Siamo grati a Annika Engbers e Frank Kurth per il loro eccellente supporto tecnico e il Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) per le discussioni utili per quanto riguarda le misure teer. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 progetto A03 di HW e LK, CRC TR128, progetti A08; Z1 e B01 LK e HW, e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (Facoltà di Medicina di Münster) codice di autorizzazione KL2 / 2015/14 a LK.

Per tutti gli esperimenti, i topi sono stati allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni nella struttura animali centrale presso l&#39;Università di Münster, secondo le linee guida tedesche per la cura degli animali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida del comitato etico degli animali sperimentali e approvati dalle autorità locali del Nord Reno-Westfalia, Germania (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolamento e la coltura NOTA: isolare MBMECs come precedentemente descritto in dettaglio 14 con le seguenti modifiche: <ol><li> Sacrificio 20 adulti C57BL 6 topi / (6-8 settimane) da CO 2 inalazione e confermare la loro morte per accertare arresto cardiaco e respiratorio. </li><li> Risciacquare il mouse con il 70% di etanolo e decapitare usando le forbici; rimuovere il cuoio capelluto con pinze e forbici. Fare incisioni sul lato destro e sinistro del cranio, partendo dal foro occipitale. Sollevare il cranio dal suo lato caudale e takvia e fuori il cervello con una pinza. </li><li> Sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare pinze sterili per posizionare il cervello in una capsula di Petri e rimuovere il tronco cerebrale, cervelletto, e talamo, mantenendo solo la corteccia. NOTA: L&#39;uso di un microscopio non è necessario per uno di questi passaggi. </li><li> Posizionare la corteccia su un pezzo di carta assorbente sterile occidentale e rotolare delicatamente con una pinza fino meningi non sono più visibili. </li><li> Dopo la digestione enzimatica e meccanica (seguendo il protocollo 14), raccogliere le cellule endoteliali dal gradiente di densità utilizzando un lungo ago sterile ed uno stantuffo 5 ml. Le cellule endoteliali appaiono come uno strato torbido sopra l&#39;anello rosso con eritrociti. Trasferimento 20-25 ml di questo strato in un nuovo tubo 50 ml centrifugazione; rabboccare il tubo con DMEM. </li><li> Dopo due turni di lavaggio 14, sospendere nuovamente le cellule in 6 ml di mezzo MBMEC contenente puromicina (4 mg / ml) e seminare su sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti; lasciarli in un tessutocultura incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 (indicato come &#39;incubatore&#39; da qui in) per tre giorni. NOTA: Per i dettagli della soluzione di rivestimento MBMEC, vedi Materiali Tavolo. </li><li> Modificare il medium con l&#39;aggiunta di 1 ml a ciascun pozzetto di mezzo fresco MBMEC senza puromicina; mettere la piastra posteriore a 37 ° C e 5% CO 2 per altri due giorni. </li></ol> 2. La raccolta MBMECs <ol><li> Al quinto giorno dopo l&#39;isolamento MBMEC, pre-coat inserti permeabili con soluzione di rivestimento MBMEC: aggiungere 80 ml di soluzione per inserto e li lasciano a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3 ore. </li><li> pipetta con attenzione la soluzione di rivestimento e lasciare che il inserti asciugare per 30 minuti. Aggiungere 2 ml di temperatura ambiente (RT) PBS a ciascun pozzetto della piastra, utilizzando MBMECs per lavare il mezzo; ripetere questo passaggio. Aggiungere 0,05% tripsina-EDTA (300 ml per pozzetto) e lasciare la piastra nell&#39;incubatore per 5-10 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno MBMEC a ciascun pozzetto per arrestaretripsinizzazione. Trasferire le cellule raccolte in una provetta da 15 ml centrifugazione e centrifugare a 700 xg per 8 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno MBMEC senza puromicina. </li><li> Contare le cellule; mescolare 10 ml di sospensione cellulare con 90 ml di 0,04% Trypan Blue (10x diluizione delle cellule). Pipettare 10 ml di questo mix tra la copertura in vetro e la camera di conteggio delle cellule (emocitometro). Contare le cellule blu-libere Trypan nei quattro quadranti della camera (N) e determinare il numero medio di cellule contate (N &#39;) come segue: N&#39; = N / 4. </li><li> Calcolare la concentrazione cellulare (10 6 cellule / ml), utilizzando la seguente formula: C = N &#39;x 10 4 x 10, dove 10 4 è dato dalle dimensioni del emocitometro e 10 è il fattore di diluizione dal punto 2.4. </li><li> Seed 2 x 10 4 cellule in un volume di 260 microlitri per inserto. Aggiungere 810 pl di mezzo MBMEC al vano inferiore di ogni pozzetto. Posizionare la piastra con inserti in incubatrice fino al momento di procedere con la sezione 4. NOTA: I volumi per il vano superiore e inferiore sono specifici di inserimento e non funzionano per tutti i formati da 24 pozzetti. </li></ol> 3. CD4 + T cellule Isolamento e stimolazione <ol><li> L&#39;isolamento delle cellule T CD4 + <ol><li> Sacrificare un topo adulto (6-8 settimane) da CO 2 inalazione e confermare la sua morte per accertare arresto cardiaco e respiratorio. </li><li> Posizionare il mouse sul dorso su una tavola di dissezione pulito e risciacquare con etanolo al 70%; usare le forbici e pinze sterili per aprire il peritoneo e rimuovere i milza e nei linfonodi inguinali (, ascellare, brachiale e cervicale); infine, trasferire il tessuto in una provetta da 15 ml centrifugazione contenente 5 ml di PBS in ghiaccio. </li><li> Sotto la cappa a flusso laminare, trasferire il tessuto per decantazione PBS con il tessuto in un tubo di centrifugazione 50 ml con un filtro 70 micron cella sopra; omogeneizzareil tessuto premendo con un pistone 1 ml attraverso il filtro. </li><li> Aggiungere 30 ml di tampone FACS e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di tampone FACS. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cella 40 micron, aggiungere altri 20 ml di tampone FACS al tubo. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 ml di tampone FACS. </li><li> Aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche topo CD4, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Aggiungere 25 ml di tampone FACS e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Nel frattempo, posizionare una colonna di separazione LS nel magnete e sciacquarlo con 3 ml di tampone FACS. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di tampone FACS. </li><li> Aggiungere cellule alla colonna. Lavare la colonna con 3 ml di tampone FACS per tre volte. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarlo su un nuovo 15 ml Centritubo fugation. Aggiungere 5 ml di tampone FACS, scovare le cellule marcate con lo stantuffo della colonna e centrifugare è a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di terreno delle cellule T. Contare le cellule come descritto in 2.4 e sementi 1 x 10 5 cellule in 100 microlitri di terreno per pozzetto. </li></ol></li><li> T CD4 + cellule Stimolazione <ol><li> La stimolazione delle cellule T CD4 policlonale + <ol><li> Pre-coat una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo con purificato anticorpo anti-topo CD3 (clone 145-2C11) in PBS ad una concentrazione finale desiderata. Ad esempio, per pre-coat il piatto pieno con α-CD3 a 1 mg / ml, mescolare 10 ml di anticorpi (magazzino di concentramento = 0,5 mg / ml) con 5 ml di PBS, vortice e aggiungere 50 ml di mix di ogni pozzetto con una pipetta multicanale. </li><li> Lasciare la piastra nell&#39;incubatore per 3 ore. Dopo isolare le cellule T, lavare la piastra pre-rivestita due volte con PBS. Aggiungere purificato anticorpo anti-CD28 (clone37.51) alle cellule T isolate ad una concentrazione finale desiderata (ad esempio, a 1 mg / ml); mescolare bene. Seme le cellule T e lasciarli in incubatrice per due o tre giorni. </li></ol></li><li> La stimolazione delle cellule T CD4 + antigene-specifiche con le cellule dendritiche (DC) NOTA: se le DC sono utilizzati come cellule presentanti l&#39;antigene (APC), seguire il protocollo per l&#39;isolamento delle cellule T, con le seguenti eccezioni: <ol><li> Prima di omogeneizzare la milza, iniettarla con 1 ml di Collagenasi tipo IA in PBS a 0,5 mg / ml e trasferirlo ad un tubo di centrifugazione 15 ml. </li><li> Incubare a bagnomaria a 37 ° C per 15 min. Dopo il lavaggio con PBS, risospendere il pellet in tampone FACS e aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche del mouse CD11c, invece di microsfere CD4. </li><li> Utilizzare una colonna di separazione MS ei volumi appropriati: lavare la colonna con 1 ml di tampone FACS; Risospendere le cellule in 1 ml di tampone FACS e lavare la colonna con 1 ml di FACS buffer di tre volte. </li><li> Anno Dominid antigene di scelta ai PVS (ad esempio, la mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) aa 35-55 a 20 mg / ml), mescolare bene e di semi di 5 x 10 4 cellule in 100 ml di terreno di coltura delle cellule T a 96-round-bottom bene. </li><li> Aggiungere 1 x 10 5 cellule T in 100 ml di mezzo di coltura cellulare T per 96-round-bottom-bene alla fine, come descritto nel protocollo per T isolamento delle cellule. </li></ol></li><li> La stimolazione delle cellule T CD4 + antigene-specifiche con le cellule B NOTA: se le cellule B sono usati come APC, seguire il protocollo per l&#39;isolamento delle cellule T, con le seguenti eccezioni: <ol><li> Utilizzare la milza di topi transgenici le cui cellule B sono l&#39;antigene-specifica (ad esempio, IgH MOG (Th) i topi, le cui cellule B specificamente riconoscere MOG 35-55). </li><li> Utilizzare cellule T antigene-specifiche (ad esempio, da TCR MOG (2D2) topi). Aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche topo CD19 invece di microsfere CD4. </li><li> Aggiungere l&#39;antigene di scelta al cel BLS (ad esempio, MOG 35-55 a 20 mg / ml), mescolare bene e di semi di 5 x 10 4 cellule in 100 ml di B mezzo di coltura cellulare per 96-round-bottom-bene. </li><li> Aggiungere 1 x 10 5 T cellule in 100 ml di terreno di coltura delle cellule T per 96-round-bottom-bene, come descritto nel protocollo per l&#39;isolamento delle cellule T. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Configurazione ed esecuzione di misura TEER <ol><li> Posizionare il modulo 24 pozzetti dello strumento TEER sotto cappa a flusso laminare. Togliere i coperchi e luogo inserti con MBMECs nello strumento con pinze. </li><li> Pipettare 810 ml di mezzo fresco al vano inferiore dei pozzetti modulo: inserirlo attenzione tra l&#39;inserto e la parete del modulo bene. </li><li> Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento in incubatrice. Collegare lo strumento al suo calcolatore; accendere il controllore strumento e aprire il software. </li><li> Seleziona &#39;nuova misura&#39; nella finestra pop-up. Check &#39;show TEER&#39; e scatole di &#39;show Ccl&#39;; quindi premere &#39;start&#39;. Dopo aver completato la prima misurazione, selezionare &#39;controllare tutti i pozzetti&#39; nella scheda &#39;risultati&#39; per vedere tutti i valori Teer e CCL. </li><li> Salvare il file: File&gt; Salva con nome&gt; &#39;il nome del file&#39;. NOTA: Come TEER e Ccl sono continuamente misurati in modo automatico, monitorare i loro valori per un periodo di tre-cinque giorni. Cambiando il mezzo non è necessario, a meno vitalità cellulare è ottimale, come visualizzato dalla mancanza di aumento TEER. </li><li> Scegliere il punto di tempo di co-coltura con cellule T MBMECs quando Ccl è stabile e inferiore a 1 mF / cm 2 e TEER ha raggiunto il livello massimo. </li><li> Ispezionare con cura valori assoluti Teer e CCL ed escludere i pozzi in cui MBMECs non hanno sviluppato confluenti abbastanza monostrati deselezionando tali pozzi. </li><li> Gruppo il resto dei pozzi: tasto destro del mouse su un pozzo e selezionare &#39;aggiungere ben al nuovo pozzo media&#39;. Namvia e nella finestra pop-up; fare lo stesso per tutti i singoli pozzetti da raggruppare. </li><li> Controllare tutti i pozzetti medi per confermare che tutti hanno le stesse condizioni iniziali prima della co-coltura. Se alcuni hanno significativamente diversi valori assoluti TEER o TEER piste, o gli errori standard sono troppo grandi, rifare il raggruppamento. NOTA: Il raggruppamento ottimale dei pozzi fornisce minima variazione nei valori Teer, sia all&#39;interno che tra i gruppi sperimentali. </li><li> Nella scheda &#39;esperimento&#39;, premere &#39;pausa&#39;, scollegare lo strumento e portarlo fuori dell&#39;incubatore. Rimuovere i coperchi sotto cappa a flusso laminare. </li><li> Preparare pre-attivato e / o di cellule T naive, con o senza specifiche citochine, anticorpi o altre sostanze, se lo desideri: Per esempio: Mix purificato NA / Le Rat anticorpi anti-topo IFN-γ (XGM1.2 clone) con preparato T cellule, a 20 ug / ml per pozzetto dello strumento TEER. NOTA: Se si utilizzano sostanze come inibitore granzima B, sono undded di coltura cellulare T all&#39;inizio di stimolazione delle cellule T: ad esempio, Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) viene mescolato con le cellule T isolate ad una concentrazione finale di 10 mM in DMSO. Vedi Materiali e attrezzature per maggiori dettagli. </li><li> Rimuovere alcuni del mezzo dall&#39;inserto (vano ben superiore): per esempio, con attenzione pipetta fuori 150 ml (rimuovendo tutto il supporto deve essere evitata in quanto potrebbe disturbare il monostrato MBMEC). </li><li> Aggiungere cellule T di MBMECs pipettando con cautela 150 ml di mezzo contenente 2 x 10 5 cellule / inserto. NOTA: quando la raccolta delle cellule pre-attivate T, contare solo brillamento, le cellule Trypan Blue-free. </li><li> Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento per l&#39;incubatore. Ricollegare lo strumento e premere &#39;la misura di ripresa&#39;. Dopo 24 ore, premere il tasto &#39;stop&#39; nella scheda &#39;esperimento&#39; e salvare il file (File&gt; Salva). </li></ol> 5. Esporta dati e l&#39;analisi statistica <ol><li>Esportare i risultati scegliendo File&gt; Esporta. </li><li> Nella scheda &quot;Impostazioni&quot; della finestra pop-up, selezionare &quot;dot&quot; nell&#39;opzione &quot;separatore decimale&quot; e &quot;tabulatore&quot; nell&#39;opzione &quot;campo delimitatore&quot;. </li><li> Nella scheda &quot;risultati di esportazione&quot;, il nome del file, controllare tutti i pozzi da esportare, e selezionare le caselle &quot;Ccl&quot; &quot;TEER&quot; e l&#39;opzione &quot;scegliere i dati&quot;. </li><li> Premere il tasto &quot;i dati di esportazione&quot;, aprire il file esportato, e copiare i dati in un foglio di calcolo. </li><li> Normalizzare i dati esportati (ordinati per ogni replica, con Teer e CCL valori dati per ogni ciclo (di misura)): i valori Set Teer e CCL dell&#39;ultimo punto di tempo prima che il co-coltura al 100% e modificare di conseguenza i valori per tutti gli altri piste, relative al periodo &#39;100%&#39;. </li><li> Copiare dati normalizzati ad un software di scelta per generare un grafico, utilizzando singoli pozzetti e visualizzando l&#39;errore standard della media per ciascun gruppo di trattamento. </li><li> Perfo rm a due vie test statistico ANOVA con una correzione di Bonferroni per confronti multipli, utilizzando il software statistico di scelta. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

Diverse fasi del protocollo descritto sono essenziali per un esperimento riuscito. Durante l&#39;isolamento MBMEC iniziale e cultura, è essenziale che il lavoro viene effettuato in condizioni sterili per quanto possibile, per evitare la contaminazione della coltura cellulare con spore fungine o batteri. Per ottenere una coltura pura di EC, si raccomanda di utilizzare un supporto contenente puromicina per i primi tre giorni, che consente la sopravvivenza di cellule endoteliali, ma non altri tipi di cellule (in particola...

La barriera emato-encefalica separa la circolazione sistemica del sistema nervoso centrale (CNS) 1 - 3. Esso fornisce una barriera fisica che inibisce la libera circolazione delle cellule e la diffusione delle molecole idrosolubili e protegge il cervello da agenti patogeni e sostanze potenzialmente nocive. Oltre alla sua funzione di barriera, la BBB consente la fornitura di ossigeno e nutrienti al parenchima cerebrale, che garantisce il corretto funzionamento del tessuto neuronale. Proprietà funzionali del BBB sono altamente regolamentati dai suoi componenti cellulari e acellulari, con EC altamente specializzato essendo il suo elemento strutturale principale. EC della BBB sono caratterizzati dalla presenza di giunzioni strette (TJ) complessi, la mancanza di finestrature, estremamente bassa attività pinocytic, e meccanismi di trasporto permanentemente attivi. Altri componenti della BBB membrana basale CE, periciti incorporamento l&#39;endotelio, i piedi di fascia astrocitari e = par associatienchymal membrana basale contribuiscono allo sviluppo, la manutenzione e la funzione della BBB 2,4 - 6 e, insieme con i neuroni e microglia, formano l&#39;unità neurovascolare (NVU), che permette il corretto funzionamento del CNS 7 - 9. In una varietà di malattie neurologiche, come neurodegenerative, malattie infiammatorie o infettive, la funzione della BBB è compromessa 2,5,10. Disregolazione di TJ complessi e meccanismi di trasporto molecolari porta ad un aumento della permeabilità BBB, leucociti stravaso, infiammazione e danno neuronale. Al fine di studiare le proprietà di BBB in tali condizioni fisiopatologiche, vari modelli BBB in vitro sono stati stabiliti 9,11,12. Insieme hanno fornito preziose informazioni sui cambiamenti di integrità della barriera, la permeabilità così come meccanismi di trasporto. Questi modelli utilizzano cellule endoteliali di umano, topo, ratto, suina o bovina 13 - 18; cellule endoteliali primarie o linee cellulari sono coltivate sia come monocoltura o insieme con periciti e / o astrociti in modo da imitare più da vicino la BBB in vivo 19 SpA - 25. Negli ultimi anni, la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) è diventato uno strumento ampiamente accettata per valutare le proprietà barriera endoteliale 26,27. TEER riflette l&#39;impedenza al flusso di ioni attraverso il monostrato cellulare e la sua diminuzione fornisce una misura sensibile compromissione dell&#39;integrità barriera endoteliale e quindi aumento della permeabilità. Sono stati sviluppati diversi sistemi di misurazione Teer, tra cui epiteliale Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato elettrico impedenza di rivelazione (ECIS), e l&#39;analisi delle cellule in tempo reale 15,28 - 30. TEER riflette la resistenza al flusso di ioni tra EC adiacenti (percorso paracellulare) ed è direttamente proporzionale allaintegrità della barriera. In spettroscopia di impedenza 27,31, impedenza totale complesso (Z) è misurata, che fornisce ulteriori informazioni sulla integrità della barriera misurando Ccl. Ccl riferisce alla corrente capacitiva attraverso la membrana cellulare (percorso transcellulare): lo strato di cellule agisce come un condensatore nel circuito elettrico equivalente, separando le cariche su entrambi i lati della membrana ed è inversamente proporzionale alla integrità della barriera. Quando coltivate su inserti permeabili, EC aderire, proliferano e si sviluppa su la membrana microporosa. Questa resiste alla corrente capacitiva sfondo dell&#39;inserto (che si comporta come un condensatore) e porta ad una diminuzione della capacità fino a raggiungere il livello minimo. Questo è seguito dalla istituzione di TJ complessi che sigillare lo spazio tra EC adiacenti. Questo limita il flusso di ioni attraverso il percorso paracellulare, e TEER aumenta fino a raggiungere il plateau. In condizioni infiammatorie, tuttavia, il endotheliAl barriera è compromessa: TEER diminuisce come complessi TJ ottenere perturbato e Ccl aumenta la componente capacitiva dell&#39;inserto sale nuovamente. La nostra misura TEER utilizza il sistema automatizzato di monitoraggio cella 32: segue il principio della spettroscopia di impedenza ed estende le sue applicazioni precedenti. Qui, descriviamo un modello in vitro BBB che consente lo studio delle proprietà barriera, compresa l&#39;interazione di endotelio cervello con cellule immunitarie; in particolare le cellule T attivate. Tali condizioni fisiopatologiche sono osservate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale, come la sclerosi multipla e il suo modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale 33-37. Qui, un passo fondamentale è la trasmigrazione delle cellule T specifiche per mielina encefalitogenici in tutto il BBB. Questo è seguito dal loro riattivazione nello spazio perivascolare e l&#39;ingresso nel parenchima cerebrale, ove reclutano altre cellule immunitarie e mediato infiammazione e conseguente demielinizzazione 1,35,38. Tuttavia, i meccanismi molecolari dell&#39;interazione tra tali cellule T e le cellule endoteliali, i costituenti principali della BBB, non sono ben compresi. Il nostro protocollo ha lo scopo di colmare questa lacuna e dare nuove intuizioni le conseguenze sulle cellule endoteliali (vale a dire, l&#39;integrità barriera e permeabilità), al loro contatto diretto e complessa interazione con le cellule T attivate. Il protocollo qui descritto fa uso di cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo primaria, coltivate come un monostrato su inserti permeabili con membrane microporose. Le cellule endoteliali sono co-coltura con cellule T CD4 +, che può essere pre-attivati sia policlonale o in maniera antigene-specifica. Co-cultura MBMECs con cellule pre-attivate, ma non naive T induce una diminuzione TEER e un aumento Ccl, che fornisce una misura quantitativa della MBMEC erettile e barriera interruzione. La tecnicanon è invasivo: utilizza built-in, invece di elettrodi bacchette, che impediscono principali disturbi del monostrato CE; esso può essere utilizzato per monitorare funzione barriera senza l&#39;uso di marcatori cellulari. Rende misurazioni continue in modo automatico e consente una valutazione indipendente dei due parametri barriera (Teer e CCL) contemporaneamente nel corso del tempo. Il metodo è anche abbastanza sensibile per distinguere tra diversi livelli di attivazione delle cellule T e gli effetti di tali cellule T su EC. Esso può essere utilizzato in una vasta gamma di saggi funzionali: diverse citochine e / o chemochine implicati in processi infiammatori possono essere aggiunti al co-coltura delle MBMECs e le cellule T; bloccanti anticorpi contro molecole di adesione cellulare su entrambi CE o parte delle cellule T possono essere utilizzati; e inibitori di marcatori di attivazione delle cellule T o delle loro proprietà citolitica possono essere aggiunti durante il priming di cellule T o la loro co-coltura con cellule endoteliali. Il saggio è utile anche per la trasmigrazione cellule Tsaggi, come può servire come un controllo di qualità dell&#39;integrità monostrato MBMEC prima dell&#39;aggiunta di cellule T. Tutto questo rende questo metodo uno strumento versatile e affidabile per studiare la BBB in vitro, con una particolare attenzione per l&#39;effetto delle cellule T attivate sull&#39;integrità monostrato CE. Questo è di particolare importanza per la comprensione dei meccanismi della perturbazione BBB nella patogenesi delle malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla e il suo modello animale EAE, dove, le cellule T encefalitogenici autoreattive attraversare la BBB e causano infiammazione e danno neuronale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>cellZscope</td>
			<td>nanoAnalytics GmbH</td>
			<td>www.nanoanalytics.com</td>
			<td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
			<td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>www.beckmancoulter.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo7.6.5 software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td>www.flowjo.com</td>
			<td>for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml; for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>for TEER measurement as the main readout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650 180</td>
			<td>flat-bottom; for MBMEC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>round-bottom; for immune cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OctoMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>for T cell and B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD4 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td>for CD4+ T cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD19 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-201</td>
			<td>for B cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse CD11c MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-001</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>for MBMEC coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2 (CSL2)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase (C/D)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-1L</td>
			<td>for MBMEC isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (+ GlutaMAX)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td>for MBMEC and immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>for MBMEC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833</td>
			<td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>for harvesting MBMECs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9891</td>
			<td>for dendritic cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>for immune cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM + 1% L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21980-032</td>
			<td>for T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE04-418Q</td>
			<td>protect from light; for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>for B cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse MOG35&#8212;55 peptide</td>
			<td>Biotrend</td>
			<td>BP0328</td>
			<td>for antigen-specific T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified anti-mouse CD3 Ab</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100302</td>
			<td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553294</td>
			<td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-05</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td>for T-cell transmigration assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&#947; antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554408</td>
			<td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granzyme B Inhibitor II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>368055</td>
			<td>recommended final concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116005</td>
			<td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

La figura 1 fornisce una panoramica generale del modello in vitro di BBB utilizzato per studiare l&#39;interazione tra cellule T e le cellule endoteliali. L&#39;esperimento consiste di tre fasi principali. Il primo passo è l&#39;isolamento di MBMECs primari da cortecce cerebrali, e la loro cultura per cinque giorni. Quando raggiungono confluenza nella piastra di coltura cellulare, MBMECs vengono tripsinizzate e reseeded su inserti permeabili, che sono successiv...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.1K Views.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro per valutare l&#39;impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Sviluppo di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modello per studiare l&#39;interazione tra<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.