The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

أجريت جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وصفها في هذه المخطوطة وفقا للقانون السويسري والموافقة عليها من قبل الإدارة البيطرية للكانتون زيورخ، سويسرا. 1. إعداد العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول 1-4 والحل الهرمون المضاد لإدرار البول (ADH) (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة غسيل الكلى (الجدول 1). ملاحظة: هذا هو عازلة تستخدم المخزن المؤقت لغسيل الكلى خلال نضح. وفي وقت لاحق، سوف تضعف كريات الدم الحمراء في هذا المخزن المؤقت لتشكيل الإرواء النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كرات الدم الحمراء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 250 مل من تركيز كريات الدم الحمراء البشرية (مادة اختبار تم الحصول عليها من بنك الدم المحلي) إلى 500 مل مع العازلة غسيل الكلى. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 8 دقائق. إزالة المنطقة العازلة، والحرص على عدم إزالة أي خلايا الدم الحمراء. تكرار 3X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد (ألبومين المصل البقري، BSA) الزلال العازلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 200 مل من dialysiالصورة العازلة، حل 44 غرام من جيش صرب البوسنة باستخدام بقضيب. تصفية حل مع ورقة الترشيح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإرواء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية كريات الدم الحمراء من الخطوة 1.3.1 من خلال ورق الترشيح في المخزن المؤقت BSA. ملء تصل إلى الحجم الكلي 800 مل مع العازلة غسيل الكلى. ملاحظة: هذا هو الإرواء النهائي. يجب أن يكون الهيماتوكريت الآن بين 8 و 12٪. سائل الإرواء يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 12 ساعة عند 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol> 2. المبادرة للغسيل والأوكسجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على حمام ماء المحيطة الخزان أكبر العازلة، أصغر خزان العازلة، وغرفة رطبة (جلب، غرفة صغيرة مزدوجة الجدران إلى 37 درجة مئوية، و 100٪ الرطوبة عقد في وقت لاحق الكلى) إلى 37 درجة مئوية (الشكل 2) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء خزان مؤقت أكبر مع العازلة غسيل الكلى وخزان أصغر مع الإرواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل 5٪ CO 2/95٪ O 2 تدفق الغاز إلى المخزن المؤقت لغسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على غسيل الكلى المستمر للسائل الإرواء ضد المخزن المؤقت لغسيل الكلى. احرص على استخدام أنابيب غسيل الكلى المنخفضة للتدفق. انتقل إلى الخطوة 3. </li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> الشكل 2: رسم تخطيطي للحلبة الإرواء. يظهر مخطط المكونات الرئيسية لدائرة نضح واتجاه تدفق العازلة. وتحفظ كل مكونات محاطة الأزرق الداكن عند 37 درجة مئوية مع حمام ماء / الحرارة. 1: فقاعات غسيل الكلى عازلة لا يقل عن 3 أضعاف حجم المخزن المؤقت نضح مستمر مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. 2: يتم مدال غسيل الكلى العازلة والعازلة نضح باستمرار ضد بعضها البعض في أنبوب غسيل الكلى عن طريق مضخة الأسطوانة. 3: ونتيجة لهذا غسيل الكلى، وإثراء المخزن المؤقت نضح مع 9٪ O يتم الاحتفاظ 05/02٪ CO 2 والكهارل مستويات througho المستمرالتحرير الارواء. 4: مضخة بكرة يفجر المنطقة العازلة نضح نحو الكلى. 5: windkessel يزيل موجات تحوي وبمثابة فخ فقاعة. 6: الضغط على (متصلة إلى 4. (مضخة بكرة) للحفاظ على الضغط المستمر مع السماح للتدفق بالتناوب بحرية). 7: طوال التروية، يبقى الكلى في غرفة رطبة للرطوبة الهواء 100٪ و 37 درجة مئوية درجة حرارة الكلى. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 3. الجراحي إجراء الجزء 1 (رسم تخطيطي لجميع الأربطة، انظر الشكل 3) ملاحظة: إجراء جميع الحروف المركبة باستخدام 5-0 موضوع الجراحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم، و 20 ملغ / مل الكيتامين و 1 ملغ / مل زيلازين يذوب في 0.9٪ كلوريد الصوديوم). تأكيد عمق كاف من anesthتقييم الأثر البيئي من خلال اختبار لغياب ردود الفعل الخلفي القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الماوس في موقف ضعيف في غرفة رطبة. حماية العينين مع مرهم التعليم والتدريب المهني. وضع حقنة 1 مل تحت العمود الفقري لرفع السفن قطني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء عملية فتح البطن وسيطة من قمة العانة لافتتاح القص أولا الجلد، ثم عضلات البطن، مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأمعاء ووضعه على الجانب الأيسر من جانبي الماوس من البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير المثانة من النسيج الضام، واستكشاف كل من الحالب ومجرى البول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رباط حول الحالب الأيسر (ضمد الأول). أغلقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رباط حول مجرى البول (ضمد الثاني). أغلقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;اسو&quot; رباط حول المثانة كاملة (ضمد الثالث). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق المثانة 1 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية فتح مع 2 سم PE 50 الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار ضمد الثالث حول الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحالب الأيسر والقاصي مجرى البول من الأربطة. هؤلاء الاشخاصالآن تعلق دير إلى الحالب الأيمن فقط وتتحرك بحرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الشريان الأورطي البطني من النسيج الضام والدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البطن ضمد منتصف الشريان الأورطي (IV رباط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رباط حول الشريان الأبهر أسفل الحجاب الحاجز بين الشريان المساريقي العلوي والجذع الاضطرابات الهضمية (V رباط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رباط حول الشريان المساريقي العلوي (السادس رباط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رباط الأبهر دون الحق مباشرة وفوق الشريان الكلوي الأيسر (رباط السابع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رباط حول حزمة الذيلية الوريد (الوريد) (الثامن رباط). انتقل إلى الخطوة 4. </li></ol><img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> الشكل 3: رسم تخطيطي للالحروف المركبة وضعها خلال جراحة. عرض من البطن مفتوحة بعد فتح البطن. تم نقل الأمعاء إلى اليسار. L و R يشير إلى الكلى اليسار واليمين. التظهر خطوط سوداء مجال ربطة منها. توضع الأربطة أولا ثم أغلقت، في تسلسل معين في النص. يصادف العاشر موقع شق لإقناء؛ إدخال القنية الشريان الأورطي. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 4. الاشعال من حلبة الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل المضخة الدوارة وملء الأنبوب مع الإرواء. الحرص على تفريغ جميع فقاعات الهواء منه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل الجهاز windkessel إلى حوالي منتصف مستوى مع الإرواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة محول الضغط على 0 ملم زئبق عندما يتم تعبئة جميع الأنابيب وتدفق هو 0. الحفاظ على إبرة نضح على مستوى الكلى خلال هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء تدفق على مستوى الحد الأدنى ثابت (0.6 مل / دقيقة) وانتقل إلى الخطوة 5. </li></ol> 5. الجراحي إجراء الجزء 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المشبك بين ضمد الرابع والمتفرعة من رينا اليسارل الشريان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير في الذيلية الأبهر من ضمد الرابع، مع الحرص على عدم قطع الجدار الظهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمدد فتح في الشريان الأورطي مع الموسع السفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي مع إبرة (2 سم، وسحبت PE 50)، ودفع الطرف فقط إلى المشبك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح المشبك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع غيض من cranially الإبرة حتى يصل تقاطع الصحيح الشريان الكلوي والشريان الأورطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار ضمد السابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار ضمد الرابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصدر مع مقص من قبل تشريح الحجاب الحاجز. مع خفض واحد، فصل الشريان الأبهر، الوريد الأجوف والقلب والأعصاب الخضري. مع هذه الخطوة، هو التضحية الحيوانية عن طريق استنزاف السريع تحت التخدير العميق المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء السيطرة على ضغط مضخة نضح. الحفاظ على الضغط المتوسط ​​بين 80 و 100 مم زئبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار خامسا رباط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار ضمد السادس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار ضمد الثامن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرة الكلية اليمنى من TISSU الضامه وتضمينها في داخل كبسولة الدهنية مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشريان الأورطي قريب إلى ضمد V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشريان المساريقي العلوي إلى أقصى حد لضمد السادس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حزمة السفينة الداعمة الكلى بها، مع الحرص على عدم قطع في الأوعية أنفسهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الكبد في اتصال الكلى. رعاية لتحرير الكلى، ولكن ترك جزء صغير من تمسكا الكبد لذلك، بحيث يتم الحفاظ على الوريد الأجوف مفتوحة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ حزمة الكلى من الماوس. إزالة الماوس من غرفة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;اسو&quot; رباط حول ربط الكبد والكلى (التاسع رباط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية الوريد الأجوف مع خط وريدي (2 سم PE 50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انهيار ضمد التاسع. تدفق الوريدي من خلال خط وريدي يجب أن تبدأ على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق غرفة رطبة. </li></ol> 6. تحليل المصب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال ساعة التالية، تراقب باستمرار تدفق الدم وintravasculضغط ع 15. جمع تدفق الوريدي، والتي يمكن استخدامها لتحليل، على سبيل المثال، الكلوي الإفراج الرينين 7. جمع البول لتحليل تركيز بالكهرباء والكبيبي معدل الترشيح 14. بعد 1 ساعة من نضح والكلى يمكن المفاجئة المجمدة لالنشاف الغربية أو أن تكون ثابتة للتصوير النهج 16. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

الماوس معزولة الكلى perfused هو أداة لدراسة وظائف الكلى في بيئة تسيطر عليها خارج الجسم لمدة 1 ساعة، سد الفجوة بين التجارب المجراة على الحيوانات سليمة، والتي قد تكون معيبة بسبب تأثير العوامل النظامية عديدة، وفي التجارب المختبرية في شرائح كليون معزولة أو الخلايا المستزرعة، التي تهمل بالضرورة تأثير هيكل الجهاز سليمة على وظيفة. هناك، على حد علم الكتاب &quot;، أي تقنية بديلة التي لأداء هذه المهمة المحددة. الدراسات البيوكيميائية على أنسجة الكلى، ومع ذلك، لا يمكن أن يؤديها بطريقة أبسط بكثير باستخدام شرائح الكلى 17. في حين يتم استخدام تقنية عرض حاليا في الغالب لدراسة علم وظائف الأعضاء الكلوي، وتجري حاليا مناقشة العديد من التطبيقات الجديدة. على سبيل المثال، يمكن استخدامه للالهندسة الحيوية الكلى خلال decellularization نضح وrecellularization 12. وبالإضافة إلى ذلك، نضح سوي الحرارة لفترات طويلة من الكلى قبل TRansplantation، مع إعطاء جرعات عالية من المضادة للرفض أو الجينوم تحرير المخدرات في الإرواء، ويجري دراستها. حتى في المرافق الصحية 8، 9، 10، 11. الماوس معزولة الكلى perfused هو أداة ممتازة يمكن استخدامها لهذه التطبيقات، وخاصة لإلقاء الضوء على دور الجينات الفردية مع نماذج خروج المغلوب. ثلاث خطوات حاسمة لتجربة ناجحة. تقدم هذه الورقة المختبرات المهتمة وسيلة لإعادة إنتاج الإجراء. أولا، يجب أن تكون مستعدة في مثل هذه الطريقة التي يتلقى الكلى معظم العناصر الغذائية اللازمة لبقاء لفترة طويلة في ظل ظروف استنساخه المخزن المؤقت. يجب إيجاد توازن بين الظروف التي تسيطر عليها بالكامل (عازلة الاصطناعية) وحالة التروية الأم (الدم الكامل). لذلك، يجب أن تضمن الزلال وكريات الدم الحمراء الثدييات إلى الهيماتوكريت 10٪. ويمثل هذا الهيماتوكريت، في أصحاب الخبرة، وأفضل حل وسط بين ر كافيةقضية الأوكسجين وانخفاض اللزوجة عازلة (زيادة الهيماتوكريت يقلل تدفق بشكل كبير خلال نضح الضغط المستمر (مقارنة القيم الواردة في هذه الوثيقة على القيم في الكلى perfused دون الكريات الحمراء 18)). جودة ونضارة من الكريات الحمراء أمر بالغ الأهمية. خلال خطوات الغسيل، لا بد من التعامل معها بحذر لمنع انحلال الدم كريات الدم الحمراء. يجب أن تكون على استعداد حديثا في يوم التجربة المخزن المؤقت. ثانيا، تحتاج إلى أن يقوم بها جراح المدربين في أقرب وقت ممكن لعملية جراحية. يحتاج الجراح إلى إجراء 6 الأربطة حول الأوعية الرئيسية التي تربط الكلى إلى باقي الجسم، مع الحفاظ على فقدان الدم من الحيوان إلى أدنى حد ممكن. لأفضل النتائج، ينبغي أن يتم إنجاز التدخلات الجراحية في غضون 30 دقيقة. إذا كان ضغط الدم الشرياني يعني الحيوان يسقط، خلال عملية جراحية طويلة أو بسبب التخدير، وأقل من 60 مم زئبق، ونضح الكلوي تكون على الحد الأدنى، وسوف الأنسجة تكون عرضةإلى نخر. إلى يستبعد ذلك، يمكن أن تؤخذ في الكلية اليسرى بعد الجراحة، عندما بدأت نضح من الكلية اليمنى بالفعل، واستخدامها كعنصر تحكم غير المعالجة. ثالث خلال فترة نضح سير الصحيح للجهاز نضح، تتألف من الدوائر الصغيرة الحيوان نضح القياسية، يحتاج، لا بد من ضمان. في حين يقوم جهاز الكمبيوتر نضح في حد ذاته، والإشراف البشري ضروري، على سبيل المثال للتحقق من وجود فقاعات في الدائرة نضح. البيانات التمثيلية المنصوص تسمح لتقييم الجدوى الكلى بعد 1 ساعة من خارج الحي نضح والمقارنة من نجاح فني في أي تنفيذ هذا الأسلوب لنهج الموصوفة هنا. أثناء لا يقل عن 1 ساعة، وتدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، وينبغي أن تظل غازات الدم من التدفق الوريدي ومعدل الترشيح الكبيبي مستقر. هناك بعض القيود على هذه التقنية، التي يتعين على المرء أن نأخذ في الاعتبار. حتى كيdney إصدار من الجراحة الناجحة يمكن أن يظل قابلا للتطبيق فقط لفترة محدودة. وجد الباحثون 1 ساعة ليكون أفضل نقطة في الوقت الذي وقف نضح. بالإضافة إلى ذلك، في حين نضح في الكلى معزولة يسمح لدراسة الجهاز كله معزولة في العمق، فانه من الصعب التفريق آثار محددة على نوع خلية واحدة. الكلى ثابتة بعد 1 ساعة قد تظهر العيوب في قطاعات S3 من الأنابيب القريبة وسميكة خلايا الطرف الصاعد، في حين الكبيبات، شرائح S1، DCTs، والأقراص المدمجة وينبغي أن تظل سليمة. استخدام الإلزامي من كريات الدم الحمراء، وخاصة من البشر، ويرتبط أيضا إلى المخاطر المحتملة (على سبيل المثال، والالتهابات) لمجرب. وباختصار، فإن الماوس معزولة الكلى perfused هو تقنية مفيدة مع الذي لدراسة الجهاز كله خارج الحي. مثل أي تقنية، لها مزايا وقيود معينة. يعتقد المؤلفون أن كلا من التطبيقات الجديدة المتعددة التي تنشأ حاليا وهذا البروتوكول يمكن أن توفر sufficienر الزخم للمختبرات أخرى لإنتاج هذا الجهد.

وقد نضح معزولة من الأجهزة موضوع جهد مستمر بين فسيولوجي لعقود عديدة 1. هذه التقنية تتيح وظيفة الجهاز، دون التأثيرات الجهازية مثل ارتفاع ضغط الدم، والهرمونات، أو الأعصاب، لدراستها. يعتبر كارل إدوارد Loebell أن يكون أول من وصف نضح الناجح لالكلى معزولة، في عام 1849 2. ومنذ ذلك الحين، شهدت جهاز نضح صقل كبير. قدم فراي وغروبر رئة اصطناعية لالأوكسجين ونابض مضخات نضح المستمر 2. في حين الباحثين في وقت مبكر درس أساسا الكلى من الثدييات وهي كبيرة والخنازير والكلاب 2 3 -The التقرير الأول للاستخدام الكلى الفئران، التي فايس وآخرون. ، كان علامة فارقة في دراسة صغيرة الثدييات جهاز نضح (4). Schurek وآخرون. ذكرت ضرورة إضافة الكريات الحمراء الثدييات إلى الإرواء إذا أنبوبي كلوي كافيةكان الأوكسجين إلى أن يتحقق 5. حاسمة لتجارب طويلة الأمد كانت مقدمة من غسيل الكلى المستمر من المخزن المؤقت من قبل نفس المجموعة البحثية 6. في عام 2003، Schweda وآخرون. كانوا أول من الإبلاغ عن الكلى الماوس وظيفية معزولة perfused (MIPK) 7، والمكرر في وقت لاحق من قبل Rahgozar وآخرون. 18 ويندل وآخرون. 14. بينما من الناحية الفنية أكثر تحديا من الفئران المعزولة الكلى perfused، واستخدام MIPK يحمل ميزة تمكن من استخدام مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. تعرض هذه الورقة على تفاصيل طريقة المؤلفين من أجل perfusing الكلى الماوس معزولة لمدة 1 ساعة. يسمح أسلوب التقييم المستمر لمعدل الكلوي تدفق، ومقاومة الأوعية الدموية، والإفراج عن هرمون، تحليل غازات الدم وتحليل البول، وتطبيق المخدرات. وبعد هذا الإجراء، يمكن معالجتها الكلى للتحليل الجزيئي والكيمياء الحيوية، وتكون ثابتة للفحص المجهري، أوزرعه في الماوس المتلقي (الشكل 1). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> الشكل 1: نظرة عامة على احتمال الإدخال / الإخراج إلى الكلى Perfused المعزولة. بغا: تحليل الدم الغاز. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> هذه التقنية من المرجح أن تلقي اهتماما متزايدا في السنوات القادمة، كما يتم مناقشة العديد من التطبيقات المبتكرة مع فجر لفترات طويلة نضح الكلى سوي الحرارة قبل الزرع (مع أو من دون تطبيق المضادة للرفض أو عقاقير تحرير الجينوم) 8، 9، 10 ، 11، والهندسة الحيوية الكلى كلها من السقالات decellularized 12، وتطبيق جرعات عالية من الأصباغ الفلورية لmultiphoton التصوير 13 </sup&gt;. بل هو أيضا نموذج مثالي مع الذي لدراسة دور الجينات المحددة خلال قصور كلوي حاد 14. ويرد بروتوكول خطوة بخطوة للسماح غيرها من المختبرات لأداء معزولة الماوس نضح الكلى بنجاح. أولا، يتم تحديد تكوين وإعداد المخزن المؤقت. ثم، يتم وصف عملية جراحية في التفاصيل وتعرض الخطوات الحاسمة. ويرد الثالث، البيانات التي تمثل من الإعداد الناجح: تدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، معدل الترشيح الكبيبي، والكهارل كسور إفراز للجميع القياسات وظيفية من الميكروسكوب الجدوى والإلكترون انتقال مورفولوجية قطاعات كليون مختلفة من الكلى perfused ثابت بعد 1 ساعة من نضح.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Perfusion Circuit:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular with basket and side port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisition</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer reagents:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretic Hormone dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter used for erythrocyte filtration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse isolated perfused kidney technique

الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. وهذا شرط أساسي لدراسة علم وظائف الأعضاء من الجهاز معزولة وللعديد من التطبيقات المبتكرة التي قد يكون من الممكن في المستقبل، بما في ذلك decellularization نضح عن الهندسة الحيوية الكلى أو إدارة مكافحة الرفض أو المخدرات تحرير الجينوم في جرعات عالية لرئيس الكلية للزرع. خلال ذلك الوقت من نضح، والكلى يمكن التلاعب بها، ويمكن تقييم وظائف الكلى، ومختلف المواد الصيدلانية تدار. بعد العملية، والكلى يمكن زرعها أو تجهز لعلم الأحياء الجزيئي، وتحليل الكيمياء الحيوية، أو المجهري. وتصف هذه الورقة الإرواء والتقنية الجراحية اللازمة لنضح خارج الجسم الحي الكلى الماوس. وترد تفاصيل جهاز نضح وقدمت بيانات تظهر الخامسiability من إعداد والكلى: تدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، والبول بيانات وظيفية، الميكروسكوب الإلكتروني النافذ من شرائح كليون المختلفة وقراءات المورفولوجية، والبقع الغربية من البروتينات نقل شرائح كليون المختلفة وقراءات الجزيئية.

مع طريقة وصفها، يمكن أن الكلى الماوس معزولة لا تزال قابلة للحياة لا يقل عن 1 ساعة. نحن اختبار قابلية الأنسجة بعد 1 ساعة من نضح مستمر مع وظيفية (تدفق الكلوي الدم ومقاومة الأوعية الدموية، وتحليل غازات الدم من التدفق الوريدي، معدل الترشيح الكبيبي، البولية كسور نا + و K + إفراز، والأسمولية البول) والصرفي (الإلكترون انتقال المجهر، تيم) طرق في أربع كلى من wildtype C57BL / 6 الفئران. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء البقع الغربية من البروتينات علامة قمي قطاعات أنبوب صغير مختلفة، مقارنة الكلى perfused معزولة الكلى unperfused من الحيوانات نفسها. في كل التجارب، تم استخدام المستمر نضح الضغط، والحفاظ على ضغط التروية في ~ 100 مم زئبق (الشكل 4). في تلك الكلى، وظل تدفق سائل الإرواء ومقاومة الأوعية الدموية مستقرة على مدى فترة زمنية من 55 دقيقة في 15.6 ± 0.4 مل / دقيقة * غرام من الوزن الكلى و 35 ± 1.0 مم زئبق * دقيقة / مل على التوالي (الشكل 4). انخفاض تدفق سائل الإرواء أو زيادة في المقاومة الوعائية هي معلمة حساسة فيما يتعلق تقليل قابلية الأنسجة وينبغي رصد جميع أنحاء نضح بعناية. كشفت غازات الدم والتحليل بالكهرباء في 100 عينة ميكرولتر أخذ 60 دقيقة بعد بداية التروية الكلوي CO 2 الإنتاج والاستهلاك O 2، عندما تمت مقارنة تدفق الدم إلى تدفق الوريدي (الجدول 2). ظلت العوامل الأخرى على حالها بين الشريان والوريد (الجدول 2). وينبغي التركيز بشكل خاص على دون تغيير إطلاق البوتاسيوم وريدي، كما قد يحدث ارتفاعا خلال تلف الأنسجة. معدل الترشيح الكبيبي، وتقييمها، عن طريق إزالة FITC-سكري 14، تميل إلى زيادة مع مرور الوقت (الشكل 4 ب) ولكن هذا الاتجاه لم يصل إلى مستوى مهم. إفراز كسور من الصوديوم والبوتاسيوم تقييم بعد 55 دقيقة من نضحيتم زيادة مقارنة بالوضع في الجسم الحي (الشكل 4 C). لم يتم رفع البول الأسمولية فوق الأسمولية من تدفق الوريدي بعد 55 دقيقة من نضح (الشكل 4 D). الدراسات المورفولوجية، كانت ثابتة الكلى بعد نضح في 3٪ امتصاص العرق و 0.1٪ غلوتارالدهيد في المخزن غسيل الكلى كما هو موضح سابقا (17). تم تقييم التركيب الدقيق الكلوي مع تيم. ظهرت الكبيبات وS1 شرائح الأنابيب القريبة دون تغيير إلى حد كبير بعد التروية (الشكلان 5 ألف وباء). بعض، ولكن ليس كل شرائح S2 / S3 من الأنابيب القريبة والأطراف تصاعدي سميكة التي لم تكن قريبة من الحزم الوعائية كانت تظهر علامات للتلف الجهاز، كما هو موضح سابقا في الفئران المعزولة الكلى perfused 5 (الشكلان 5 C و D). حتى على تفتيش قريبة، لم الأنابيب الملتوية البعيدة وجمع القنوات لا تظهر علامات واضحة للنخر (الأرقام 5 E، F، G و). في الختام، النتائج الشكلية في الكلى الماوس تعكس الوضع الموجود في الجرذان عزل الكلى perfused 5. البقع الغربية من البروتينات علامة قمي للقطاعات كليون مختلفة في الكلى perfused معزولة (المجمدة المفاجئة بعد 1 ساعة من نضح) مقارنة الكلى المقابل unperfused من نفس الحيوان (المفاجئة المجمدة قبل بداية نضح) لم يكشف عن تغيرات كبيرة. درسنا نابي-IIA (الموجود في الأنابيب القريبة)، NKCC2 (أطرافه تصاعدي سميكة)، NCC (الأنابيب الملتوية البعيدة)، وعناق (ربط الأنابيب / جمع مجاري) (شكل رقم 6 A و B). <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig4.jpg" /> الشكل 4: تقييم الجدوى الوظيفية للكلى Perfused لمدة 55 دقيقة. أ) &lt;/ قوي&gt; وخلال نضح الضغط المستمر، ومقاومة الأوعية الدموية وتدفق سائل الإرواء ظلت مستقرة لمدة 55 دقيقة. يتم استبعاد 15 دقيقة الأولى بسبب التباين الشديد ينظر دائما خلال هذه الفترة. ب) عرض الكبيبي معدل الترشيح (FITC-سكري) أربع كلى تقييمها بعد 25 و 55 دقيقة زيادة كبيرة طفيفة ولكن ليس مع مرور الوقت. C) إفراز كسور من الصوديوم والبوتاسيوم تقييم بعد 55 دقيقة من نضح. D) البلازما الوريدي والبول الأسمولية بعد 55 دقيقة من نضح. ن = 4 في جميع التجارب. وتعرض البيانات على النحو يعني ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig5.jpg" /> الرقم 5: نقل المجهر. ممثل مورفولوجية D<html> قطاعات ifferent كليون من Perfused الكلى عند نقطة نهاية 1 ساعة. أ) الكبيبات هي سليمة. التفاصيل من خلية رجلاء في الكبيبة. جزء B) S1 من أنبوب صغير القريبة. شرائح S1 سليمة. الجزء ج) S2 / S3 من أنبوب صغير القريبة. بعض، ولكن ليس كل شرائح S2 / S3 من الأنابيب القريبة هي الميتة غاية. خلايا تظهر منتفخة وتظهر الأضرار داخل الخلايا الكبيرة. تم الإبقاء على مخطط أنبوبي إلا عن طريق الغشاء القاعدي. D) أطرافهم تصاعدي سميكة (TAL). تلك TALs التي هي بعيدة كل البعد عن الحزم الوعائية تظهر أولى علامات انحطاط مائي. الأغشية اللمعية تبدو ضعيفة وهشة. E) البعيدة نبيب الملتوية (DCT). DCTs سليمة. F) التفاصيل من infoldings basolateral من خلية DCT. منوفذة البطانة، الغشاء القاعدي، infoldings basolateral، والميتوكوندريا سليمة. G) جمع مجاري الهواء (CD). الأقراص المدمجة سليمة.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig6.jpg" /> الشكل 6: البقعة الغربية من قمي ماركر البروتينات في الكلى Perfused المعزولة بالمقارنة مع Unperfused الكلى من الحيوانات نفسها. أ) البقع الغربية الكلى perfused لمدة 1 ساعة والكلى unperfused. نابي-IIA هو ممثل للنبيب الداني. NKCC2 هو ممثل لطرف تصاعدي سميكة. فسفرته NCC وNCC في ثريونين 53 (pT53 NCC) ينحصر وجودها في أنبوبة ملتوية بعيدة. وترد ألفا وجاما مفارز عناق في الطول الكامل وكل منتجاتها المشقوق proteolytically ممثل لربط أنبوب صغير / جمع مجاري الهواء. B) الكمي لأ) لم تكشف عن فروق ذات دلالة إحصائية بين و الكلى perfusedأو 1 ساعة والكلى unperfused. ن = 3 في جميع التجارب. وتعرض البيانات على النحو يعني ± ووزارة شؤون المرأة وتظهر القيم الفردية. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl1.jpg" /> الجدول 1: تكوين حلول وغسيل الكلى العازلة. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54712/54712tbl1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.</a> <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl2.jpg" /> الجدول 2: غازات الدم والتحليل بالكهرباء من الشرايين تدفق وتدفق الوريدي من Perfused ماوس الكلى 60 دقيقة بعد بداية الإرواء (ن = 4). وتعرض البيانات على النحو يعني ±ووزارة شؤون المرأة.

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique at JoVE.com

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. ويرد في مخازن وتقنية جراحية في التفاصيل.

الماوس معزولة تقنية الكلى Perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

21.7K Views.  University of Zürich.  الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. ويرد في مخازن وتقنية جراحية في التفاصيل. 

Video: The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

استخدام نظام تعليق الوزن المعزولة عن انسداد الشريان الكلوي

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Medicine

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Biochemistry

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kidney diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in the permeability barrier comprised of podocytes, vascular endothelial cells, and a basement membrane working in unison. Data from our laboratory using intravital 2-photon microscopy revealed a more permeable glomerular filtration barrier (GFB) than previously thought under physiologic conditions, with retrieval of filtered albumin occurring in an early subset of cells called proximal tubule cells (PTC)1,2,3.
Previous techniques used to study renal filtration and establishing the characteristic of the filtration barrier involved micropuncture of the lumen of these early tubular segments with sampling of the fluid content and analysis4. These studies determined albumin concentration in the luminal fluid to be virtually non-existent; corresponding closely to what is normally detected in the urine. However, characterization of dextran polymers with defined sizes by this technique revealed those of a size similar to serum albumin had higher levels in the tubular lumen and urine; suggesting increased permeability5.
Herein is a detailed outline of the technique used to directly visualize and quantify glomerular fluorescent albumin permeability in vivo. This method allows for detection of filtered albumin across the filtration barrier into Bowman's space (the initial chamber of urinary filtration); and also allows quantification of albumin reabsorption by proximal tubules and visualization of subsequent albumin transcytosis6. The absence of fluorescent albumin along later tubular segments en route to the bladder highlights the efficiency of the retrieval pathway in the earlier proximal tubule segments. Moreover, when this technique was applied to determine permeability of dextrans having a similar size to albumin virtually identical permeability values were reported2. These observations directly support the need to expand the focus of many proteinuric renal diseases to included alterations in proximal tubule cell reclamation.

A technique utilizing high resolution intavital 2-photon microscopy to directly visualize and quantify gloemrular filtration in surface glomeruli. This method allows for direct determination of permeability characteristics of macromolecules in both normal and diseased states.

قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Immunology and Infection

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

ميكروديسيكشن شرائح الأنسجة الكلوية الأولية، وإدماج مع تكنولوجيا بناء رواية خالية من السقالة

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Bioengineering

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

A Quantitative Detection Method for MicroRNAs in the Kidney of an Ischemic Kidney Injury Mouse Model

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, standard protocols for the purification of miRNAs and detection of their expression in the kidneys of acute kidney injury (AKI) mice have not been well established. This study developed an effective and simple protocol to purify and quantify miRNAs in the kidneys of an AKI mouse model induced by renal ischemia-reperfusion using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol comprises five steps: 1) induction of AKI by renal ischemia-reperfusion, 2) harvesting of kidneys, 3) purification of total RNA, including miRNAs, from kidneys, 4) cDNA synthesis by reverse transcription of miRNA, and 5) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, the renal ischemia-reperfusion injury model can be generated with mild to severe forms of AKI. Additionally, if the procedure is followed properly, a consistent AKI model with minimal individual differences can be obtained. This qRT-PCR assay shows a very wide dynamic range and enables the discrimination of mature miRNAs, which can be accurately quantified with high specificity. This protocol can be used to study the miRNA expression profile in AKI kidneys.

<meta charset="utf8"></head><body>طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

This article presents a protocol for detecting microRNA expression in the kidneys of an acute kidney injury mouse model using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This protocol emphasizes an ischemic kidney injury mouse model and the careful extraction of microRNA samples.

طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

MicroRNAs (miRNAs) are involved in various disease states and are effective biomarkers for the early diagnosis of diseases and treatment in mice. However, ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

عزل والتصوير لايف، سليمة مناطق منظم ضربات القلب من الحوض الكلوي الماوس عن طريق تقسيم الهزاز

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Source: Eymael, J. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/60324" target="_blank">Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

عزل الكبيبات: تقنية للحصول على كبيبات سليمة من كلية الفئران

Source: Eymael, J. et al. Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation. J. Vis. Exp. ...

الماوس معزولة تقنية الكلى Perfused

Summary

Explore More Videos

استخدام نظام تعليق الوزن المعزولة عن انسداد الشريان الكلوي

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار

موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية

ميكروديسيكشن شرائح الأنسجة الكلوية الأولية، وإدماج مع تكنولوجيا بناء رواية خالية من السقالة

التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

عزل والتصوير لايف، سليمة مناطق منظم ضربات القلب من الحوض الكلوي الماوس عن طريق تقسيم الهزاز

عزل الكبيبات: تقنية للحصول على كبيبات سليمة من كلية الفئران