questo studio, le cellule staminali ematopoietiche sono state isolate dal midollo osseo di topi C57BL / 6 inbred invecchiato 2 - 4 mesi. Separazione delle cellule usando FACS dopo colorazione di BM con diversi produttori di superficie tra Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 e CD34 è stato utilizzato per la depurazione delle HSC in base a Lin- Sca-1 + Flt3 c-Kit + - strategia di gating - CD34 come protocollo standard descritto prima delle 8. ATTENZIONE: Diverse sostanze chimiche altamente tossiche vengono utilizzati durante questa procedura. Questi sono tossico per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di indossare guanti ed indumenti protettivi. Lavori in cappa mentre si lavora con queste sostanze chimiche. 1. cellule, la fissazione, colorazione e pre-embedding <ol><li> Ordina 10.000 cellule staminali ematopoietiche (utilizzando Lin - Sca-1 <sup&gt; + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategia; LT-HSC popolazione) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 600 microlitri di Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM) con il 10% di siero fetale bovino usando FACS. </li><li> Spin down CSE smistate a 1000 xg per 10 min in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga utilizzando una centrifuga con benne oscillanti. Rimuovere medio aspirando delicatamente e lasciare 200 microlitri di media nei tubi ad ogni passo. In questa fase, il pellet cellulare rimane invisibile nel tubo. </li><li> Fissare le cellule aggiungendo 0,2 ml di soluzione di fissativo 2x a temperatura ambiente (RT) per 1 ora 1,9. <ol><li> Rendere la soluzione fissativa fresca prima dell&#39;uso. Al 1x, la soluzione è composta da 3% paraformaldeide e 2,5% glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato. </li></ol></li><li> Centrifugare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 30 ° C utilizzando una centrifuga con secchi swing-out. </li><li> Lavare le cellule con 600 ml di buffer di 0,1 M cacodilatomediante centrifugazione e lasciare tampone 200 microlitri nel tubo dopo centrifugazione. </li><li> Macchiare le cellule fissate aggiungendo 200 ml di 2 mg / ml soluzione di Evans blu in tampone cacodilato e incubare per 20 minuti a RT. Le cellule saranno di colore blu. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 600 ml di 0,1 M tampone cacodilato mediante centrifugazione e lasciare tampone 200 microlitri nel tubo ogni volta. </li><li> Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 0,5 ml. Centrifugare a 1000 xg per 10 minuti usando una centrifuga da tavolo. Rimuovere tampone delicatamente senza disturbare l&#39;ora visibile minuscola pellet cellulare, e lasciare tampone 50 microlitri nel tubo. </li><li> Aggiungere 200 mg bassa fusione agarosio a 5 ml di 0,1 M tampone cacodilato nel tubo 15 ml di una soluzione di agarosio al 4%. Sciogliere l&#39;agarosio trasferendo il tubo di acqua bollente in una bottiglia di vetro da 100 ml e mantenere tiepida fino all&#39;uso. </li><li> Aggiungere 200 ml di 4% basso punto di fusione agarosio sciolti in 0,1 M cacodylaTE buffer per la sospensione di cellule in provetta da 0,5 ml e subito centrifugare a 1000 xg per 10 min a 30 ° C utilizzando una tabella centrifuga superiore. </li><li> Dopo la conferma che le cellule in pellet al fondo del tubo 0,5 ml in agarosio semi-solido dopo la centrifugazione, trasferire immediatamente il tubo a 4 ° C o ghiaccio per 20 minuti per solidificare l&#39;agarosio. Questo passaggio è molto critica, come un piccolo pellet di cellule visibile in questa fase si ottiene una buona ammasso di cellule al microscopio elettronico. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;agarosio solidificato contenente il pellet dal tubo di plastica Petri 35 millimetri contenente tampone con un 27 ago G 3,10. </li><li> Tagliare le agarosio solidificati contenenti il ​​pellet cellulare in un unico pezzo di circa 1 - 2 mm con un bisturi. Trasferire il pezzo agarosio contenente il pellet di cellule in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Lavare 2 - 3 volte con 600 ml di tampone 0,1 M cacodilato aggiungendo e rimuovendo buffer utilizzando pipetta senza centrifugazione. Utilizzare questo pezzo agarosio contenente il pellet di cellule per il passaggio successivo. In questa fase, il campione può essere conservato a 4 ° C per una notte prima di passare alla fase successiva. </li></ol> 2. Osmification, disidratazione, Embedding <ol><li> Rimuovere il tampone cacodilato dal tubo 1,5 ml con il pellet cellulare contenente agarosio usando una pipetta. Aggiungere 1,0 ml di 1% tetrossido di osmio (OSO 4), soluzione in una cappa aspirante, e incubare per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Lavare tre volte con 600 ml di 0,1 M tampone cacodilato e trasferire il campione di 20 ml di vetro scintillazione fiala con un tappo. </li><li> Elaborare il campione per la disidratazione, l&#39;infiltrazione e l&#39;inclusione in resina (per esempio, LX-112) con modifiche di serie dei seguenti soluzioni in un piatto 6 bene. Spostare il pezzo agarosio cellula-pellet con pinze. <ol><li> Immergere il campione in 25% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione in 50% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione nel 75%etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione in 95% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Immergere il campione in 100% di etanolo a temperatura ambiente per 15 minuti, due volte. </li><li> Immergere il campione in etanolo: resina (3: 1) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Immergere il campione in etanolo: resina (1: 1) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Immergere il campione in etanolo: resina (1: 3) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Immergere il campione in resina pura a temperatura ambiente per 60 minuti, due volte. </li></ol></li><li> Trasferire il campione al fondo della punta piramidale stampo di gomma a forma di indicatori accuratamente pinza e aggiungere resina più pura sulla parte superiore del campione per riempire lo stampo. Incubare il campione a 60 ° C per 72 ore per la polimerizzazione della resina. </li><li> Rimuovere la piramide di resina polimerizzata dagli stampi torcendo lo stampo in gomma. Un piccolo gruppo di cellule nero dovrebbe essere visibile nella piramide di resina polimerizzata, come descritto in precedenza 7. Fissare la piramide di resina polimerizzata sul cilindro di montaggio con cianoacrilato. </li></ol><ol><li> Tagliare il blocco piramide con una lama di rasoio e un coltello di diamante dopo il montaggio del blocco un ultra-microtomo. Effettuare un breve forma trapezoidale larga con la parte superiore e la parte inferiore del blocco paralleli tra loro e con i lati uniformemente angolati. Questa forma della piramide aiuta per sezionamento seriale. </li><li> Inoltre, tagliare il blocco di tutto il pellet cellulare con il coltello diamante e rimuovere le sezioni di plastica attorno al pezzo agarosio pellet cellulare. </li><li> Tagliare 1 sezioni micron utilizzando un ultra-microtomo. Spostare il 1 sezioni micron dalla barca acqua per un vetrino utilizzando uno strumento ciglia e uno strumento ciclo metallo come precedentemente riportato 7. sezioni di trasferimento su scivoli e scivoli di trasferimento al piatto caldo (37 ° C) per l&#39;asciugatura. </li><li> Aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina per le sezioni usando una siringa dotata di 0,22 micron filtro e incubare per 3 min. Sciacquare i vetrini con acqua distillata e let sezioni asciugare. Verificare con un microscopio ottico per identificare la posizione delle celle. </li><li> Tagliare sezioni ultrasottili (70-100 nm) utilizzando un coltello di diamante. Spostare 2 - 3 sezioni su griglie di 200 maglia dalla barca acqua ad una piastra di Petri di vetro utilizzando uno strumento di ciglia. </li><li> Trasferire il piatto di vetro Petri contenenti griglie con sezioni ad una piastra calda a 30 ° C per asciugare sezioni per 30 min. </li><li> Macchiare le griglie con gocce di 1% acetato di uranile a temperatura ambiente per 10 minuti e poi sciacquare in acqua distillata 6 - 8 volte. Colorazione con Reynolds citrato di piombo, a temperatura ambiente per 5 minuti e sciacquare in acqua distillata 6 - 8 volte. Trasferire il piatto di vetro Petri contenente le griglie ad una piastra calda a 37 ° C per asciugare sezioni. </li><li> Analizzare sezioni con un microscopio elettronico, a 80 kV 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo metodo consente l&#39;analisi TEM sul numero di cellule bassi, utilizzando Evans colorazione blu e agarosio l&#39;incorporamento di localizzare un piccolo pellet di cellule durante la disidratazione, embedding resina e sezionamento processi. Importante, mantiene raggruppamenti cellulari insieme e conserva la ultra-struttura cellulare, che è opportuno esaminare più celle per la quantificazione dei dati. In studi TEM, un pellet di cellule contenente milioni di cellule è spesso necessaria per incastro efficiente in una matrice di agarosio / gelatina e per lavaggi, la disidratazione e l&#39;infiltrazione di ottenere dati da numerose cellule. I ricercatori hanno adottato l&#39;immobilizzazione di sospensione cellulare in una resina polimerizzata BSA-bisacrilammide, colorazione di monostrati su un supporto sottile, o cytospins per analisi TEM su numeri bassi cellule / campioni scarse 4-6. Tuttavia, rimane un lavoro noioso per localizzare e tagliare cellule sotto il TEM causa della distribuzione sparsa delle cellule all&#39;interno della matrice epossibili alterazioni della morfologia cellulare, a causa della diffusione e una fenditura tra le cellule durante la preparazione cytospin che spesso richiesti reincorporarla prima sezionamento. Inoltre, il monostrato rimane difficile da localizzare per il sezionamento 11. Così, un pellet di cellule anche da campioni biologici scarse di numero di cellulare basso è molto più facile per l&#39;analisi TEM 1. Questo metodo rappresenta un notevole vantaggio ai precedenti metodi pubblicati 4,5 in termini di analisi ultra-strutturale qualitativa e quantitativa da campioni limitati. Insieme, questo protocollo descrive un modo efficace per localizzare i pellet cellulari per TEM utilizzando Evans blu, che rende il trattamento del campione dal numero di cellule bassi facile per TEM per consentire l&#39;analisi dei dati qualitativi e quantitativi. Tipicamente, la preparazione del campione per TEM richiede un maggior numero di celle di quelli solitamente necessari per la microscopia ottica, a causa dei molteplici passaggi di campione di trasformazione fo TEM e corretto orientamento del blocco di celle per il taglio nella posizione giusta 1,10. E &#39;noto che il post-fissazione osmification fornisce un contrasto migliore in immagini, in particolare quelli di membrane e particelle di glicogeno in un microscopio elettronico 9, e in seguito colorazione supporto con acetato di uranile, una macchia relativamente non specifici per le proteine, e citrato di piombo che macchia membrane, acidi nucleici e glicogeno. Tuttavia, osmification è quasi impossibile da eseguire con campioni biologici scarse in sospensione dopo pre-embedding in BSA-BA causa della elevata probabilità di perdita di campione durante il sezionamento e matrice oscuramento. Così la qualità delle micrografie elettroniche stata compromessa in studi precedenti 4,9. Osmification qui ha portato oscuramento del pellet con minime modificazioni del colore della agarosio. Pertanto, la presente protocollo consente osmification dopo pre-embedding in agarosio in modo da fornire un buon contrasto in TEM imetà. cluster cellulari erano abbastanza facile da analizzare con il microscopio elettronico con questo metodo. La pre-colorazione con blu di Evans ha contribuito a localizzare piccoli pellet cellulari durante la preparazione dei campioni senza influenzare sub-organello dettagli cellulari. Questo metodo offre un approccio alternativo per la preparazione del campione per eseguire correttamente l&#39;analisi TEM dal numero di cellule bassi. In questo metodo, analisi TEM è stata effettivamente eseguita utilizzando cellule di piccole dimensioni (5 - 8 micron). Pertanto, questo approccio può essere facilmente adottata con ancora più basso numero di cellule (~ 1000 cellule) di cellule più grandi come fibroblasti e cellule endoteliali. Anche se Evans blu non ha influenzato sub-organelli cellulari dettagli nel presente studio, l&#39;uso di Evans blu per microscopia elettronica immuno-oro con il numero di cellule bassi non è stato testato. Insieme, un metodo efficiente per la preparazione del campione per eseguire studi TEM da un numero di cellule basso è descritto. studi TEM sono tenuti a rivelare criticainformazioni l sulla morfologia e le ultra-strutture di cellule. Quindi, le informazioni ultra-strutturali manca spesso su varie popolazioni cellulari scarse. Questa alternativa e nuovo approccio per la preparazione del campione sarà utile per effettuare studi TEM da qualsiasi popolazione di cellule rare. Inoltre, questo metodo consente dati qualitativi e quantitativi dall&#39;analisi di gruppi di cellule. Come microscopia elettronica offre dettagli insuperabile della ultra-struttura e l&#39;organizzazione delle cellule, questo metodo sarà molto utile per comprendere molti processi biologici sulla chiave, ma rara, popolazioni cellulari.

Dettagli Ultra-strutturali e sub-organelli delle cellule sono stati rivelati principalmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) studi da tessuti o pellet cellulari 1,2. pezzi solidi di tessuti possono essere facilmente utilizzati per studi di microscopia elettronica. Tuttavia, TEM analizza 1,3 su cellule in sospensione rimangono una sfida e rendono necessario il numero di cellule alte, vale a dire, milioni di cellule. A causa di questo, analisi ultra-strutturali delle popolazioni cellulari rare in sospensione, ad esempio, cellule staminali ematopoietiche (CSE), non sono facilmente valutati. Molteplici tentativi di analisi TEM da campioni scarse utilizzando cytospin o monostrato approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal limitato numero di celle. Pertanto, il requisito di un elevato numero di cellule limita l&#39;uso di questo potente strumento per comprendere i dettagli ultrastrutturali subcellulari di popolazioni di cellule rare. Una limitazione fondamentale per studi TEM con un numero limitato di cellules in sospensione è la localizzazione delle cellule per la lavorazione e quindi, studi TEM da cellule limitati con particolare piccole dimensioni rimangono impegnativo. Diversi approcci alternativi sono stati adottati per contrastare questa limitazione: la BSA / bisacrylamide (BSA-BA) polimerizzazione mediata di sospensione cellulare, la colorazione delle cellule con un colorante per renderli visibili su un supporto sottile pellicola tra cui lamelle, e TEM analizza dalle preparazioni cytospin 4-6. Tuttavia, il successo molto limitato è stato raggiunto, come molto poche cellule sono stati trovati in sezioni dopo ultra-sezionamento. La sfida principale di identificare cellule sparse persiste perché il monostrato cellulare rimane per lo più invisibile nel gel solidificato per il sezionamento. Inoltre, la preparazione cytospin delle cellule può alterare la loro organizzazione cellulare dovuta alla diffusione delle cellule e la fragilità della struttura cellulare. Quindi, questi inconvenienti intrinseci giustificano un nuovo approccio per eseguire studi TEM da popolazioni di cellule rare con piùconsistenza. Per superare questo problema, abbiamo descritto un nuovo metodo di preparazione del campione e alternativa a studi TEM da popolazioni di cellule rare 7. Qui riportiamo un efficiente protocollo di preparazione del campione per eseguire TEM da campioni biologici scarse con risultati qualitativi e quantitativi consistenti. Evans blu colorazione è stata eseguita dopo la fissazione di localizzare un piccolo pellet di cellule dalle cellule basso numero, cioè, staminali emopoietiche del midollo osseo 10.000 e le cellule progenitrici che altrimenti sarebbero rimaste invisibili, e il pellet è stato incorporato in agarosio prima processi di disidratazione e resina embedding. Questo metodo raggruppa insieme le cellule e permette l&#39;analisi efficiente della ultrastruttura e l&#39;organizzazione subcellulare di cellule staminali ematopoietiche (identificato come Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), un 0.2 rara - popolazione di cellule 0,5% nel midollo osseo. Questo pro sperimentaleprotocollo può essere utile per effettuare studi ultra-strutturali e di ottenere risultati quantitativi in ​​molte popolazioni rari ma molto importanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">15713</td>
			<td style="width:440px;">CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td>16350</td>
			<td>CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Cacodyladate buffer&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">12300</td>
			<td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4&#176;C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Evans Blue&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">E-2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting agarose&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:113px;">A-5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Osmium tetraoxide&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">19130</td>
			<td>1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LX-112 Embedding Kits (LADD&#174;)</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21340</td>
			<td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NMA (Nadic methyl anhydride)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21310</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:327px;">DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td>
			<td style="width:216px;">LADD</td>
			<td style="width:113px;">21370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Uranyl acetate (EM Stain I)</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">8072820</td>
			<td>CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)&#160;</td>
			<td style="width:216px;">ATCC</td>
			<td style="width:113px;">30-2005</td>
			<td>composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramid tip mold&#160;</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mounting cylinders</td>
			<td style="width:216px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:113px;">10580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-microtome&#160;</td>
			<td style="width:216px;">(Leica EM UC7)</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">200 mesh grids (nikil)</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">G-200 Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi model H-7650&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Image capture engine software</td>
			<td>AMT-600&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm plastic petri dishes</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&#160;</td>
			<td style="width:216px;">Electron microscopy Sciences</td>
			<td style="width:113px;">72588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials&#160;</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>03-337-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eyelash tool</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Loop tool&#160;</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce i dettagli della organizzazione cellulare e ultrastruttura. Tuttavia, l&#39;analisi TEM di popolazioni di cellule rare, in particolare le cellule in sospensione come le cellule staminali ematopoietiche (CSE), rimane limitata a causa della necessità di un elevato numero di cellule durante la loro preparazione. Ci sono alcuni approcci cytospin o monostrato per analisi TEM da campioni scarse, ma questi approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal numero limitato di cellule. Qui, un approccio alternativo e innovativo per la preparazione del campione negli studi TEM è descritto per le popolazioni di cellule rare che consente l&#39;analisi quantitativa. Un numero relativamente basso di cellule, cioè, 10.000 CSE, è stato utilizzato con successo per l&#39;analisi TEM rispetto ai milioni di cellule tipicamente utilizzati per gli studi TEM. In particolare, Evans blu colorazione è stata eseguita dopo paraformaldeide-glutaraldeide (PFA-GA) la fissazione di visualizzare la minuscola cella pellasciare, che ha facilitato l&#39;incorporamento in agarosio. Grappoli di numerose cellule sono stati osservati nelle sezioni ultrasottili. Le cellule hanno una morfologia ben conservato, ei dettagli ultra-strutturali dei mitocondri Golgi complesse e diverse erano visibili. Questo protocollo efficiente, semplice e riproducibile permette la preparazione del campione da un numero di cellule basso e può essere utilizzato per l&#39;analisi qualitativa e quantitativa TEM su popolazioni di cellule rare da campioni biologici limitate.

Un protocollo efficace e coerente per la preparazione dei campioni per effettuare analisi TEM dal basso numero di cellule è descritto. Post-fissazione colorazione con blu di Evans e il trasferimento di cellule in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga ha aiutato a visualizzare la minuscola pellet cellulare 7. Osmification con tetrossido di osmio in agarosio ha portato ad un rilevamento facile del pellet cellulare buio durante la disidratazione e incorporamento. Sezioni semi-sottili dai blocchi contenenti un piccolo pellet di cellule confermato un grappolo di numerose cellule insieme (Figura 1A e 1B). Sezioni ultrasottili sono stati tagliati dalla zona cellule cluster e analizzati in microscopia elettronica (Figura 1C). La morfologia e ultra-struttura di queste cellule sono state ben conservati (Figura 1D). Il microscopio elettronico della singola cella ha mostrato alti dettagli sul intracellulareultra-strutture (Figura 1E). Inoltre, l&#39;elevato ingrandimento (50,000X) immagini mostrano una struttura ben conservata e l&#39;integrità degli organelli sub-cellulari, come ad esempio i mitocondri (Figura 1F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54724/54724fig1.jpg" /> Figura 1: Analisi dell&#39;immagine nell&#39;ambito della luce e microscopio elettronico. (A) immagine basso ingrandimento di un campo rappresentativo di un toluidina sezione macchiato blu di 1 micron di spessore sotto microscopio ottico. Immagine al microscopio luce che mostra la morfologia intatta di cellule in cluster dopo toluidina colorazione di 1 micron di spessore sezione (B). (C) Un campo panoramica del cluster cellule osservate al microscopio elettronico dopo colorazione con acetato di uranile e citrato di piombo. (D) Un singolo LT-HSC sotto microscopio elettronico. (E) superiore magnifimmagine icazione di HSC mostrando strutture subcellulari. (F) immagine di ingrandimento superiore di mitocondri da HSPC. Barra di scala: A / B, 100 micron; C, 10 micron; D, 2 micron; E / F, 500 nm. &#160; <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54724/54724fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l&#39;analisi TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

Video: An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides vital information on bone turnover or bone formation and resorption. This has tremendous importance in a variety of clinical and research applications. It yields beautiful images1 and allows for techniques such as fluorochrome assessment and histomorphometry2. Fluorochrome analysis is a technique where fluorescent dyes that bind to calcium are injected at a particular time point, which allows for quantification of the amount of mineralisation at that given time. Histomorphometry is a process of bone quantification at the microscopic level. 
Performing undecalcified bone histology is technically challenging, particularly with large size specimens. It requires variations in technique from those used in standard paraffin embedded histology. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them. Specimen preparation, fixation and processing are achieved with a manner similar to other soft tissues, however due to the density and lower permeability of bone considerably longer fixation and processing times are required, often taking several weeks. Embedding is achieved using a supporting medium with similar or equal hardness and density to the bone such as methacrylate- based resins, but unlike paraffin infiltration and embedding, this is an irreversible step. Sectioning can be achieved by grinding which produces a thicker section, which is optimal for studies such as fluorochrome analysis. This is best achieved using a diamond blade on a macrotome. Alternatively, thinner sections can be produced for light microscopy and this is achieved using a sledge microtome with a very sharp blade. The sledge microtome provides the additional strength and stability required for large, hard blocks. Resin embedded sections can be stained with a variety of stains, which are demonstrated.

Undecalcified bone histology provides important information for a variety of clinical and research applications. It is technically challenging, particularly with large size specimens. This video illustrates the process of producing good quality sections and demonstrates the technical difficulties and methods with which to overcome them.

Bone Preparazione Undecalcified per Istologia, Istomorfometria e analisi Fluorocromo

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

Ricerca

Biologia

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Gli stomi nastro-Peel: Un metodo migliore per la preparazione del campione di cellule di guardia

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Preparazione del campione per l'analisi di proteomica massa-spettrometria-basato di microvasi oculari

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l'analisi TEM

Riepilogo

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