The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritti in questo manoscritto sono stati condotti secondo il diritto svizzero e approvati dall&#39;amministrazione veterinario del Cantone di Zurigo, Svizzera. 1. Preparazione Buffer <ol><li> Preparare soluzioni 1 - 4 e la soluzione ormone antidiuretico (ADH) (Tabella 1). </li><li> Preparare il tampone di dialisi (Tabella 1). NOTA: Questo è il buffer utilizzato come tampone di dialisi durante la perfusione. Successivamente, gli eritrociti vengono diluiti in questo tampone per formare il perfusato finale. </li><li> preparazione degli eritrociti. <ol><li> Diluire 250 ml di concentrato di eritrociti umani (materiale testato ottenuto dalla banca locale del sangue) a 500 ml con tampone di dialisi. Centrifugare a 2.000 g per 8 minuti. Rimuovere il tampone, facendo attenzione a non rimuovere eventuali eritrociti. Ripetere 3x. </li></ol></li><li> Preparare la (albumina sierica bovina; BSA) l&#39;albumina del buffer. <ol><li> In 200 ml di dialysibuffer di s, sciogliere 44 g di BSA con un ancoretta. Filtrare la soluzione con carta da filtro. </li></ol></li><li> Preparare il perfusato. <ol><li> Filtrare le eritrociti dal punto 1.3.1 attraverso carta da filtro nel buffer BSA. Riempire fino ad un volume totale di 800 ml con tampone di dialisi. NOTA: Questo è il perfusato finale. L&#39;ematocrito dovrebbe essere compresa tra 8 e 12%. Il perfusato può essere conservato per un massimo di 12 ore a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Avvio Dialisi e l&#39;ossigenazione <ol><li> Accendere bagnomaria circonda il serbatoio più grande del buffer, più piccolo serbatoio tampone, e la camera umida (una piccola camera doppia parete portata a 37 ° C e 100% di umidità per mantenere entro il rene) a 37 ° C (figura 2) . </li><li> Riempire il serbatoio buffer maggiore con il tampone di dialisi e il serbatoio più piccolo con perfusato. </li><li> Accendere il 5% di CO 2/95% O 2 afflusso di gas al tampone di dialisi. </li><li> Accendere dialisi continua del perfusato contro il tampone di dialisi. Fate attenzione ad usare a basso flusso tubo di dialisi. Passare al punto 3. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Figura 2: Schema del circuito di perfusione. Schema mostra i principali componenti del circuito di perfusione e la direzione del flusso buffer. Tutti i componenti circondato da blu scuro vengono mantenute a 37 ° C con un bagno di acqua / termostato. 1: Dialisi tampone di almeno 3 volte il volume del buffer di perfusione è continuamente gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2. 2: Dialisi buffer e buffer di perfusione sono continuamente dializzati contro l&#39;altro in un tubo di dialisi da una pompa a rulli. 3: througho costante Per questo la dialisi, il buffer di perfusione è arricchito con 9% O 2/5% di CO 2 ed elettroliti livelli sono mantenutiut perfusione. 4: Una pompa rullo spinge il buffer di perfusione verso il rene. 5: Un windkessel rimuove onde peristaltiche e agisce come una trappola bolla. 6: trasduttore di pressione (collegato a 4. (pompa roller) per mantenere una pressione continua pur consentendo flusso liberamente alternata). 7: Durante la perfusione, il rene rimane in una camera umida per 100% di umidità e temperatura di 37 ° C renale. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Procedura chirurgica Part 1 (per un diagramma di tutte le legature, vedi Figura 3) Nota: Eseguire tutte le legature utilizzando 5-0 filo chirurgico. <ol><li> Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale (10 ml / g di peso corporeo, 20 mg / ml di ketamina e 1 mg / ml xilazina disciolto in 0,9% NaCl). Confermare la sufficiente profondità di AnesthESIA testando per l&#39;assenza di riflessi retro-piede. </li><li> Fissare il mouse in posizione supina nella camera umida. Proteggere gli occhi con vet unguento. Inserire una siringa da 1 ml di sotto della colonna vertebrale per elevare i vasi lombari. </li><li> Eseguire una laparotomia mediana dalla cresta pubica per l&#39;apertura dello sterno prima la pelle, poi i muscoli addominali, con le forbici. </li><li> Rimuovere l&#39;intestino e posizionarlo sul lato sinistro del laterali del mouse dall&#39;addome. </li><li> Liberare la vescica da tessuto connettivo e di esplorare entrambi gli ureteri e l&#39;uretra. </li><li> Mettere una legatura intorno dell&#39;uretere sinistro (I legature). Chiudilo. </li><li> Inserire una legatura intorno all&#39;uretra (legature II). Chiudilo. </li><li> Posizionare un &quot;laccio&quot; legatura in giro per tutta la vescica (legature III). </li><li> Incidere la vescica 1 mm. </li><li> Incannulare l&#39;apertura cm 2 PE 50 tubi. </li><li> Chiudi legatura III attorno al tubo. </li><li> Tagliare l&#39;uretere sinistro e dell&#39;uretra distale dalle legature. il bladder è ora attaccato al dell&#39;uretere solo a destra e liberi di muoversi. </li><li> Cancellare l&#39;aorta addominale del tessuto connettivo e il grasso. </li><li> Inserire un addominale legatura metà dell&#39;aorta (legature IV). </li><li> Inserire una legatura intorno all&#39;aorta sotto il diaframma tra l&#39;arteria mesenterica superiore e il tronco celiaco (legature V). </li><li> Mettere una legatura intorno all&#39;arteria mesenterica superiore (legature VI). </li><li> Inserire un legatura aortica direttamente sotto destra e sopra l&#39;arteria renale sinistra (VII legatura). </li><li> Mettere una legatura attorno al pacchetto caudale vena (cava) (VIII legature). Passare al punto 4. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Figura 3: Schema del Legature poste durante l&#39;intervento chirurgico. Vista dell&#39;addome aperto dopo la laparotomia. L&#39;intestino viene spostato verso sinistra. L e R indicano il rene sinistro e destro. Illinee nere mostrano l&#39;area della rispettiva legatura. Legature prima immissione e poi chiusi, nella sequenza indicata nel testo. X indica la posizione di incisione per dell&#39;aorta cannulazione. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 4. Adescamento del circuito di perfusione <ol><li> Avviare la pompa rotativa e riempire il tubo con perfusato. Fare attenzione a svuotare tutte le bolle d&#39;aria da esso. </li><li> Riempire il dispositivo windkessel a circa la metà del livello con perfusato. </li><li> Calibrare il trasduttore di pressione a 0 mm Hg quando tutti i tubi è riempita e il flusso è 0. Tenere l&#39;ago perfusione a livello renale durante questo periodo. </li><li> Mantenere il flusso ad un livello minimo costante (0,6 ml / min) e passare al punto 5. </li></ol> 5. Procedura chirurgica Parte 2 <ol><li> Posizionare un morsetto tra la legatura IV e la ramificazione della rena sinistral arteria. </li><li> Fai una piccola incisione nella caudale dell&#39;aorta di legatura IV, avendo cura di non tagliare la parete dorsale. </li><li> Dilata l&#39;apertura in aorta con un dilatatore vascolare. </li><li> Incannulare l&#39;aorta con un ago (2 cm di lunghezza, tirato PE 50), spingendo la punta solo al morsetto. </li><li> Aprire il morsetto. </li><li> Inserire la punta di un ago cranialmente fino a raggiungere il bivio dell&#39;arteria rene destro e l&#39;aorta. </li><li> Chiudere la legatura VII. </li><li> Chiudere la legatura IV. </li><li> Aprite la cassa con le forbici dalla dissezione del diaframma. Con un unico taglio, separare l&#39;aorta, vena cava, cuore e nervi vegetativi. Con questo passo, l&#39;animale viene sacrificato via rapida dissanguamento in anestesia profonda continua. </li><li> Avviare il controllo della pressione della pompa di perfusione. Mantenere la pressione media tra 80 e 100 mmHg. </li><li> Chiudi V. legatura </li><li> Chiudere la legatura VI. </li><li> Chiudere la legatura VIII. </li><li> Libero il diritto rene da tissu connettivoe e la sua incorporazione nella capsula adiposa con le forbici. </li><li> Tagliare l&#39;aorta prossimale di legatura V. </li><li> Tagliare l&#39;arteria mesenterica superiore distale di legatura VI. </li><li> Tagliare il fascio nave rene-out di supporto, avendo cura di non tagliare in vasi stessi. </li><li> Tagliare il fegato al collegamento al rene. Fare attenzione per liberare il rene, ma lasciare una piccola parte del aderenti fegato ad esso, in modo che la vena cava viene mantenuto aperto da esso. </li><li> Prendere il fascio di rene di topo. Rimuovere il mouse dalla camera umida. </li><li> Posizionare un &quot;laccio&quot; legatura attorno al collegamento di fegato e rene (legature IX). </li><li> Incannulare la vena cava con una linea venosa (2 centimetri PE 50). </li><li> Chiudere la legatura IX. deflusso venoso attraverso la linea venosa dovrebbe iniziare immediatamente. </li><li> Chiudere la camera umida. </li></ol> 6. Le analisi a valle <ol><li> Durante l&#39;ora successiva, monitorare continuamente il flusso di sangue e intravasculpressione ar 15. Raccogliere deflusso venoso, che può essere utilizzato per l&#39;analisi, ad esempio, renale rilascio di renina 7. Raccogliere le urine per l&#39;analisi della concentrazione di elettroliti e velocità di filtrazione glomerulare 14. Dopo 1 ora di perfusione, i reni possono essere snap-congelati per blotting occidentale o essere fissati per l&#39;imaging approcci 16. </li></ol>

<ol>
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The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

Il mouse isolato rene perfuso è uno strumento per lo studio della funzione renale in un ambiente controllato ex-vivo per 1 ora, colmando il divario tra esperimenti in vivo su animali intatti, che può essere viziata da l&#39;impatto di numerosi fattori sistemici, e in esperimenti in vitro in nefrone isolati o cellule in coltura, che necessariamente trascurare l&#39;impatto della struttura dell&#39;organo intatta sulla funzione. C&#39;è, alla conoscenza degli autori, non tecnica alternativa con cui eseguire questo compito specifico. Studi biochimici sul tessuto renale, tuttavia, possono essere eseguite in un modo molto più semplice utilizzando fette renali 17. Mentre la tecnica presentata è attualmente utilizzato per lo più per studiare la fisiologia renale, molte nuove applicazioni sono in discussione. Ad esempio, potrebbe essere utilizzato per bioingegneria renale durante la perfusione decellularization e Recellularization 12. Inoltre, prolungata perfusione normotermico di reni prima di transplantation, con la somministrazione di alte dosi di anti-rigetto o del genoma-editing droga nel perfusato, è in fase di studio; anche in ambito clinico 8, 9, 10, 11. Il mouse isolato rene perfuso è un ottimo strumento che potrebbe essere utilizzato per queste applicazioni, in particolare per chiarire il ruolo dei singoli geni con i modelli knockout. Tre punti sono fondamentali per un esperimento riuscito. Questo documento fornisce laboratori interessate i mezzi per riprodurre il procedimento. Innanzitutto, il buffer deve essere preparato in modo tale che il rene riceve la maggior parte delle sostanze nutritive necessarie per la vitalità prolungata in condizioni riproducibili. Un equilibrio deve essere trovato tra le condizioni completamente controllate (tampone di sintesi) e una condizione di perfusione nativo (sangue intero). Pertanto, l&#39;albumina e eritrociti di mammifero ad un ematocrito del 10% devono essere inclusi. Questo ematocrito rappresenta, nell&#39;esperienza degli autori, il miglior compromesso tra sufficienti tproblema di ossigenazione e bassa viscosità tampone (aumento dell&#39;ematocrito diminuisce il flusso drammaticamente durante la perfusione pressione costante (confrontare i valori presentati in questo documento ai valori nei reni perfusi senza eritrociti 18)). La qualità e la freschezza del eritrociti è critica. Durante le fasi di lavaggio, eritrociti devono essere maneggiati con cura per evitare l&#39;emolisi. Il buffer deve essere preparato fresco il giorno dell&#39;esperimento. In secondo luogo, l&#39;operazione deve essere effettuata da un chirurgo esperto nel più breve tempo possibile. Il chirurgo deve eseguire 6 legature intorno vasi principali che collegano il rene al resto del corpo, mantenendo la perdita di sangue dell&#39;animale al minimo. Per ottenere risultati ottimali, gli interventi chirurgici devono essere realizzati entro 30 minuti. Se la pressione media arteriosa dell&#39;animale gocce, durante l&#39;intervento chirurgico prolungato o da anestesia, inferiore a 60 mmHg, perfusione renale sarà già minimo e il tessuto sarà soggettaa necrosi. Per escludere questo caso, il rene sinistro può essere presa dopo l&#39;intervento chirurgico, quando la perfusione del rene destro è già iniziata, e utilizzato come un testimone non trattato. In terzo luogo, durante il tempo della perfusione del corretto funzionamento dell&#39;apparato perfusione, costituito da un circuito piccolo animale-perfusione normale, deve essere garantita. Mentre il computer esegue la perfusione di per sé, supervisione umana è necessario, ad esempio per controllare bolle nel circuito di perfusione. I dati rappresentativi forniti consente la valutazione della solidità renale dopo 1 ora di perfusione ex vivo e il confronto del successo tecnica di qualsiasi esecuzione di questo metodo per l&#39;approccio qui descritto. Nel corso di almeno 1 ora, il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, emogasanalisi del deflusso venoso e velocità di filtrazione glomerulare dovrebbero rimanere stabili. Ci sono alcune limitazioni alla tecnica, che si deve tenere a mente. Anche un kiDney emissione da un intervento chirurgico di maggior successo non può che rimanere valida per un periodo di tempo limitato. Gli autori hanno trovato 1 ora di essere il miglior punto di tempo in cui per fermare la perfusione. Inoltre, mentre la perfusione del rene isolato consente lo studio di isolati tutto l&#39;organo in profondità, è difficile differenziare effetti specifici sulla un tipo di cellula. I reni fisse dopo 1 ora potrebbero presentare difetti nei segmenti S3 di tubuli prossimali e cellule ascendente dell&#39;ansa di spessore, mentre glomeruli, segmenti S1, DCT, e CD dovrebbe rimanere intatto. L&#39;uso obbligatorio di eritrociti, in particolare dagli esseri umani, è legato anche a potenziali rischi (ad esempio, infezioni) per lo sperimentatore. In sintesi, il mouse isolato rene perfuso è una tecnica utile con cui studiare l&#39;intero organo ex vivo. Come qualsiasi tecnica, presenta alcuni vantaggi e limitazioni. Gli autori ritengono che sia le nuove molteplici applicazioni attualmente sorgere e questo protocollo potrebbe fornire sufficient slancio per altri laboratori di riprodurre questo sforzo.

La perfusione isolata di organi è stato oggetto di uno sforzo continuo tra fisiologi per molti decenni 1. La tecnica consente la funzione dell&#39;organo, senza influenze sistemiche come la pressione sanguigna, ormoni, o nervi, da studiare. Carl Eduard Loebell è considerato il primo ad aver descritto la perfusione successo di un rene isolato, nel 1849 2. Da allora, l&#39;apparato perfusione ha subito notevole raffinatezza. Frey e Gruber ha introdotto un polmone artificiale per le pompe di ossigenazione e pulsatile per continua perfusione 2. Mentre i primi ricercatori hanno studiato principalmente i reni di grandi mammiferi, cioè, maiali e cani 2 3 -la prima relazione l&#39;uso di reni di ratto, di Weiss et al. , È stata una pietra miliare nello studio della perfusione piccolo-mammifero-organo 4. Schurek et al. riferito la necessità di aggiungere eritrociti di mammifero al perfusato se tubulare renale sufficienteossigenazione doveva essere raggiunto 5. Critico per esperimenti di lunga durata è stata l&#39;introduzione della dialisi continua del buffer dallo stesso gruppo di ricerca 6. Nel 2003, Schweda et al. sono stati i primi a segnalare un rene del mouse funzionale isolato perfuso (MIPK) 7, in seguito perfezionato da Rahgozar et al. 18 e Lindell et al. 14. Mentre tecnicamente più impegnativo rispetto al ratto isolato rene perfuso, l&#39;uso del MIPK porta il vantaggio di permettere l&#39;uso di una vasta gamma di topi geneticamente modificati. Questo documento presenta i dettagli del metodo degli autori per la perfusione isolata reni del mouse per 1 ora. Il metodo consente la valutazione continua della velocità di flusso renale, resistenza vascolare, rilascio di ormone, emogasanalisi, analisi delle urine, e l&#39;applicazione di farmaci. Seguendo la procedura, reni potrebbero essere trattati per analisi molecolari e biochimiche, fissati per la microscopia, otrapiantato in un topo ricevente (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Figura 1: panoramica dei possibili Input / Output al rene isolato e perfuso. BGA: analisi dei gas del sangue. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Questa tecnica probabile che riceverà maggiore attenzione nei prossimi anni, come molte applicazioni innovative sono in discussione con l&#39;alba di una prolungata perfusione del rene normotermico prima del trapianto (con o senza l&#39;applicazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing) 8, 9, 10 , 11, la bioingegneria di interi reni da impalcature decellularized 12, e l&#39;applicazione di elevate dosi di coloranti fluorescenti per l&#39;imaging multiphoton 13 </sup&gt;. E &#39;anche un modello ideale con cui studiare il ruolo di specifici geni durante il danno renale acuto 14. Un protocollo step-by-step è dato per consentire ad altri laboratori di eseguire isolato mouse perfusione del rene con successo. Innanzitutto, è specificato la composizione e preparazione del buffer. Quindi, l&#39;intervento è descritto in dettaglio e sono presenti i punti critici. In terzo luogo, i dati vengono presentati che sono rappresentativi di una preparazione di successo: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, velocità di filtrazione glomerulare, e degli elettroliti frazionaria misurazioni funzionali di vitalità e di elettroni trasmissione micrografie della morfologia dei diversi segmenti nefrone di reni perfusi tutti escrezione- fisso dopo 1 ora di perfusione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Perfusion Circuit:</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Moist chamber 834/8</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-2901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Cannular with basket and side port</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-2947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Thermostat TC120-ST5&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Reservoir jacketed for buffer solution 1L</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-3438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-3436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Pressure Transducer APT300&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">TAM-D Plugsys Transducer</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-1793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">SCP Plugsys servo controller</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-2806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Windkessel&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-3717</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">HSE-USB data acquisition</td>
			<td style="width:173px;">Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td>
			<td style="width:119px;">73-3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td>
			<td style="width:173px;">B.Braun</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7203525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:447px;">PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D.</td>
			<td style="width:173px;">Scientific Commodities Inc.</td>
			<td style="width:119px;">BB31695-PE/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:447px;">Name</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Buffer reagents:</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Aminoplasmal 10%</td>
			<td style="width:173px;">B.Braun</td>
			<td align="right" style="width:119px;">134518064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2256-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1626-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">L-(-)-Malic acid sodium salt</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1125-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Sodium-L-Lactate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">K1875-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S5761-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U5378-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Creatinine</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4255-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:173px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10835242001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgCl2 * 6H2O</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CaCl2 * 6H2O&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Riedel-de-Ha&#235;n</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9638-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S0876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Antidiuretic Hormone dDAVP</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V2013-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">FITC-Inulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Filter used for erythrocyte filtration</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">MN 615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">BGA Analysis:</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">ABL 80 flex</td>
			<td style="width:173px;">Radiometer Medical ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Electron Microscope:</td>
			<td style="width:173px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Philips CM100 TEM</td>
			<td style="width:173px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse isolated perfused kidney technique

L&#39;isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. Questo è un prerequisito per lo studio della fisiologia dell&#39;organo isolata e per molte applicazioni innovative che possono essere possibile in futuro, tra perfusione decellularization per la bioingegneria reni o la somministrazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing in dosi elevate per innescare il rene per il trapianto. Durante il tempo della perfusione, il rene può essere manipolato, funzione renale può essere valutata, e vari farmaci somministrati. Dopo la procedura, il rene può essere trapiantato o trasformati per la biologia molecolare, l&#39;analisi biochimica, o al microscopio. Questo articolo descrive il perfusato e la tecnica chirurgica necessaria per la perfusione ex vivo di reni mouse. Dettagli dell&#39;apparato perfusione sono date e dati sono presentati mostra la vESPONSABILITÀ di preparazione del rene: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, e delle urine dati come, microscopio elettronico di trasmissione funzionali dei diversi segmenti del nefrone come letture morfologiche, e le macchie occidentali di proteine ​​di trasporto dei diversi segmenti del nefrone come lettura molecolare.

Con il metodo descritto, isolati reni mouse possono rimanere vitali per almeno 1 ora. Abbiamo testato la vitalità del tessuto dopo 1 ora di perfusione continua con funzionale (flusso ematico renale e la resistenza vascolare, analisi dei gas del sangue del deflusso venoso, velocità di filtrazione glomerulare, urinario frazionata Na + e K + escrezione, e nelle urine osmolalità) e morfologica (elettronico a trasmissione microscopia, TEM) metodi in quattro reni di tipo selvatico topi C57BL / 6. Inoltre, Western blot di proteine marker apicali dei diversi segmenti di tubuli sono state eseguite, confrontando isolati reni perfusi per i reni unperfused degli stessi animali. In tutti gli esperimenti, perfusione pressione costante è stato utilizzato, mantenendo la pressione di perfusione a ~ 100 mmHg (Figura 4). In questi reni, flusso perfusato e resistenza vascolare rimasti stabili per un tempo di 55 min a 15,6 ± 0,4 ml / min * g di peso rene e 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, rispettivamente (Figura 4). Una diminuzione del flusso perfusato o un aumento della resistenza vascolare è un parametro sensibile a diminuire vitalità del tessuto e devono essere monitorati durante la perfusione con cura. Gas Sangue e analisi elettrolita in 100 microlitri campioni prelevati 60 minuti dopo l&#39;inizio della perfusione renale rivelato produzione di CO 2 e consumi O 2, quando l&#39;afflusso arterioso è stato confrontato con il deflusso venoso (Tabella 2). Gli altri parametri sono rimasti invariati tra l&#39;arteria e vena (Tabella 2). Particolare attenzione deve essere posta sul rilascio di potassio venosa inalterato, come un aumento può verificarsi durante danni ai tessuti. Velocità di filtrazione glomerulare, valutato tramite FITC-inulina gioco 14, tendeva ad aumentare nel corso del tempo (Figura 4 B), ma questa tendenza non ha raggiunto la significatività. escrezione frazionale di sodio e potassio valutato dopo 55 minuti di perfusioneè maggiore rispetto alla situazione in vivo (Figura 4 C). L&#39;urina osmolalità non è elevata al di sopra della osmolalità del deflusso venoso dopo 55 min di perfusione (Figura 4 D). Per gli studi morfologici, reni sono stati fissati dopo perfusione in 3% paraformaldeide e glutaraldeide allo 0,1% in tampone di dialisi come precedentemente descritto 17. ultrastruttura renale è stata valutata con TEM. Segmenti glomeruli e S1 di tubuli prossimali sono apparsi in gran parte immutata dopo perfusione (figure 5 A e B). Alcuni, ma non tutti i segmenti S2 / S3 di tubuli prossimali e gli arti ascendenti di spessore che non sono stati vicino ai fasci vascolari mostravano segni di danno d&#39;organo, come descritto in precedenza nel ratto isolato reni perfusi 5 (figure 5 C e D). Anche a ben guardare, tubuli contorti distali e dotti collettori non hanno mostrato evidenti segni di necrosi (Le figure 5 E, F e G). In conclusione, i risultati morfologiche nei reni del mouse rispecchiano la situazione constatata nel ratto isolato rene perfuso 5. Western blot di proteine ​​marker apicali dei diversi segmenti del nefrone nei reni perfusi isolati (snap-congelati dopo 1 ora di perfusione) rispetto al unperfused reni controlaterale dello stesso animale (snap-congelati prima della comparsa della perfusione) non ha rivelato alterazioni significative. Abbiamo studiato Napi-IIa (che si trova nei tubuli prossimali), NKCC2 (arti ascendenti di spessore), NCC (distale tubuli contorti), ed ENAC (collegamento tubuli / dotti collettori) (figure da 6 A e B). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig4.jpg" /> Figura 4: valutazione della validità funzionale dei reni perfuso per 55 min. A) &lt;/ Strong&gt; durante la perfusione pressione costante, la resistenza vascolare e il flusso perfusato è rimasto stabile per 55 min. I primi 15 minuti sono esclusi a causa della variabilità sempre visto durante questo tempo. B) velocità di filtrazione glomerulare (FITC-inulina) di quattro reni valutati dopo 25 e 55 min visualizzata lieve ma non significativo aumento nel corso del tempo. C) escrezione frazionale di sodio e potassio valutata dopo 55 min di perfusione. D) nel plasma e nelle urine venosa osmolalità dopo 55 min di perfusione. n = 4 in tutti gli esperimenti. I dati sono presentati come media ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig5.jpg" /> Figura 5: microscopia elettronica a trasmissione. Rappresentante Morfologia di D<html> Segmenti ifferent Nefrone di perfuso reni ad un punto finale di 1 ora. A) I glomeruli sono intatti. Dettaglio di un podocyte in un glomerulo. Segmento B) S1 di un tubulo prossimale. segmenti S1 sono intatte. Segmento C) S2 / S3 di un tubulo prossimale. Alcuni, ma non tutti i segmenti S2 / S3 di tubuli prossimali sono altamente necrotico. Le cellule appaiono gonfie e mostrano grandi danni intracellulare. Il profilo tubolare viene mantenuta solo dalla membrana basale. D) arto spessa ascendente (TAL). Quelle tals che sono lontani dai fasci vascolari mostrano i primi segni di degenerazione idropica. membrane luminali appaiono assottigliate e fragile. E) tubulo contorto distale (DCT). DCT sono intatte. F) Dettaglio dei ripiegamenti basolaterale di una cella DCT. Fenestrated endotelio, membrana basale, ripiegamenti basolaterale, e mitocondri sono intatte. G) dotto collettore (CD). CD sono intatti.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig6.jpg" /> Figura 6: Western Blot di apicali Marker proteine in isolato Reni perfuso Rispetto al Unperfused reni dagli stessi animali. A) Western blot di reni perfusi per 1 ora e reni unperfused. Napi-IIa è rappresentativo per il tubulo prossimale. NKCC2 è rappresentativo per il tratto ascendente di spessore. NCC e NCC fosforilati a treonina 53 (pT53 NCC) si trovano esclusivamente nel tubulo contorto distale. Alfa e gamma subunità dell&#39;Enac in tutta la loro lunghezza e la loro rispettivi prodotti proteolytically spaccati sono mostrati rappresentante per il collegamento tubulo / dotto collettore. B) Quantificazione di A) non ha rivelato differenze significative tra f reni perfusio 1 ora e reni unperfused. n = 3 in tutti gli esperimenti. I dati sono presentati come media ± SEM e vengono visualizzati i singoli valori. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl1.jpg" /> Tabella 1: Composizione di soluzioni e Dialisi tampone. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712tbl1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.</a> <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl2.jpg" /> Tabella 2: gas del sangue e analisi di elettroliti di arteriosa afflusso e deflusso venoso di perfuso mouse Reni 60 minuti dopo l&#39;inizio della perfusione (n = 4). I dati sono presentati come media ±SEM.

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The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

L&#39;isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. I buffer e tecnica chirurgica sono descritte in dettaglio.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

21.5K Views.  University of Zürich.  L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. I buffer e tecnica chirurgica sono descritte in dettaglio. 

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

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Biologia

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured with independent control over pulmonary arterial flow rate, flow rate waveform, airway pressure and left atrial pressure. Pulmonary vascular resistance is calculated based on multi-point, steady pressure-flow curves; pulmonary vascular impedance is calculated from pulsatile pressure-flow curves obtained at a range of frequencies. As now recognized clinically, impedance is a superior measure of right ventricular afterload than resistance because it includes the effects of vascular compliance, which are not negligible, especially in the pulmonary circulation. Three important metrics of impedance - the zero hertz impedance Z0, the characteristic impedance ZC, and the index of wave reflection RW - provide insight into distal arterial cross-sectional area available for flow, proximal arterial stiffness and the upstream-downstream impedance mismatch, respectively. All results obtained in isolated, ventilated and perfused lungs are independent of sympathetic nervous system tone, volume status and the effects of anesthesia. We have used this technique to quantify the impact of pulmonary emboli and chronic hypoxia on resistance and impedance, and to differentiate between sites of action (i.e., proximal vs. distal) of vasoactive agents and disease using the pressure dependency of ZC. Furthermore, when these techniques are used with the lungs of genetically engineered strains of mice, the effects of molecular-level defects on pulmonary vascular structure and function can be determined.

The following protocol outlines the process of isolating, ventilating and instrumenting mouse lungs to measure steady or pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships in order to quantify the effects of blood flow, airflow, airway changes and vascular changes on right ventricular afterload.

Caratterizzazione del isolata, ventilata e polmone mouse Instrumented perfusi con flusso pulsatile

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...