Name: wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.

1. הכנת נתרן Naphthalenide הפעלת הפתרון והפעלת Surface הערה: ביצוע תגובות במנדף מאוורר היטב. בצע כללים מקובלים לטיפול ממסים דליקים מאוד ומתכות מאכלות כמו נתרן מתכתי. יש נפטלין ריח מאוד לא נעים (נפטלין), אפילו בכמויות קטנות מאוד! אם לא צוין אחרת תגובות מבוצעות בטמפרטורת חדר. נתרן יזיד הוא רעיל ביותר! THF (99.9%, רואים רשימה של חומרים) אוחסן על כ 20% (לפי נפח) מסננת מולקולרית. זקק THF עם תכולת מים בולט מעל נתרן. ההיווצרות של נתרן naphthalenide אינה מתרחשת אם כמויות זעירות של מים נוכחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי פתרון של 1.4 גר &#39;(10.9 mmol) של נפטלין ב 20 מ&quot;ל tetrahydrofuran (THF, מיובשים במשך 3 מסננת מולקולרית), להוסיף 0.25 גר&#39; (10.9 mmol) מתכת נתרן בתוך בקבוק זכוכית בורג הכתיר 100 מ&quot;ל מצויד PTFE- בר בחישה מגנטי מצופה. הערה: Dissolution יכול להיות מאוד משופר על ידי חיתוך נתרן לחתיכות קטנות וחימום צנוע (35 - 40 מעלות צלזיוס). הפתרון הסופי יש צבע כהה, ירקרק מעט ועשוי להיות מאוחסן בתנאים יבשים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרוף החוצה דיסקים PTFE בקוטר 12 מ&quot;מ 0.5 מ&quot;מ חומר רדיד עבה. מארק צד אחד (למשל, באמצעות מכתב חותם אגרוף) ונקי עם iso-propanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בנפרד-דגימות PTFE בפתרון ההפעלה (שלב 1.1) עבור 1 - באמצעות מלקחי 2 דקות. הערה: שינוי הצבע לבן עד חום כהה מצביע טיפול מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך ולשטוף פעמיים עם THF ולאחר מכן עם-propanol iso. הערה: פתרון naphthalenide הוא מותש כאשר משנה את צבעו כדי חום בהיר דומע. פתרון naphthalenide בשימוש (ואולי המכיל נתרן מתכתי) צריך להיות מפורק על ידי הוספה לאט iso-propanol לפני הסילוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמצן דגימות מטופלים מי חמצן (30%) המכילים 20% (w / v) חומצת trichloroacetic עבור 3 שעות. לִשְׁטוֹףעם מים ויבשים. המשטח עכשיו יש מראה חום קל. הערה: הפעלה ותוצאת חמצון בתוך יכולת רטיבות מוגברת מאוד של פני השטח. ממצא זה נבדק בפירוט 14 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את הדיסקים חמצון עם 50% (v / v) diisocyanate hexamethylene (HMDI) ב THF יבש עבור שעה 2, לשטוף עם THF ולהשאיר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hydrolyze דגימות נושאות isocyanate במים למשך 2 - 3 שעות ויבשות. הערה: משטח PTFE הסופי פונקציונלי אמין הוא הרבה יותר יציבה מאשר דגימות נושאות isocyanate והוא תואם crosslinkers הסטנדרטי רב עבור צימוד נוסף. </li></ol> 2. קיבוע פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה של 20% (v / v) אתר די אתילן גליקול diglycidyl (diepoxide) ב 50 מ&quot;מ חיץ קרבונט, pH 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדיסקים aminated עם הצד המסומן בנפרד לתוך צלחת 24 היטב ומוסיפים 1.5 מ&quot;ל של הפתרון epoxide. להבטיח כיסוי מלא של הדגימות. דגירה עבור שעה 2 ולשטוף שניפעמים עם מים ופעם עם חיץ קרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פפטיד 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל (למשל, REDV) ב 50 מ&quot;מ חיץ קרבונט, pH 9 המכיל 0.01% 3 נאן, אל החלק התחתון של בארות בודדים של צלחת טרי 24 היטב בזהירות במקום הפוך דיסקים פונקציונליות אפוקסי -down (כלומר, מסומן בצד למטה) על ירידה של הפתרון פפטיד. ודא כי הרווח בין תחתית הבאר ודיסק PTFE הוא רטוב לחלוטין בשל פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתא רטוב (למשל, כל קופסת פלסטיק סגר עם מכסה הסגירה חזק) עם אווירה humidified (על ידי הצבת נייר טישו רטוב על הקרקעית) במשך 3 שעות לפחות או לילה. הערה: אם כי מוטיב REDV יכול להיחשב היטב מאופיין, רצף חומצות האמיניות מקושקש או להפוך עשוי להיכלל כפקד שלילי נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם מים לעקר ב 50% iso-propanol / מים 30 דקות לפחות. לפני תא זריעה, rinsדואר הדגימות בופר פוספט סטרילית (PBS). </li></ol> 3. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול HUVECs באמצעות נהלי תרבית תאים סטנדרטיים 17,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הדגימות מצומדות-פפטיד עם הצד השונה עד בתוך 24 צלחות היטב. להשתמש בתקליטורי PTFE מטופל כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 5 X 10 4 HUVECs במדיום 2 מ&quot;ל לכל היטב דגירה במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדיסקים, לשטוף בזהירות כדי להסיר תאים פנויים ולהעביר לצלחת גם 24 טרי. הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום חדש דגירה לתקופה הרצויה (למשל, 24 שעות, 1 w, וכו &#39;). שנה בינונית כל יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Calcein-AM ב sulfoxide דימתיל (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גידול התאים להסיר את המדיום, לשטוף עם PBS ולהוסיף PBS המכיל 1 μl / מ&quot;ל כתם Calcein-AM (למשל, 1 μl של פתרון המניות לכל PBS מ&quot;ל). בעדינות להתסיס incubatדואר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS ומיד לקחת micrographs על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים FITC סטנדרטי (ננומטר 488 Ex, ננומטר Em 515). השתמש בהגדלה של פי 100. בצע triplicates מ ללא שינוי כמו גם דגימות מטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ImageJ לקבוע את האזור מאוכלס על ידי התאים. לחלופין לספור את התאים באופן ידני או להשתמש ImageJ. שני השיטות תיתנה מידע דומה על התקשרות הצמיחה של תאים על פני השטח בהתאמה. </li></ol>

<ol>
	<li>Doctor, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+various+prosthetic+materials+and+newer+meshes+for+hernia+repairs.">Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs.</a> J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).</li><li>Zaghal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+totally+implantable+venous+access+devices.">Update on totally implantable venous access devices.</a> Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).</li><li>Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+blood+vessels.">Bioengineered blood vessels.</a> Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).</li><li>Wang, M. -. J., Tsai, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , (2010).</li><li>de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofunctionalization+of+biomaterials+for+accelerated+in+situ+endothelialization:+a+review.">Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review.</a> Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).</li><li>Zdrahala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+caliber+vascular+grafts.+Part+I:+state+of+the+art.">Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art.</a> J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).</li><li>Cleary, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+tissue+engineering:+the+next+generation.">Vascular tissue engineering: the next generation.</a> Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).</li><li>Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+and+other+recognition+sequences+for+integrins.">RGD and other recognition sequences for integrins.</a> Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).</li><li>Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+immobilization+on+polyethylene+terephthalate+surfaces+to+study+specific+endothelial+cell+adhesion,+spreading+and+migration.">Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration.</a> J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).</li><li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+RGD+Modification+of+the+Inner+Pore+Surface+of+Polycaprolactone+Scaffolds.">Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds.</a> J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).</li><li>Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+adhesion+and+growth+of+vascular+endothelial+cells+on+bioactive+peptide+nanofiber+functionalized+stainless+steel+surface.">Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface.</a> Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).</li><li>Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessel+replacement:+50+years+of+development+and+tissue+engineering+paradigms+in+vascular+surgery.">Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery.</a> Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, 119-139 (2009).</li><li>Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-based+biofunctionalization+of+vascular+implants.">Plasma-based biofunctionalization of vascular implants.</a> Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).</li><li>Mikulikova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+microarrays+on+photochemically+modified+polytetrafluoroethylene.">Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene.</a> Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).</li><li>Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wet-chemical+approach+for+the+cell-adhesive+modification+of+polytetrafluoroethylene.">Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene.</a> Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).</li><li>Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+grafting+of+RGD-motif-containing+peptide+on+the+surface+of+polycaprolactone+films.">Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films.</a> J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).</li><li>Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+RGD+fluorosurfactant+polymer+modification+of+ePTFE+on+endothelial+cell+adhesion,+growth,+and+function.">The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function.</a> Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).</li><li>Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+LL-37-grafted+titanium+surfaces+with+bactericidal+activity.">Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity.</a> Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).</li><li>Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., F&#246;rch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization+of+Plasma+Polymerized+Thin+Films+and+Attachment+of+Biomolecules+to+Influence+HUVEC-Cell+Adhesion.">Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion.</a> Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

התיאור המפורט של פרוטוקול שינוי פני השטח של PTFE מורכב צעדים רצופים החל חיסול פלואור מן השדרה פולימר כמתואר באיור 6. כתוצאה מכך, שכבה נוצר המכיל כמות בשפע של קשרים כפולים פחמן-פחמן מצומדות בהתאם לצבע החום הכהה שהתפתח על טיפול naphthalenide. חמצון רגיל עם מי חמצן חומצי מניב משטח hydroxylated מלווה התבהרות חום חיוור, זו משקפת את ההפסד של קשרים כפולים. תהליך זה בא לידי ביטוי באופן ברור על ידי ספקטרוסקופיה IR. על מנת להשיג פונקציונליות החלימו באורח כללי יותר, את קבוצות OH התליון הוסבו פונקציות-אמינו על ידי טיפול פשוט עם diisocyanate הידרוליזה הבאה של moieties-הקצונה אמינה ראשוני. זה הוא חיובי, כי חומר נושאות אמינות ניתן לאחסן לתקופות ממושכות ואילו הגדולhly isocyanate תגובתי רגיש עצם הנוכחות של לחות באוויר. יש להקפיד על הימנעות אפילו כמויות זעירות של מים בשלב ההפעלה הראשונית והטיפול HMDI כי הן naphthalenide נתרן ואת isocyanate רגישים מאוד הידרוליזה. בניגוד נהלים קבועים שבהם המדגם הוא שקוע לחלוטין בפתרון, בפרוטוקול הנוכחי מחייב רק כמויות קטנות של מגיב. לכן שיטה זו חוסכת הרבה הפפטיד היקר. משטחים אמינים נושאות הם נקודות מוצא אידיאליות עבור הצימוד של ביומולקולות רבה. Diepoxide המועסקים בעבודה זו מעניין בכמה לגבי: זה יחסית זול, הידרופילי, מאוד תגובתי לעבר אמינים ואפוקסים הלא הגיבו הם הידרוליזה בסביבה מימית לתוך diols &quot;אינרטי מבחינה פיזיולוגית&quot;. crosslinkers Homobifunctional הם ריאגנטים מתאימים שבו רק קבוצה תגובתי אחד היא נוכחית on הפפטיד כדי להיות משותק. זה חל על REDV המכיל רק אחד אמינו-קבוצה עיקרית אחת על N-terminal (זה אותו דבר עבור rgds רצף בשימוש תדיר). עבור פפטידים המכילים שאריות ליזין (עם אמיני שרשרת צד) התוצאה של הנטייה היא מעורפלת, כלומר צימוד נכון אינו מתרחש באופן מוגדר. במקרה זה, אסטרטגיה באמצעות crosslinkers heterobifunctional (למשל, amine- ו תיאול-reactive) ו ציסטאין (N- או C- מסוף) המכיל פפטידים הוא 18 מועיל. התוצאות של חוסר תנועה פפטיד מבחינת הידבקות התא הוא חד משמעי (איורים 3 ו -4). בעוד כמעט ללא תאים לדבוק על PTFE החשוף, REDV-שינוי הופך את החומר מצע מצוין תא-דבק. משלים את העבודה מפורטת למעלה מעיד על הפרוטוקול ראשוני כי טכניקה זו היא גם החלימה על PTFE הנקבובי (מורחב) עם תוצאות דומות (איור 5 </strong&gt;). זהו עניין מיוחד כי זו שתל כלי דם החומר עשוי. בניגוד משטח טכניקות בעיקר לעשות שימוש טיפול פלזמה (הפעלת פלזמה 13, פילמור הפלזמה 19), פרוטוקול זה מספק קו מנחה לגבי השינוי קוולנטי של PTFE ידי העסקת כימיקלים זמינים ונהלי מעבדה ועל ידי הימנעות ציוד מתוחכם. מתודולוגיות פלזמה כגון פלזמה תגובתי (O 2, 3 NH, וכו &#39;) פילמור פלזמה אינן ישימות בתוך מבנים נקבוביים או צינורות כי מינים תגובתי (למשל, רדיקלים) אינם מסוגלים לחדור למבנים אלה בשל איון במגע עם חומרים משטח. לדוגמה קטן שתל כלי דם קליבר (קוטר &lt;5 מ&quot;מ) לא ניתן לטפל בדרך זו. לעומת זאת, באמצעות כימיה רטובה, אין מגבלה לגבי הצורה של המכשיר. בדרך זו, בכך שהיא מאפשרת היווצרות של endothשכבת elial בצד luminal של שתל וסקולרית ePTFE, thrombogenicity ואת patency לטווח ארוך ניתן לשפר. בנוסף, משטח דבק תא עבור משתלב בקע כירורגית אמור לגרום אינטגרצית רקמה טובה יותר.

פולימרים שונים בשימוש ברפואה אשר אושרו במשך זמן מה אינו מציג התאמה ביולוגית משופרת, כלומר, חוסר-דביקות תא, אינדוקציה של אנקפסולציה fibrotic ו thrombogenicity, כדי להזכיר כמה. אינטראקציות בין הביולוגי והמערכת הביולוגית מתרחשות בעיקר על פני השטח של השתל. כתוצאה מכך, מחקר התמקד שינוי פני שטח כדי ליצור מאפיינים מתאימים יישום רצוי תוך השארה בכמויות הגדולות המאפיינים של החומר מעושה. Polytetrafluoroethylene (PTFE) כמו פולימר אינרטי מבחינה פיזיולוגית משמש בתחומים רפואיים רבים כגון רשת 1 כירורגית בקע, יציאות רפואיות 2, והכי חשוב, שתל כלי דם 3. במיוחד במצבי פניית דם האופי הידרופובי של PTFE גורם ספיחה נוקבת של רכיבי פלזמה וכתוצאה הידבקות טסיות מכך, ופעמים רבות תוצאה היא thrombotiאירועי ג ו חסימה של השתל 4. יתר על כן, PTFE, כמו רוב הפולימרים, אינו תומך הידבקות הסלולר וכיסוי אשר תהיה תכונה רצויה לגרום להיווצרות שכבה שביושר בתאי האנדותל (EC) על הפנימי (לומינל) השטח של השתל וסקולרית 5. האנדותל biomimetic צפוי למלא רב מהפונקציות של המקבילה הטבעית שלה, נכסי antithrombogenic שלה בעיקר 6. אסטרטגית שינוי biomimetic כללית מבוססת על הרעיון של והוריש חומר בלעדי עם-דביקות תא תוך השארת הנכסים חומר תפזורת מעושה. בנוסף, הדבקה טסיות עשוי להיות מופחת על ידי שילוב-דבק ​​אנטי (אנטי עכירות) מייחס 7. פפטידים שונים - שמקורה בעיקר חלבונים של תאי מטריקס - תוארו כי בתוקף לשפר-הידבקות התא באמצעות קשירה לקולטנים הסלולר, השתייכות למעמד של integrins 8. את להיותst-ידוע למשל בעניין זה הוא פפטיד Arg-גלאי-ASP (RGD) כי אינטראקציה עם סוגי תאים ביותר. רצפי החומצות האמיניות אחרים מוכרים על ידי integrins לידי ביטוי אך ורק על תאים ספציפיים. לדוגמה, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) ו Tyr-Ile-גלאי-שירו-Arg (YIGSR) נמצאו להיקשר ECS באופן ספציפי 9. קוולנטיים וקיבוע של פפטידים כאלה בוצע על שפע של חומרים שאינם דבקים מטבעו כולל מתכות ופולימרים 10,11. PTFE נקבובי, ליתר דיוק מורחבת PTFE (ePTFE) - יחד עם terephthalate פוליאתילן (PET) - הוא החומר החשוב ביותר לייצור כלי הדם שתלי 12. טכניקות פיסיות הוקמו עבור טיפולים מתאימים, כגון שינוי הפלזמה 13 או בשיטות פוטו 14, הם הקשו על ידי העובדה כי מבנים נקבוביים / או הצינור שלא ניתן לטפל בקלות בתוך נקבובי או לומן בהתאמה. כימיה רטובהעל PTFE היא משימה קשה בשל אופיו אינרטי מאוד של הפולימר המכילים fluorin שמתנגד התקפות כימיות ביותר 15. במאמר זה אנו מתארים שיטה קלילה יחסית עבור אסטרטגית שינוי קוולנטי. מעובד מתוך הליך כדי להבהיר bondable PTFE, קבוצות פונקציונליות נוצרו על פני שטח החומרים המשמשים כנקודות עוגנות נטייה נוספת של מולקולות ביולוגיות אקטיביות.

<table><tbody><tr><td>PTFE foil 0.5 mm</td><td>Cadillac Plastic&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>REDV peptide</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>custom synthesis &gt;95% purity</td></tr><tr><td>iso-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofurane (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>molecular sieve 3 &amp;Aring;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>sodium metal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naphthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>trichloroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>diethylene glycol diglycidyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>hexamethylene diisocyanate (HMDI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850</td><td>&amp;nbsp;Nicolet</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>humbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE vascular graft</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion

להנחיל חומרי משטח עם מאפייני תא-דבק הוא אסטרטגיה משותפת במחקר ביולוגי והנדסת רקמות. זה מעניין במיוחד עבור פולימרים שכבר אושרו שיש להם שימוש ארוך ברפואה כי חומרים אלה הם גם בעיות מאופיינות ומשפטיות הקשורים עם ההקדמה של פולימרים מסונתזים חדש ניתן להימנע. Polytetrafluoroethylene (PTFE) הוא אחד החומרים מועסקים לעתים קרובות ביותר עבור הייצור של שתלי כלי דם אך הפולימר חסר הידבקות תא בקידום תכונות. Endothelialization, כלומר, כיסוי מלא של שתלי המשטח פנימי בשכבה ומחוברת של בתאי האנדותל נחשב מפתח לביצועים אופטימליים, בעיקר על ידי הקטנת thrombogenicity של הממשק המלאכותי. מחקר זה בוחן את הצמיחה של תאי האנדותל על PTFE פפטיד שונה ומשווה את התוצאות הללו לאלה שהושגו על מצע ללא שינוי. צימוד עםArg-Glu-Asp-Val פפטיד תא הדבק אנדותל (REDV) מבוצע באמצעות הפעלה של הפולימר המכיל fluorin באמצעות naphthalenide נתרן מגיב, ואחריו צעדי נטייה שלאחר מכן. תרבית תאים מושגת באמצעות אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) וצמיחה הסלולר מעולה על חומר משותק פפטיד מודגם על פני תקופה של שבועות.

<html> התוצאות של צעדי תגובה הכימיים המכריע נוטרו ידי ספקטרוסקופיה IR (איור 1). ההפעלה הראשונית עם נתרן naphthalenide יוצרת קשרים כפולים - ובמידה קטין - OH-פונקציות. האות המציינת C = אג&quot;ח ג להיעלם בסיום חמצון, מניב משטח ועליו כמעט באופן בלעדי הידרוקסיל-קבוצות. ניתוח של פעולות נטיית תקן נוספות אינו מוצג כאן. שינויי הצבעים עקב הפעלה וחמצון עולים בקנה אחד עם הכימיה הצפויה המשמש: מערכות מליטות כפולות מצומדות צפויים להיות חום ותוצאות האובדן שלה התבהרות (איור 2). בנוסף, להערכת סיכויי ההפעלה וחמצון על מורפולוגיה משטח נחקר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. כמעט שום השפעה מזיקה של הטיפול נצפתה (איור 2). ogether.within-page = &quot;1&quot;&gt; דמוי 3 ו -4 מציגים את תוצאת REDV-קיבוע על צמיחת תאי אנדותל. בעוד כמעט ללא הידבקות תא ושגשוגם מתרחשים על חומר מטופל השינוי מאוד תומך קולוניזציה על פני תקופה של שבועות. שהודגם עבור יישום קליני (כלומר, שתל כלי דם), השינוי נעשה באופן זהה על חומר מקורי מתוך שתל זמין מסחרי מחומרי טפלון מורחבים עם תוצאות דומות על פני תקופה של שבוע אחד (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig1.jpg" /> ספקטרוסקופיה IR איור 1. של PTFE. טיפול PTFE וטהור (א) תוצאות ביצירת קשרים כפולים ובמידה מסוימת של פונקציות הידרוקסי (B). בהמשך C = אג&quot;ח ג מופחתים עקב חמצון (C </stro<html> ng&gt;). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig2.jpg" /> המראה אופטי איור 2. של PTFE מופעל חשופי שטח. (א) הואיל PTFE מטופל (משמאל) נראה לבן, הפעיל באמצעות נתרן naphthalenide מניב צבע חום כהה (באמצע) אשר שפר מעט על חמצון (מימין). ללא טיפול (B) מחומצן PTFE (C) דגימות נחקרו גם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (הגדלה: 2,000X). דיסקים הם 12 מ&quot;מ קוטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig3.jpg" /> תרבית תאי איור 3. האנדותל על PTFE והטהור פפטיד שונה. דגימות אורגניות נמצאת לא נשבו על ידי ECS (A, C, E לאחר 24 שעות, 1 w ו -2 w בהתאמה) ואילו הדבקה וצמיחה על חומר שונה פפטיד הוא משפרים (B, D ו- F לאחר 24 שעות, 1 w ו -2 w בהתאמה). סרגל קנה מידה:. 100 מיקרומטר, הגדלה 100X <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig4.jpg" /> איור 4. כימות של כיסוי התא על ידי ניתוח ImageJ. הצמיחה סלולארית על PTFE חשוף (A, C,E) ועל משטחים פולימריים מצומדות REDV (B, D, F) מבוטא כיסוי אחוז השטח הכולל. פפטיד המשותקת מאפשרת הדבקה ראשונית בבירור (B) ותומכת קולוניזציה על פני תקופה של 2 בשבוע (D, F). בשלושה עותקים קביעות, ממוצע ± סטיית תקן). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig5.jpg" /> איור 5. תאי האנדותל גדלו במשך שבוע 1 על PTFE המורחבת. המבנה של ePTFE מוצג באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (א). התוצאות שהתקבלו על חומר נקבובי הן בהתאם לאלו שהושגו עבור דגימת PTFE שטוחה. בניגוד כמה תאים הנמצאיםעל חומר חשוף (ב) לפני השטח השונה (C) מספק מצע מצוין צמיחת תאים. ברי סולם הם 100 מיקרומטר עבור A, B ו- C בהתאמה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig6.jpg" /> איור 6. ייצוג סכמטי של השינוי הכימי של PTFE באמצעות-כימיה רטובה. קשרים כפולים שנוצרו על ידי טיפול Na-naphthalenide הם מתחמצנים וכתוצאה מכך OH-פונקציות. Diisocyanate תגובתי-הידרוקסיל הוא משותק אז הידרוליזה אל אמין. לבסוף diepoxide bifunctional מוחל להטות הפפטיד REDV באמצעות קבוצת אמינו N-terminal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig6large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן נ</a>iew גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion at JoVE.com

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

כימיה רטובה פפטיד קיבוע על polytetrafluoroethylene עבור Cell-הדבקה משופרת

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

wet-chemistry-peptide-immobilization-on-polytetrafluoroethylene-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.6K Views.  Sidra Cardiovascular Research. Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Video: Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large variety of PEG molecular weights and configurations (arm number, arm length, and branching pattern) affords researchers tight control over resulting hydrogel structures and properties, including Young&#8217;s modulus and mesh size. This video will illustrate a rapid, efficient, solvent-free, microwave-assisted method to methacrylate PEG precursors into poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM). This synthetic method provides much-needed starting materials for applications in drug delivery and regenerative medicine. The demonstrated method is superior to traditional methacrylation methods as it is significantly faster and simpler, as well as more economical and environmentally friendly, using smaller amounts of reagents and solvents. We will also demonstrate an adaptation of this technique for on-resin methacrylamide functionalization of peptides. This on-resin method allows the N-terminus of peptides to be functionalized with methacrylamide groups prior to deprotection and cleavage from resin. This allows for selective addition of methacrylamide groups to the N-termini of the peptides while amino acids with reactive side groups (e.g.&#160;primary amine of lysine, primary alcohol of serine, secondary alcohols of threonine, and phenol of tyrosine) remain protected, preventing functionalization at multiple sites. This article will detail common analytical methods (proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (;H-NMR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-ToF)) to assess the efficiency of the functionalizations. Common pitfalls and suggested troubleshooting methods will be addressed, as will modifications of the technique which can be used to further tune macromer functionality and resulting hydrogel physical and chemical properties. Use of synthesized products for the formation of hydrogels for drug delivery and cell-material interaction studies will be demonstrated, with particular attention paid to modifying hydrogel composition to affect mesh size, controlling hydrogel stiffness and drug release.

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

This video will illustrate a rapid, efficient method to methacrylate poly(ethylene glycol), enabling chain polymerizations and hydrogel synthesis. It will demonstrate how to similarly introduce methacrylamide functionalities into peptides, detail common analytical methods to assess functionalization efficiency, provide suggestions for troubleshooting and advanced modifications, and demonstrate typical hydrogel characterization techniques.

Functionalization בסיוע מיקרוגל של פולי (אתילן גליקול) ופפטידים על השרף לשימוש בPolymerizations שרשרת וגיבוש Hydrogel

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Chemistry

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biochemistry

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

אלקטרופורזה הנימים לפקח פפטיד האריך על Chitosan סרטים בזמן אמת

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, improving the biocompatibility of metal stents remains a significant challenge. The goal of this protocol is to describe a robust technique of metal surface modification by biologically active peptides to increase biocompatibility of blood contacting medical implants, including endovascular stents. CD47 is an immunological species-specific marker of self and has anti-inflammatory properties. Studies have shown that a 22 amino acid peptide corresponding to the Ig domain of CD47 in the extracellular region (pepCD47), has anti-inflammatory properties like the full-length protein. In vivo studies in rats, and ex vivo studies in rabbit and human blood experimental systems from our lab have demonstrated that pepCD47 immobilization on metals improves their biocompatibility by preventing inflammatory cell attachment and activation. This paper describes the step-by step protocol for the functionalization of metal surfaces and peptide attachment. The metal surfaces are modified using polyallylamine bisphosphate with latent thiol groups (PABT) followed by deprotection of thiols and amplification of thiol-reactive sites via reaction with polyethyleneimine installed with pyridyldithio groups (PEI-PDT). Finally, pepCD47, incorporating terminal cysteine residues connected to the core peptide sequence through a dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, are attached to the metal surface via disulfide bonds. This methodology of peptide attachment to metal surface is efficient and relatively inexpensive and thus can be applied to improve biocompatibility of several metallic biomaterials.

Presented here is a protocol for appending peptide CD47 (pepCD47) to metal stents using polybisphosphonate chemistry. Functionalization of metal stents using pepCD47 prevents the attachment and activation of inflammatory cells thus improving their biocompatibility.

הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

הערכת פפטידים בהרכבה עצמית ביו-פונקציונלית להידבקות תאים ומורפולוגיה

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of hydrogels that are biocompatible, biodegradable, and non-immunogenic. We have previously proven that SAPs, when biofunctionalized with protein-derived motifs, can mimic the extracellular matrix characteristics that support colorectal organoid formation. These biofunctional peptide hydrogels retain the original parent peptide's mechanical properties, tunability, and printability while incorporating cues that allow cell-matrix interactions to increase cell adhesion. This paper presents the protocols needed to evaluate and characterize the effects of various biofunctional peptide hydrogels on cell adhesion and lumen formation using an adenocarcinoma cancer cell line able to form colorectal cancer organoids cost-effectively. These protocols will help evaluate biofunctional peptide hydrogel effects on cell adhesion and luminal formation using immunostaining and fluorescence image analysis. The cell line used in this study has been previously utilized for generating organoids in animal-derived matrices.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של מטריצות פפטיד קצרות במיוחד עבור אורגנואידים של סרטן המעי הגס

This protocol aims to evaluate biofunctional self-assembling peptides for cell adhesion, organoid morphology, and gene expression by immunostaining. We will use a colorectal cancer cell line to provide a cost-effective way of obtaining organoids for intensive testing.

ייצור ואפיון אורגנואידים מסרטן המעי הגס SW1222 בקו תאים במטריצת פפטיד אולטרה-קצרה להרכבה עצמית

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...