The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.

1. Preparazione di sodio Naphthalenide Attivazione Solution e attivazione della superficie Nota: Effettuare reazioni in una cappa aspirante ben ventilata. Seguire le regole generali per la gestione dei solventi altamente infiammabili e metalli corrosivi come il sodio metallico. Naftalene ha un odore molto sgradevole (naftalina), anche in quantità molto piccole! Se non indicato diversamente reazioni vengono eseguite a temperatura ambiente. La sodio azide è altamente tossico! THF (99,9%, vedi Elenco dei materiali) è stato immagazzinato in circa il 20% (in volume) setaccio molecolare. Distillare THF con un contenuto d&#39;acqua evidente nel corso di sodio. La formazione di naphthalenide di sodio non si verifica se sono presenti tracce di acqua. <ol><li> Ad una soluzione di 1,4 g (10,9 mmoli) di naftalene in 20 ml di tetraidrofurano (THF, essiccato su 3 Å setaccio molecolare), aggiungere 0,25 g (10,9 mmol) di sodio metallico in una bottiglia di vetro da 100 ml con tappo a vite munito di PTFE- rivestito barretta magnetica. Nota: dissoluzionezione può essere notevolmente migliorata tagliando il sodio in piccoli pezzi e riscaldamento modesta (35 - 40 ° C). La soluzione finale ha un colore leggermente verdastro e può essere conservato in condizioni rigorosamente secco. </li><li> Punzonare dischi in PTFE di diametro di 12 mm dal materiale stagnola spessa 0,5 mm. Mark un lato (per esempio, utilizzando una lettera timbro punch) e pulire con iso-propanolo. </li><li> Incubare PTFE-campioni individualmente nella soluzione di attivazione (passo 1,1) per 1 - 2 min utilizzando una pinza. Nota: Il cambiamento di colore dal bianco al marrone scuro indica il successo del trattamento. </li><li> Successivamente lavare due volte con THF e poi con iso-propanolo. Nota: La soluzione naphthalenide si esaurisce quando il suo colore diventa un marrone chiaro acquoso. soluzione naphthalenide non utilizzata (eventualmente contenente sodio metallico) deve essere decomposto aggiungendo lentamente iso-propanolo prima dello smaltimento. </li><li> Ossidare campioni trattati a perossido di idrogeno (30%) contenente il 20% (w / v) di acido tricloroacetico per 3 ore. lavaggiocon acqua e asciugare. La superficie ha ora un leggero aspetto brunastro. Nota: Attivazione e risultato di ossidazione in un drastico aumento della bagnabilità della superficie. Questo risultato è stato esaminato in dettaglio in precedenza 14. </li><li> Trattare i dischi ossidato con il 50% (v / v) diisocianato (HMDI) in THF secco per 2 ore, risciacquare con THF e lasciare asciugare. </li><li> Idrolizzare campioni cuscinetto isocianato in acqua per 2 - 3 ore e secco. Nota: La superficie PTFE ammino-funzionalizzato finale è molto più stabile rispetto ai campioni isocianato-cuscinetto ed è compatibile con molti reticolanti standard per ulteriori accoppiamento. </li></ol> 2. Peptide immobilizzazione <ol><li> Preparare una soluzione di 20% (v / v) dietilenglicol diglicidil etere (diepossido) in 50 mM tampone carbonato, pH 9. </li><li> Posizionare i dischi amminati con il lato contrassegnato singolarmente in una piastra 24 pozzetti e aggiungere 1,5 ml della soluzione di epossido. Garantire la piena copertura dei campioni. Incubare per 2 ore e lavare duevolte con acqua e una volta con tampone carbonato. </li><li> Aggiungere 50 ml di 0,5 mg / peptide ml (ad esempio, RedV) in 50 mM tampone carbonato, pH 9 contenente 0,01% NaN 3, sul fondo dei singoli pozzetti di una 24 piatto fresco bene e attentamente luogo la resina funzionalizzata dischi sottosopra down (cioè, contrassegnata lato giù) sulla goccia della soluzione di peptide. Assicurarsi che lo spazio tra il fondo del pozzo e il disco PTFE è completamente bagnata per capillarità. </li><li> Incubare in una camera umida (per esempio, qualsiasi scatola di plastica richiudibile con un coperchio di chiusura a tenuta) con atmosfera umidificata (posizionando carta velina bagnata sul fondo) per almeno 3 ore o durante la notte. Nota: Anche se il motivo RedV può essere considerata come ben caratterizzato, una sequenza aminoacidica scrambled o inversa può essere incluso come controllo negativo aggiuntivo. </li><li> Lavare tre volte con acqua e sterilizzare in 50% iso-propanolo / acqua per almeno 30 min. Prima di cella semina, rinsvia e campioni in sterile tampone fosfato salino (PBS). </li></ol> 3. cellulare Semina <ol><li> Grow HUVECs utilizzando le procedure standard di coltura cellulare 17,18. </li><li> Posizionare i campioni peptide coniugato con il lato le modifiche effettuate fino a un 24 pozzetti. Utilizzare dischi in PTFE non trattati come controllo. </li><li> Seme 5 x 10 4 HUVEC in 2 ml di mezzo per pozzetto ed incubare per 4 ore a 37 ° C e CO 2 5% in un incubatore. </li><li> Rimuovere i dischi, risciacquare con cura per rimuovere le cellule senza legami e trasferire in un piatto fresco 24 bene. Aggiungere 2 ml di mezzo fresco e incubare per il periodo desiderato (ad esempio, 24 ore, 1 w, etc.). Cambiare media ogni due giorni. </li><li> Preparare una soluzione stock di 1 mg / ml calceina-AM in dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Dopo la crescita delle cellule rimuovere il mezzo, lavare con PBS e aggiungere PBS contenente 1 ml / ml calceina-AM macchia (ad esempio, 1 ml di una soluzione madre per ml PBS). Agitare delicatamente e incubate a 37 ° C per 45 minuti al buio. </li><li> Lavare con PBS e prendere immediatamente micrografie su un microscopio a fluorescenza dotato di filtri FITC normali (Ex 488 nm, Em 515 nm). Utilizzare ingrandimento 100 volte. Eseguire triplicato da non modificato così come campioni trattati. </li><li> Utilizzando il software ImageJ determinare l&#39;area colonizzato dalle cellule. In alternativa contare le cellule manualmente o utilizzare ImageJ. Entrambi i metodi daranno informazioni simili su l&#39;attaccamento e la crescita delle cellule sulle rispettive superfici. </li></ol>

<ol>
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V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+LL-37-grafted+titanium+surfaces+with+bactericidal+activity.">Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity.</a> Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).</li><li>Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., F&#246;rch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Plasma+Polymerized+Thin+Films+and+Attachment+of+Biomolecules+to+Influence+HUVEC-Cell+Adhesion.">Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion.</a> Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La descrizione dettagliata del protocollo di modifica della superficie di PTFE costituito da gradini successivi a partire con l&#39;eliminazione del fluoro dalla catena polimerica come illustrato in figura 6. Come risultato, uno strato è formato che contiene una quantità abbondante di doppi legami coniugati carbonio-carbonio in secondo il colore marrone scuro che si è sviluppato in seguito al trattamento naphthalenide. ossidazione standard con perossido di idrogeno acido si ottiene una superficie idrossilato accompagnato da illuminare per un marrone chiaro, questo riflette la perdita di doppi legami. Questo processo è chiaramente evidenziato mediante spettroscopia IR. Al fine di ottenere una funzionalità più generalmente applicabile, le pendente gruppi-OH sono stati convertiti in amino-funzionalità per semplice trattamento con un diisocianato e successiva idrolisi dei NCO-porzioni di ammine primarie. Questo è favorevole, perché il materiale ammina-cuscinetto possono essere conservati per periodi prolungati, mentre la HIGHLY isocianato reattivo è suscettibile alla presenza di umidità dell&#39;aria. Bisogna fare attenzione a evitare anche di tracce di acqua nella fase di attivazione iniziale e il trattamento HMDI perché sia ​​naphthalenide di sodio e l&#39;isocianato sono altamente suscettibili all&#39;idrolisi. In contrasto con procedure standard in cui il campione è completamente immerso nella soluzione, la presente protocollo richiede solo piccole quantità di reagente. Pertanto questo metodo permette di risparmiare molto peptide costosa. superfici Amine portanti sono punti di partenza ideali per l&#39;accoppiamento di molte biomolecole. Il diepossido impiegato in questo lavoro è interessante sotto vari aspetti: è relativamente poco costoso, idrofila, altamente reattivo nei confronti ammine ed epossidi non reagiti vengono idrolizzati in ambiente acquoso in dioli &quot;fisiologicamente inerti&quot;. reticolanti Homobifunctional sono reagenti adatti in cui un solo gruppo reattivo è presente on il peptide di essere immobilizzato. Questo vale per RedV contenenti un solo singolo ammino-gruppo primario sul N-terminale (questo è lo stesso per i RGDS sequenza di uso frequente). Per peptidi contenenti residui di lisina (con ammine catena laterale) il risultato della coniugazione è ambigua, il che significa che l&#39;accoppiamento corretto non si verifica in un modo definito. In questo caso, una strategia usando i reticolanti eterobifunzionale (ad esempio, quali ammine e tiolo-reattiva) peptidi e cisteina (N- o C-terminale) contenente è utile 18. I risultati di immobilizzazione peptide in termini di adesione cellulare è univoche (figure 3 e 4). Mentre praticamente cellule aderiscono in PTFE nuda, RedV-modifica rende il materiale un ottimo substrato cellulare-adesivo. Complementare al protocollo sopra citato lavoro preliminare dimostrano che questa tecnica è applicabile anche su poroso (espanso) PTFE con risultati simili (Figura 5 </strong&gt;). Questo è di particolare interesse perché questo è innesti vascolari materiali sono costituiti. Contrariamente alla superficie tecniche che maggiormente fanno uso di trattamento al plasma (plasma di attivazione 13, plasma polimerizzazione 19), questo protocollo fornisce una guida per la modifica covalente di PTFE impiegando prodotti chimici facilmente disponibili e le procedure di laboratorio ed evitando attrezzature altamente sofisticate. Metodologie plasma come plasma reattivo (O 2, NH 3, etc.) e la polimerizzazione plasma non sono applicabili nei costrutti porosi o tubi perché specie reattive (per esempio, radicali) non sono in grado di penetrare queste strutture a causa di inattivazione a contatto con i materiali superficie. Per esempio innesti vascolari di piccolo calibro (diametro &lt;5 mm) non possono essere trattati in questo modo. In contrasto con questo, mediante chimica umida, non vi sono limitazioni per quanto riguarda la forma del dispositivo. In questo modo, consentendo la formazione di un endothstrato Elial sul lato luminale di un innesto vascolare ePTFE, trombogenicità e pervietà a lungo termine può essere migliorata. Inoltre, una superficie adesiva cella per maglie ernia chirurgici dovrebbe tradursi in una migliore integrazione dei tessuti.

Vari polimeri utilizzati in medicina che sono stati approvati per un certo tempo non presentano una maggiore biocompatibilità, vale a dire, la mancanza di cellule-adesività, induzione di incapsulamento fibrotico e trombogenicità, per citarne alcuni. Le interazioni tra il biomateriale ed il sistema biologico si svolge principalmente alla superficie dell&#39;impianto. Di conseguenza, la ricerca si è focalizzata sulla modifica della superficie per creare proprietà appropriate per un&#39;applicazione desiderata lasciando le proprietà di massa del materiale inalterato. Politetrafluoroetilene (PTFE) come polimero fisiologicamente inerte viene utilizzato in molti campi medici quali ernia maglia chirurgica 1, porte medici 2 e, soprattutto, innesti vascolari 3. Soprattutto in situazioni sangue contattando la natura idrofoba di PTFE provoca adsorbimento non specifico di componenti del plasma e, di conseguenza, l&#39;adesione piastrinica, spesso con conseguente thrombotieventi C e l&#39;occlusione del graft 4. Inoltre, PTFE, come la maggior parte dei polimeri, non supporta adesione cellulare e la copertura che sarebbe una caratteristica desiderabile per indurre la formazione di uno strato benefico di cellule endoteliali (EC) sulla superficie interna (luminale) del graft vascolare 5. Un endotelio biomimetica dovrebbe compiere molte delle funzioni del suo equivalente naturali, in particolare le proprietà antitrombogeniche 6. Una strategia generale modifica biomimetica si basa sul concetto di dotare esclusivamente materiale con cella-adesività, lasciando le proprietà materiali sfusi inalterati. Inoltre, l&#39;adesione piastrinica può essere ridotta incorporando antiadesivo (anti-fouling) attributi 7. Vari peptidi - principalmente derivati ​​da proteine ​​della matrice extracellulare - sono stati descritti che fortemente migliorare cell-adesione legandosi ai recettori cellulari, appartenente alla classe delle integrine 8. L&#39;essereesempio st noto a questo proposito è il peptide Arg-Gly-Asp (RGD) che interagisce con la maggior parte dei tipi di cellule. Altre sequenze di aminoacidi sono riconosciuti da integrine espresse esclusivamente su cellule specifiche. Ad esempio, Arg-Glu-Asp-Val (RedV) e Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) sono stati trovati di legarsi a EC in modo specifico 9. Immobilizzazione covalente di tali peptidi è stata effettuata su una pletora di materiali intrinsecamente non adesivi compresi i metalli e polimeri 10,11. PTFE poroso, più precisamente PTFE espanso (ePTFE) - insieme con polietilene tereftalato (PET) - è il materiale più importante per la produzione di innesti vascolari 12. Tecniche fisiche stabilite per trattamenti appropriati, come ad esempio la modifica al plasma 13 o con metodi fotochimici 14, sono ostacolati dal fatto che le strutture porose e / o tubolari non sono facilmente curabili all&#39;interno dei pori o il lume rispettivamente. chimica umidaPTFE è un compito difficile a causa della natura altamente inerte del polimero fluorin contenente che resiste attacchi più chimici 15. In questo articolo si descrive un metodo relativamente facile per una strategia di modificazione covalente. Adattato da un procedimento per rendere bondable PTFE, gruppi funzionali sono stati creati sulla superficie materiali che servono come punti di ancoraggio per ulteriori coniugazione di molecole biologicamente attive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="700">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">PTFE foil 0.5 mm</td>
			<td style="width:119px;">Cadillac Plastic&#160;</td>
			<td style="width:145px;">n/a</td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">REDV peptide</td>
			<td>Genecust</td>
			<td>n/a</td>
			<td>custom synthesis &#62;95 % purity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iso-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tetrahydrofurane (THF)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">molecular sieve 3&#197;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium metal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>483745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">naphthalene</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>147141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hydrogen peroxide 30 %</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>95321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">diethylene glycol diglycidyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hexamethylene diisocyanate (HMDI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcein-AM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 well plates</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>662 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850</td>
			<td>&#160;Nicolet</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fluorescence microscope Olympus X-70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">humbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ePTFE vascular graft</td>
			<td>Gore</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion

Dotando materiali di superficie con proprietà delle celle-adesivo è una strategia comune nel campo della ricerca biomateriale e ingegneria dei tessuti. Ciò è particolarmente interessante per i polimeri già approvati che hanno un uso prolungato in piedi in medicina perché questi materiali sono ben caratterizzate e problemi legali associati con l&#39;introduzione di polimeri di nuova sintesi possono essere evitati. Politetrafluoroetilene (PTFE) è uno dei materiali più frequentemente impiegati per la fabbricazione di protesi vascolari, ma manca il polimero adesione cellulare promuovendo caratteristiche. Endotelizzazione, cioè, una copertura completa degli innesti superficie interna di uno strato confluenti di cellule endoteliali è considerato chiave per prestazioni ottimali, principalmente riducendo trombogenicità dell&#39;interfaccia artificiale. Questo studio indaga la crescita delle cellule endoteliali in PTFE peptide-modificato e confronta questi risultati con quelli ottenuti su substrato non modificato. L&#39;accoppiamento con ilendoteliali adesivo cellule peptide Arg-Glu-Asp-Val (RedV) avviene mediante l&#39;attivazione del polimero fluorin contenente usando l&#39;naphthalenide reagente di sodio, seguita da successive fasi di coniugazione. coltura cellulare viene eseguita utilizzando cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC) e ottima la crescita cellulare su materiale peptide-immobilizzato è dimostrata per un periodo di due settimane.

I risultati dei passaggi cruciali reazioni chimiche sono stati monitorati mediante spettroscopia IR (Figura 1). L&#39;attivazione iniziale con naphthalenide sodio genera doppi legami - e, in misura minore - OH-funzionalità. Il segnale indicativo legami C = C scompaiono per ossidazione, ottenendo una superficie recante quasi esclusivamente idrossile gruppi. L&#39;analisi di ulteriori fasi di coniugazione standard non sono mostrati qui. I cambiamenti di colore dovute all&#39;attivazione ed ossidazione sono in accordo con la chimica prevista utilizzato: sistemi di incollaggio doppi coniugati dovrebbero essere brunastro ei risultati di perdita in illuminante (Figura 2). Inoltre, il possibile risultato di attivazione e ossidazione sulla morfologia superficiale è stato studiato mediante microscopia elettronica a scansione. Praticamente nessun effetto dannoso del trattamento è stato osservato (Figura 2). Figure 3 e 4 mostrano i risultati di RedV-immobilizzazione sulla crescita delle cellule endoteliali. Mentre praticamente nessuna adesione cellulare e la proliferazione si verifica sul materiale non trattato modifica sostiene fortemente la colonizzazione nel corso di un periodo di due settimane. Esemplificato per un&#39;applicazione clinica (cioè, innesti vascolari), la modifica è stata identico eseguita su materiale originale da un innesto commercialmente disponibile in PTFE espanso con risultati simili per un periodo di una settimana (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig1.jpg" /> Figura 1. IR spettroscopia di PTFE. Il trattamento di PTFE incontaminata (A) porta alla formazione di doppi legami e in una certa misura di funzioni idrossi (B). Successivamente C = legami C sono ridotti a causa dell&#39;ossidazione (C </strong&gt;). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig2.jpg" /> Figura 2. aspetto ottico di PTFE attivato nuda e di superficie. (A) considerando che in PTFE non trattata (a sinistra) appare bianco, l&#39;attivazione utilizzando naphthalenide sodio produce un colore bruno scuro (al centro) che è leggermente illuminato su di ossidazione (a destra). Non trattato (B) e ossidato PTFE campioni (C) sono stati inoltre studiati usando la microscopia elettronica a scansione (ingrandimento: 2,000X). I dischi sono 12 mm di diametro. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. la cultura delle cellule endoteliali in PTFE incontaminata e peptidi modificati. Campioni non trattati non sono colonizzate da ECS (A, C, E, dopo 24 ore, 1 w e 2 w, rispettivamente), mentre l&#39;adesione e la crescita su materiale peptide-modificato è notevolmente migliorata (B, D e F, dopo 24 ore, 1 w e 2 w rispettivamente). Barra di scala:. 100 micron, ingrandimento 100X <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig4.jpg" /> Figura 4. Quantificazione di copertura cellulare mediante analisi ImageJ. La crescita cellulare sul nudo PTFE (A, C,E) e sulle superfici polimeriche RedV coniugato (B, D, F) espressi come percentuale di copertura della superficie totale. Peptide immobilizzato permette chiaramente adesione iniziale (B) e supporta la colonizzazione in un periodo di 2 settimane (D, F). Triplice copia determinazioni, media ± deviazione standard). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig5.jpg" /> Figura 5. Le cellule endoteliali coltivate per 1 settimana in PTFE espanso. La struttura di ePTFE è dimostrata utilizzando microscopia elettronica a scansione (A). I risultati ottenuti su materiale poroso sono conformi a quelli ottenuti con campioni PTFE piane. In contrasto con poche cellule trovatesu materiale nudo (B) la superficie modificata (C) costituisce un eccellente substrato per la crescita cellulare. Barre di scala sono 100 micron per A, B e C, rispettivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentazione schematica della modificazione chimica di PTFE utilizzando wet-chimica. Doppi legami generati dal trattamento Na-naphthalenide vengono ossidati conseguente OH funzionalità. Un diisocianato idrossile-reattiva viene poi immobilizzato e idrolizzato ad una ammina. Infine il diepossido bifunzionale viene applicato a coniugare il peptide RedV con il gruppo amminico N-terminale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per v</a>iew una versione più grande di questa figura.

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Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Wet Chimica e Peptide immobilizzazione su politetrafluoroetilene per Miglioramento di adesione cellulare

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

wet-chemistry-peptide-immobilization-on-polytetrafluoroethylene-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.6K Views.  Sidra Cardiovascular Research. Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Ricerca

Bioingegneria

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel cells.1-3 In most bioelectrochemical applications, enzymes or organelles are immobilized onto an electrode surface with the use of some type of polymer matrix. This polymer scaffold should keep the enzymes stable and allow for the facile diffusion of molecules and ions in and out of the matrix. Most polymers used for this type of immobilization are based on polyamines or polyalcohols - polymers that mimic the natural environment of the enzymes that they encapsulate and stabilize the enzyme through hydrogen or ionic bonding. Another method for stabilizing enzymes involves the use of micelles, which contain hydrophobic regions that can encapsulate and stabilize enzymes.4,5 In particular, the Minteer group has developed a micellar polymer based on commercially available Nafion.6,7 Nafion itself is a micellar polymer that allows for the channel-assisted diffusion of protons and other small cations, but the micelles and channels are extremely small and the polymer is very acidic due to sulfonic acid side chains, which is unfavorable for enzyme immobilization. However, when Nafion is mixed with an excess of hydrophobic alkyl ammonium salts such as tetrabutylammonium bromide (TBAB), the quaternary ammonium cations replace the protons and become the counter ions to the sulfonate groups on the polymer side chains (Figure 1). This results in larger micelles and channels within the polymer that allow for the diffusion of large substrates and ions that are necessary for enzymatic function such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). This modified Nafion polymer has been used to immobilize many different types of enzymes as well as mitochondria for use in biosensors and biofuel cells.8-12 This paper describes a novel procedure for making this micellar polymer enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The synthesis of the micellar enzyme immobilization membrane, the procedure for immobilizing enzymes within the membrane, and the assays for studying enzymatic specific activity of the immobilized enzyme are detailed below.

This article will describe the procedure for synthesizing a hydrophobically modified Nafion enzyme immobilization membrane and how to immobilize proteins and/or enzymes within the membrane and test their specific activity.

Idrofobo Salt-modificato Nafion per l&#39;immobilizzazione degli enzimi e la stabilizzazione

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un metodo migliore per la preparazione di tipo I collagene della pelle

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the wet spinning method, gelatin fibers are produced by smooth extrusion in a suitable coagulation medium. To increase the functional surface of these gelatin fibers and their ability to mimic the features of tissues, gelatin can be molded into a tube form by referring to this concept. Examined by in vitro and in vivo tests, the gelatin tubes demonstrate a great potential for application in tissue engineering. Acting as a suitable filling gap material, gelatin tubes can be used to substitute the tissue in the damaged area (e.g., in the nervous or cardiovascular system), as well as to promote regeneration by providing a direct replacement of stem cells and neural circuitry. This protocol provides a detailed procedure for creating a biomaterial based on a natural polymer, and its implementation is expected to greatly benefit the development of correlative natural polymers, which help to realize tissue regeneration strategies.

We developed and describe a protocol based on the wet spinning concept, for the construction of gelatin-based biomaterials used for the application of tissue engineering.

Processo di stampaggio basati su bagnato-filatura di gelatina per la rigenerazione tissutale

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...