Name: wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion
Uploaded: 2016-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
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The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.

1. Herstellung von Natriumnaphthalenid Aktivierungslösung und Oberflächenaktivierung Hinweis: Führen Sie die Reaktionen in einem gut belüfteten Abzug durchführen. Die allgemeinen Regeln für den Umgang mit hoch brennbaren Lösungsmitteln und korrosiven Metalle wie metallisches Natrium. Naphtalin hat einen sehr unangenehmen Geruch (mothball), auch in sehr kleinen Mengen! Wenn nicht anders angegeben Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Natriumazid ist hochgiftig! THF (99,9%, siehe Materialliste) wurde über etwa 20% (bezogen auf das Volumen) Molekularsieb gelagert. Destillieren THF mit einem merklichen Wassergehalt über Natrium. Die Bildung von Natriumnaphthalenid tritt nicht auf, wenn Spurenmengen von Wasser vorhanden sind. <ol><li> Zu einer Lösung von 1,4 g (10,9 mmol) Naphthalin in 20 ml Tetrahydrofuran (THF, getrocknet über 3 Å Molekularsieb), Zugabe von 0,25 g (10,9 mmol) Natriummetall in einem Schraubverschluss 100 ml Glasflasche mit einem PTFE- ausgestattet beschichteten magnetischen Rührstab. Hinweis: dissolu(- 40 ° C 35) tion kann durch Schneiden des Natrium in kleine Stücke und bescheiden Erwärmung stark verbessert werden. Die endgültige Lösung hat eine dunkle, leicht grünliche Farbe und kann unter streng trocken gelagert werden. </li><li> Punch-Out-PTFE-Scheiben von 12 mm Durchmesser von 0,5 mm dicken Folienmaterial. Markieren Sie eine Seite (zB mit einem Brief Stempel Stempel) und sauber und mit iso-Propanol. </li><li> Inkubieren PTFE-Proben einzeln in der Aktivierungslösung (Schritt 1.1) mit 1 - 2 Minuten mit einer Pinzette. Hinweis: Der Farbumschlag von weiß bis dunkelbraun erfolgreiche Behandlung zeigt. </li><li> Anschließend spülen zweimal mit THF und dann mit Isopropanol. Hinweis: Die Naphthalenid ist erschöpft, wenn seine Farbe ändert sich zu einem wässrig hellbraun. Nicht verwendete Naphthalenid Lösung (möglicherweise metallisches Natrium enthält) muss durch langsam zerlegt werden, indem Isopropanol vor der Entsorgung. </li><li> Oxidieren behandelten Proben in Wasserstoffperoxid (30%) 20% (w / v) Trichloressigsäure für 3 Stunden. Waschenmit Wasser und trocken. Die Oberfläche hat jetzt eine leichte bräunliche Aussehen. Hinweis: Die Aktivierung und Oxidation führt zu einer drastisch erhöhten Benetzbarkeit der Oberfläche. Diese Feststellung wurde im Detail zuvor 14 untersucht. </li><li> Behandeln Sie oxidierte Scheiben mit 50% (v / v) Hexamethylendiisocyanat (HMDI) in trockenem THF 2 h gründlich mit THF und trocknen lassen. </li><li> Hydrolysieren Isocyanat Lagerproben in Wasser für 2 - 3 Stunden und trocken. Anmerkung: Die endgültige aminofunktionalisierte PTFE-Oberfläche als die Isocyanat-tragenden Proben wesentlich stabiler ist und ist kompatibel mit vielen Standard-Vernetzer für die weitere Kupplung. </li></ol> 2. Peptide Immobilisation <ol><li> Eine Lösung aus 20% (v / v) Diethylenglycol-diglycidylether (Diepoxid) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9. </li><li> Legen Sie die aminierte Scheiben mit der markierten Seite nach oben einzeln in eine 24-Well-Platte und fügen Sie 1,5 ml der Epoxid-Lösung. Achten Sie darauf, eine vollständige Abdeckung der Proben. Inkubieren für 2 Stunden und waschen zweimals mit Wasser und einmal mit Carbonatpuffer. </li><li> Zugabe von 50 ul einer 0,5 mg / ml Peptid (zB REDV) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9 , enthaltend 0,01% NaN 3, auf den Boden der einzelnen Vertiefungen einer frischen 24 - Well - Platte und legen sorgfältig die epoxy-funktionalisierten Scheiben upside -down (dh markierte Seite nach unten) auf den Abfall der Peptidlösung. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Boden des Bohrlochs und der PTFE Scheibe Kapillarwirkung aufgrund vollständig benetzt wird. </li><li> Inkubieren in einer feuchten Kammer (zB jede verschließbaren Plastikkasten mit einem dicht schließendem Deckel) mit befeuchteten Atmosphäre (durch nasse Seidenpapier auf dem Boden platzieren) für mindestens 3 Stunden oder über Nacht. Hinweis: Wenn auch das REDV- Motiv als gut charakterisiert, kann ein Rühr- oder Reverse Aminosäuresequenz angesehen werden kann als zusätzliche Negativkontrolle einbezogen werden. </li><li> Waschen dreimal mit Wasser und Sterilisieren in 50% iso-Propanol / Wasser für mindestens 30 min. Vor der Aussaat zu Zelle, rinse die Proben in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). </li></ol> 3. Zell Seeding <ol><li> Wachsen HUVECs unter Verwendung von Standardzellkulturverfahren 17,18. </li><li> Legen Sie die Peptid-konjugierten Proben mit der modifizierten Seite nach oben in einer 24-Well-Platten. Verwenden Sie unbehandelten PTFE-Discs als Kontrolle. </li><li> Seed 5 x 10 4 HUVECs in 2 ml Medium pro Vertiefung und Inkubation für 4 h bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Scheiben gründlich sorgfältig ungebunden Zellen zu entfernen und in ein frisches 24-Well-Platte. 2 ml frisches Medium und Inkubation für den gewünschten Zeitraum (zB 24 Stunden, 1 w, etc.). Ändern Sie das Medium alle zwei Tage. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mg / ml Calcein-AM in Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Nach dem Züchten der Zellen des Mediums, Waschen mit PBS entfernen und PBS , das 1 &amp; mgr; l / ml Calcein-AM - Färbung (beispielsweise 1 &amp; mgr; l einer Stammlösung pro ml PBS) hinzuzufügen. Vorsichtig geschwenkt und INCUBATe bei 37 ° C für 45 min im Dunkeln. </li><li> Waschen mit PBS und sofort nehmen mikroskopische Aufnahmen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit Standard-FITC-Filter ausgestattet (Ex 488 nm, Em 515 nm). Verwenden Sie das 100-fache Vergrößerung. Führen Sie Triplikaten von unmodifizierten sowie behandelten Proben. </li><li> Mit ImageJ Software bestimmen den Bereich von den Zellen besiedelt. zählen Alternativ können die Zellen manuell oder ImageJ verwenden. Beide Verfahren geben ähnliche Informationen über die Anhaftung und das Wachstum von Zellen auf den jeweiligen Oberflächen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die detaillierte Beschreibung der Oberflächenmodifikationsprotokoll PTFE besteht aus aufeinanderfolgenden Stufen unter Abspaltung von Fluor aus dem Polymergerüst in 6 als dargestellt zu starten. Als Ergebnis wird eine Schicht gebildet, die eine reichliche Menge an konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff - Doppelbindungen enthält , in gemäß der dunkelbraune Farbe, die auf Naphthalenid Behandlung entwickelt. Standard Oxidation mit sauren Wasserstoffperoxid ergibt eine hydroxylierte Oberfläche durch Aufhellung zu einer blaßbraunen begleitet, dies den Verlust von Doppelbindungen widerspiegelt. Dieser Vorgang wird eindeutig durch IR-Spektroskopie nachgewiesen. Um eine allgemein gültige Funktionalität, die anhängenden OH-Gruppen wurden in Amino-Funktionalitäten umgewandelt durch einfache Behandlung mit einem Diisocyanat und anschließende Hydrolyse der NCO-Resten zu primären Aminen zu erreichen. Dies ist günstig, weil aminhaltige Material kann über einen längeren Zeitraum, während die hig gelagert werdenhly reaktive Isocyanat ist auf die Anwesenheit von Luftfeuchtigkeit anfällig. Vorsicht ist bei der Vermeidung ergriffen werden sogar Mengen an Wasser in der anfänglichen Aktivierungsschritt verfolgen und die HMDI Behandlung, weil sowohl Natriumnaphthalenid und das Isocyanat sind gegen Hydrolyse sehr anfällig. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren, bei denen die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht wird, erfordert das vorliegende Protokoll nur geringe Mengen des Reagenzes. Deshalb spart dieses Verfahren eine Menge des teuren Peptid. Amin-Lagerflächen sind ideale Ausgangspunkte für die Kopplung von vielen Biomolekülen. Das Diepoxid in dieser Arbeit verwendet wird, ist interessant, in mehrfacher Hinsicht: Es ist vergleichsweise billig, hydrophilen, hoch reaktiv gegenüber Aminen und nicht umgesetztem Epoxide werden in einer wässrigen Umgebung in die &quot;physiologisch inert&quot; Diole hydrolysiert. Homobifunktionelle Vernetzer sind geeignete Reagenzien, wo nur eine reaktive Gruppe vorhanden on das Peptid immobilisiert werden. Dies gilt für REDV nur eine einzige primäre Amino-Gruppe am N-Terminus enthält (dies ist die gleiche für die häufig verwendeten Sequenz RGDS). Für Peptide, die Lysinreste (mit Seitenkette Amine) das Ergebnis der Konjugation ist mehrdeutig, was bedeutet, dass eine ordnungsgemäße Kupplung nicht in definierter Weise auftritt. In diesem Fall wird eine Strategie heterobifunktionelle Vernetzer (beispielsweise Amin- und Thiol-reaktiv) und Cystein (N- oder C-terminal) enthaltenden Peptiden ist hilfreich 18. Die Ergebnisse der Peptid Immobilisierung in Bezug auf Zellhaftung ist unzweideutig (3 und 4). Während praktisch keine Zellen auf blanken PTFE haften, macht REDV--Modifikation das Material eine ausgezeichnete zelladhäsive Substrat. Ergänzend zu dem obigen Protokoll Vorarbeiten zeigen erwähnt , dass diese Technik auf porösen (erweitert) PTFE mit ähnlichen Ergebnissen auch anwendbar ist (Abbildung 5 </strong&gt;). Dies ist von besonderem Interesse, weil dies die Materialgefäßtransplantaten ist gemacht sind. Im Gegensatz Techniken zur Oberfläche, die vor allem den Einsatz von Plasmabehandlung (Plasmaaktivierung 13, Plasmapolymerisation 19) machen, bietet dieses Protokoll eine Richtlinie für die kovalente Modifikation von PTFE durch leicht erhältliche Chemikalien und Laborverfahren verwendet wird und durch hochentwickelte Geräte zu vermeiden. Plasma Methodologien wie reaktives Plasma (O 2, NH 3, etc.) und Plasma - Polymerisation sind nicht anwendbar im porösen Konstrukte oder Schläuche , da reaktive Spezies (zB Reste) sind nicht in der Lage , diese Strukturen aufgrund der Inaktivierung bei Kontakt mit den Materialien zu durchdringen Oberfläche. Zum Beispiel kleinkalibrigen Gefäßtransplantaten (Durchmesser &lt;5 mm) können nicht auf diese Weise behandelt werden. Im Gegensatz dazu, mittels Nasschemie, gibt es keine Beschränkung hinsichtlich der Form der Vorrichtung. Auf diese Weise ist es durch die Bildung eines endoth ermöglichtElial Schicht auf der luminalen Seite eines ePTFE Gefßtransplantats, Thrombogenität und Langzeitdurchgängigkeit verbessert werden. Außerdem wird eine Zellhaftfläche für chirurgische Herniennetze soll in bessere Gewebeintegration zu resultieren.

Verschiedene Polymere in der Medizin eingesetzt , die seit einiger Zeit zugelassen wurden keine verbesserte Biokompatibilität aufweisen, das heißt, der Mangel an Zell-Haft, Induktion von fibrotischen Verkapselung und Thrombogenität, um nur einige zu nennen. Wechselwirkungen zwischen dem Biomaterial und dem biologischen System erfolgt hauptsächlich an der Oberfläche des Implantats. Als Folge hat sich die Forschung auf die Oberflächenmodifikation konzentriert, um geeignete Eigenschaften für eine gewünschte Anwendung zu schaffen, während die Volumeneigenschaften des Materials unbeeinflusst bleibt. Polytetrafluorethylen (PTFE) als ein physiologisch inertes Polymer wird in vielen medizinischen Gebieten, wie Hernie chirurgisches Netz 1, medizinische Anschlüsse 2 verwendet und, am wichtigsten, vaskuläre Transplantate 3. Insbesondere in Blut in Kontakt Situationen die hydrophobe Natur von PTFE verursacht unspezifische Adsorption von Plasmabestandteilen und als Folge Thrombozytenadhäsion, oft in thromboti ergebc Ereignisse und Okklusion des Transplantats 4. Weiterhin PTFE, wie die meisten Polymere nicht unterstützt Zelladhäsion und Abdeckung , die ein wünschenswertes Merkmal 5 wäre die Bildung einer nützlichen Schicht von Endothelzellen (ECs) auf der inneren (luminale) Oberfläche des vaskulären Transplantats zu induzieren. Eine biomimetische Endothel wird erwartet , dass viele der Funktionen seiner natürlichen Äquivalent zu erfüllen, vor allem seine antithrombogenen Eigenschaften 6. Eine allgemeine biomimetischen Modifikationsstrategie basiert auf dem Konzept der ausschließlich das Material mit Zellhaftfähigkeit verleihen, während die Eigenschaften Materialien bulk verlassen unberührt. Zusätzlich kann Thrombozytenadhäsion durch Einarbeiten antiadhäsive (anti-fouling) Attribute 7 reduziert werden. Verschiedene Peptide - meist aus Proteinen der extrazellulären Matrix abgeleitet ist - wurden beschrieben , die stark durch die Bindung an zelluläre Rezeptoren gehört zu der Klasse von Integrinen 8 Zelladhäsion verbessern. Das Seinst bekanntes Beispiel in dieser Hinsicht ist das Peptid Arg-Gly-Asp (RGD), die mit den meisten Zelltypen interagiert. Andere Aminosäuresequenzen werden durch Integrine exprimiert ausschließlich auf spezifische Zellen erkannt. Zum Beispiel Arg-Glu-Asp-Val (REDV-) und Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR-) wurden ECs zu binden , in einer bestimmten Art und Weise 9 gefunden. Kovalente Immobilisierung solcher Peptide wurde auch von Natur aus nicht klebenden Materialien durchgeführt auf einer Vielzahl von Metallen und Polymeren 10,11. Poröse PTFE, genauer aus expandiertem PTFE (ePTFE) - zusammen mit Polyethylenterephthalat (PET) - ist das wichtigste Material für die Herstellung von vaskulären Transplantaten 12. Etablierte physikalische Techniken für entsprechende Behandlungen, wie Plasmamodifizierung 13 oder durch photochemische Verfahren 14 werden durch die Tatsache behindert , daß poröse und / oder röhrenförmige Strukturen sind nicht leicht behandelbar in den Poren oder dem Lumen verbunden. naßchemischenauf PTFE ist eine schwierige Aufgabe aufgrund der stark inert Natur des fluorin enthaltenden Polymer , das die meisten chemischen Angriffen 15 widersteht . In diesem Papier beschreiben wir ein vergleichsweise einfaches Verfahren für eine kovalente Modifikation Strategie. Angepasst von einem Verfahren PTFE bindungsfähig zu machen, funktionelle Gruppen wurden auf der Materialoberfläche geschaffen, die für eine weitere Konjugation von biologisch aktiven Molekülen als Ankerpunkte dienen.

<table><tbody><tr><td>PTFE foil 0.5 mm</td><td>Cadillac Plastic&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>REDV peptide</td><td>Genecust</td><td>n/a</td><td>custom synthesis &gt;95% purity</td></tr><tr><td>iso-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofurane (THF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>molecular sieve 3 &amp;Aring;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208574</td><td></td></tr><tr><td>sodium metal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>483745</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>naphthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147141</td><td></td></tr><tr><td>hydrogen peroxide 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>trichloroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>diethylene glycol diglycidyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17741</td><td></td></tr><tr><td>hexamethylene diisocyanate (HMDI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52650</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56496</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662 160</td><td></td></tr><tr><td>ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850</td><td>&amp;nbsp;Nicolet</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope Olympus X-70</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>humbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ePTFE vascular graft</td><td>Gore</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

wet chemistry and peptide immobilization on polytetrafluoroethylene for improved cell-adhesion

Stiften Materialien Oberfläche mit zellKlebeEigenschaften ist eine gemeinsame Strategie in Biomaterial Forschung und Tissue Engineering. Dies ist besonders interessant für bereits zugelassene Polymere, die eine langjährige Verwendung in der Medizin haben, weil diese Materialien sind gut charakterisiert und rechtliche Fragen bei der Einführung im Zusammenhang von neu synthetisierten Polymere vermieden werden können. Polytetrafluorethylen (PTFE) ist eine der am häufigsten verwendeten Materialien für die Herstellung von Gefäßprothesen, aber das Polymer fehlt Förderung Merkmale Zelladhäsion. Endothelialisierung, dh eine vollständige Abdeckung der Transplantate Innenfläche mit einer konfluenten Schicht von Endothelzellen ist der Schlüssel für eine optimale Leistung angesehen, vor allem durch Thrombogenität der künstlichen Schnittstelle reduziert wird . Diese Studie untersucht, das Wachstum von Endothelzellen auf Peptid-modifiziertem PTFE und vergleicht diese Ergebnisse mit denen auf unmodifizierte Substrat erhalten. Kupplung mit demendotheliale Zellen-Haftungs-Peptid Arg-Glu-Asp-Val (REDV) über die Aktivierung des fluorin enthaltenden Polymers unter Verwendung des Reagenzes Natriumnaphthalenid, gefolgt durch nachfolgende Konjugation Schritten durchgeführt. Zellkulturen Zellen (HUVECs) und eine hervorragende Zellwachstum auf Peptid-immobilisierte Material unter Verwendung von humanen Umbilical Vein Endothelial erreicht wird, ein Zeitraum von zwei Wochen gezeigt über.

Die Ergebnisse der entscheidenden chemischen Reaktionsschritte wurden durch IR - Spektroskopie (Figur 1) überwacht. Die anfängliche Aktivierung mit Natriumnaphthalenid erzeugt Doppelbindungen - und in geringerem Umfang - OH-Funktionalitäten. Das Signal, das anzeigt C = C-Bindungen verschwinden bei der Oxidation, eine Oberfläche ergibt sich fast ausschließlich Hydroxyl-Gruppen tragen. Analyse weiterer Standard Konjugation Schritte sind hier nicht dargestellt. Die Farbe ändert sich aufgrund der Aktivierung und Oxidation sind in Übereinstimmung mit dem erwarteten Chemie, der verwendet wird: konjugierte Doppelbindungssysteme sind zu erwarten sein bräunlich und seinen Verlust Ergebnisse in Aufhellung (Abbildung 2). Darüber hinaus wurde das mögliche Ergebnis der Aktivierung und Oxidation auf der Oberflächenmorphologie durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Praktisch keine nachteilige Wirkung der Behandlung wurde beobachtet (Abbildung 2). Figuren 3 und 4 zeigen die Ergebnisse der REDV-Immobilisierung auf endotheliale Zellwachstum. Während praktisch keine Zelladhäsion und Proliferation auf unbehandeltem Material tritt unterstützt die Änderung stark Besiedlung über einen Zeitraum von zwei Wochen. Exemplifiziert für eine klinische Anwendung (dh Gefäßtransplantaten) wurde die Modifikation identisch auf Originalmaterial aus einem handelsüblichen Transplantats ausgeführt aus expandiertem PTFE mit ähnlichen Ergebnissen über einen Zeitraum von einer Woche (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig1.jpg" /> Abbildung 1. IR - Spektroskopie von PTFE. Die Behandlung von unberührten PTFE (A) führt zur Bildung von Doppelbindungen und bis zu einem gewissen Ausmaß von Hydroxyfunktionen (B). Anschließend C = C - Bindungen aufgrund reduziert werden auf die Oxidation (C </strong&gt;). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig2.jpg" /> Abbildung 2. optische Erscheinungsbild von nackten und oberflächenaktivierte PTFE. (A) Die unbehandelten PTFE (links) erscheint weiß, die Aktivierung Natriumnaphthalenid Verwendung ergibt eine dunkelbraune Farbe (Mitte) , die leicht bei der Oxidation aufgehellt wird (rechts). Unbehandelte (B) und oxidierten PTFE (C) Proben wurden zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht (Vergrößerung: 2,000X). Discs sind 12 mm im Durchmesser. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3. Die endotheliale Zellkultur auf unberührten und Peptid-modifiziertem PTFE. Unbehandelte Proben nicht durch ECs kolonisiert (A, C, E nach 24 Stunden, 1 w und 2 w jeweils) , während die Haftung und das Wachstum auf Peptid-modifizierten Materials stark verbessert (B, D und F nach 24 Stunden, 1 w und 2 w beziehungsweise). Maßstabsbalken:. 100 &amp; mgr; m, Vergrößerung 100X <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantifizierung der Zellenabdeckung durch ImageJ Analyse. Zellwachstum auf blankem PTFE (A, C,E) und auf REDV-konjugierten Polymeroberflächen (B, D, F) , ausgedrückt als prozentuale Bedeckung der Gesamtfläche. Immobilisierte Peptid ermöglicht deutlich Anfangshaftung (B) und unterstützt die Besiedlung über einen Zeitraum von 2 Wochen (D, F). Dreifachbestimmungen, Mittelwert ± Standardabweichung). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig5.jpg" /> Abbildung 5. Endothelial - Zellen für 1 Woche auf expandiertem PTFE gezüchtet. Die Struktur des ePTFE gezeigt Rasterelektronenmikroskopie unter Verwendung von (A). Die Ergebnisse auf poröses Material erhalten werden, sind in Übereinstimmung mit den für Flach PTFE Probe erhalten. Im Gegensatz zu den wenigen Zellenauf blankem Material (B) die modifizierte Oberfläche (C) stellt ein ausgezeichnetes Substrat für das Zellwachstum. Maßstabsbalken sind 100 &amp; mgr; m für A, B und C sind. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54272/54272fig6.jpg" /> Figur 6 Schematische Darstellung der chemischen Modifizierung von PTFE unter Verwendung von Nasschemie. Doppelbindungen , die durch Na-Naphthalenid Behandlung oxidiert werden, was zu OH-Funktionalitäten. Ein Hydroxyl-reaktives Diisocyanat wird dann mit einem Amin immobilisiert und hydrolysiert. Schließlich wird das bifunktionelle Diepoxid wird angewendet , um das REDV- Peptid mit dem N-terminalen Aminogruppe. Konjugieren <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54272/54272fig6large.jpg" target="_blank">um v</a>IEW eine größere Version dieser Figur.

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Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Nasschemie und Peptid Immobilisation auf Polytetrafluoroethylen für verbesserte Zellhaftung

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

wet-chemistry-peptide-immobilization-on-polytetrafluoroethylene-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.6K Aufrufe.  Sidra Cardiovascular Research. Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Serie: Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large variety of PEG molecular weights and configurations (arm number, arm length, and branching pattern) affords researchers tight control over resulting hydrogel structures and properties, including Young&#8217;s modulus and mesh size. This video will illustrate a rapid, efficient, solvent-free, microwave-assisted method to methacrylate PEG precursors into poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDM). This synthetic method provides much-needed starting materials for applications in drug delivery and regenerative medicine. The demonstrated method is superior to traditional methacrylation methods as it is significantly faster and simpler, as well as more economical and environmentally friendly, using smaller amounts of reagents and solvents. We will also demonstrate an adaptation of this technique for on-resin methacrylamide functionalization of peptides. This on-resin method allows the N-terminus of peptides to be functionalized with methacrylamide groups prior to deprotection and cleavage from resin. This allows for selective addition of methacrylamide groups to the N-termini of the peptides while amino acids with reactive side groups (e.g.&#160;primary amine of lysine, primary alcohol of serine, secondary alcohols of threonine, and phenol of tyrosine) remain protected, preventing functionalization at multiple sites. This article will detail common analytical methods (proton Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (;H-NMR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight mass spectrometry (MALDI-ToF)) to assess the efficiency of the functionalizations. Common pitfalls and suggested troubleshooting methods will be addressed, as will modifications of the technique which can be used to further tune macromer functionality and resulting hydrogel physical and chemical properties. Use of synthesized products for the formation of hydrogels for drug delivery and cell-material interaction studies will be demonstrated, with particular attention paid to modifying hydrogel composition to affect mesh size, controlling hydrogel stiffness and drug release.

Microwave-assisted Functionalization of Polyethylene glycol and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

This video will illustrate a rapid, efficient method to methacrylate poly(ethylene glycol), enabling chain polymerizations and hydrogel synthesis. It will demonstrate how to similarly introduce methacrylamide functionalities into peptides, detail common analytical methods to assess functionalization efficiency, provide suggestions for troubleshooting and advanced modifications, and demonstrate typical hydrogel characterization techniques.

Mikrowellen-unterstützte Funktionalisierung von Poly (Ethylenglycol) und On-Harz Peptide zur Verwendung in Kettenpolymerisationen und Hydrogelierung

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Forschung

Chemie

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biochemie

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Kapillarelektrophorese zum Monitor Peptid Verpflanzen auf Chitosanfilme in Echtzeit

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Biotechnik

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, improving the biocompatibility of metal stents remains a significant challenge. The goal of this protocol is to describe a robust technique of metal surface modification by biologically active peptides to increase biocompatibility of blood contacting medical implants, including endovascular stents. CD47 is an immunological species-specific marker of self and has anti-inflammatory properties. Studies have shown that a 22 amino acid peptide corresponding to the Ig domain of CD47 in the extracellular region (pepCD47), has anti-inflammatory properties like the full-length protein. In vivo studies in rats, and ex vivo studies in rabbit and human blood experimental systems from our lab have demonstrated that pepCD47 immobilization on metals improves their biocompatibility by preventing inflammatory cell attachment and activation. This paper describes the step-by step protocol for the functionalization of metal surfaces and peptide attachment. The metal surfaces are modified using polyallylamine bisphosphate with latent thiol groups (PABT) followed by deprotection of thiols and amplification of thiol-reactive sites via reaction with polyethyleneimine installed with pyridyldithio groups (PEI-PDT). Finally, pepCD47, incorporating terminal cysteine residues connected to the core peptide sequence through a dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, are attached to the metal surface via disulfide bonds. This methodology of peptide attachment to metal surface is efficient and relatively inexpensive and thus can be applied to improve biocompatibility of several metallic biomaterials.

Presented here is a protocol for appending peptide CD47 (pepCD47) to metal stents using polybisphosphonate chemistry. Functionalization of metal stents using pepCD47 prevents the attachment and activation of inflammatory cells thus improving their biocompatibility.

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Evaluierung biofunktioneller selbstorganisierender Peptide auf Zelladhäsion und Morphologie

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of hydrogels that are biocompatible, biodegradable, and non-immunogenic. We have previously proven that SAPs, when biofunctionalized with protein-derived motifs, can mimic the extracellular matrix characteristics that support colorectal organoid formation. These biofunctional peptide hydrogels retain the original parent peptide's mechanical properties, tunability, and printability while incorporating cues that allow cell-matrix interactions to increase cell adhesion. This paper presents the protocols needed to evaluate and characterize the effects of various biofunctional peptide hydrogels on cell adhesion and lumen formation using an adenocarcinoma cancer cell line able to form colorectal cancer organoids cost-effectively. These protocols will help evaluate biofunctional peptide hydrogel effects on cell adhesion and luminal formation using immunostaining and fluorescence image analysis. The cell line used in this study has been previously utilized for generating organoids in animal-derived matrices.

Autor im Rampenlicht: Optimierung ultrakurzer Peptidmatrizen für Darmkrebs-Organoide

This protocol aims to evaluate biofunctional self-assembling peptides for cell adhesion, organoid morphology, and gene expression by immunostaining. We will use a colorectal cancer cell line to provide a cost-effective way of obtaining organoids for intensive testing.

Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...