The authors acknowledge the funding support from the Ministry of Education, Singapore, grant number MOE2010-IF-1-025.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di cura degli animali e l&#39;uso della School of Applied Science, Temasek Politecnico. 1. Preparazione di DMN <ol><li> Pipettare 200 ml di DMN (1 g / ml di soluzione) e aggiungere 19,8 ml di PBS per preparare la soluzione DMN 10 mg / ml per l&#39;iniezione. Nota: DMN è cancerogeno. Utilizzare una cappa aspirante per preparare il DMN ed eseguire le iniezioni di animali. </li></ol> 2. iniezione intraperitoneale di DMN <ol><li> Utilizzare ratti maschi Wistar con un peso medio di 150 - 200 g. Ambientarsi ratti per 4 - 7 giorni prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Mantenere i ratti a temperatura ambiente di 22 ± 1 ° C, con 12 ore di luce e 12 ore cicli scuri. Fornire ratto chow e acqua ad libitum. </li><li> Misurare cibo e acqua assunzioni giornaliere. Misurare il peso corporeo a settimana. </li><li> Calcolare la quantità di DMN per ogni ratto base a una dose di 10 mg / kg di peso corporeo. Utilizzare una siringa da 1 ml con un calibro 25 ago to disegnare il volume calcolato di soluzione DMN nella siringa. </li><li> Trattenere il ratto per l&#39;iniezione intraperitoneale 21. </li><li> Con il ratto adeguatamente trattenuto, introdurre l&#39;ago nel quadrante inferiore destro dell&#39;addome, disegnare indietro lo stantuffo della siringa (non deve essere aspirato) per verificare il corretto posizionamento dell&#39;ago all&#39;interno dello spazio addominale e iniettare lentamente soluzione DMN. </li><li> Quando la dose di DMN è stato somministrato, ritirare lentamente l&#39;ago e smaltire nel bidone taglienti. </li><li> Eseguire le iniezioni intraperitoneali di DMN per 3 giorni consecutivi a settimana per 4 settimane. Amministrare le iniezioni alla stessa ora ogni giorno. Re-calcolare il dosaggio in base al peso corporeo all&#39;inizio di ogni settimana di iniezioni. </li><li> Prelevare il sangue dalla vena della coda settimanale per misurare i parametri biochimici: alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) 22. </li><li> Misura siero ALT e AST utilizzando un Vet commercialeProva analizzatore chimico. </li></ol> 3. Esame Gross e Harvest di fegato <ol><li> Euthanize i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital alla dose di 100 mg / kg di peso corporeo. Assicurare morte controllando la mancanza del battito cardiaco. </li><li> Preparati per il post mortem e valutare le condizioni dell&#39;animale come descritto da Parkinson et al. 23 Place topi morti sulla dissezione bordo in decubito dorsale con l&#39;addome rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Disinfettare e inumidire la pelle con il 70% di etanolo. </li><li> Utilizzando le forbici, incidere la pelle della lunghezza del ventre dall&#39;ano al mento, e riflettono la pelle. Con le forbici, incidere la parete addominale dall&#39;ano alla cartilagine xifoide, per esporre visceri addominali. </li><li> Esaminare gli organi addominali in situ per verificare la presenza di eventuali anomalie. Prendere nota di eventuali cambiamenti di colore, le dimensioni, la posizione di organi e la presenza di liquido nella cavità peritoneale. Esaminarela consistenza di organi e notare la presenza di eventuali odori. </li><li> Utilizzando forbici e pinze, sezionare l&#39;intero libera fegato dei suoi legamenti e allegati. <ol><li> Iniziare a ilo dove è attaccato al diaframma e lavorare per liberare tutti i lobi del fegato di allegati. Asportare accuratamente tutti i legamenti e vasi sanguigni. </li></ol></li><li> Trasferire il fegato su una capsula di Petri e pesare il fegato. </li><li> Usando un bisturi, tagliare 2 - 5 mm di spessore sezioni dei lobi del fegato. Per coerenza, sempre prelevare campioni dello stesso lobo epatico. Prendere un cuneo di circa 5 mm di diametro di spessore, dal lobo laterale destro 24 a circa 1 cm dal bordo del luogo lobe.Immediately in 10% formalina tamponata per il fissaggio. Assicurarsi che il tessuto del volume di formalina è di 1:10 o più. </li><li> Raccolta e immediatamente congelare porzioni (usando azoto liquido) di lobi epatici a questo punto se richiesto per altri studi. Per quanto riguarda la (3.8), campione della stessa lobo epatico di coerenza. </li></ol><ol><li> Fissare i campioni di fegato nel 10% formalina tamponata per un minimo di 24 ore. </li><li> Dopo la fissazione, tagliare il fegato, riporre in cassette e caricarli nel cesto del processore tessuti automatizzato. </li><li> Posizionare il cestino con le cassette in la prima stazione, che contiene il 10% formalina tamponata. Assicurarsi che le cassette sono interamente sommerse. Essi possono rimanere in questa camera per un massimo di 12 ore fino a quando inizia il ciclo. </li><li> Programmare il processore tessuti per ruotare le cassette per 1 ora ciascuno, attraverso successive stazioni contenenti le seguenti soluzioni: etanolo a concentrazioni di 50%, 70%, 90%, 100% (2 stazioni), xilene (2 stazioni) e paraffina liquida ( 2 stazioni). </li><li> Trasferire i campioni di fegato nel bagno di cera della stazione incorporamento. Assicurarsi che la macchina incorporamento è inserita almeno un&#39;ora prima. </li><li> Uso di pinze pre-riscaldato (65 ° C), rimuovere ogni cassetta dal wvasca ax e posto sulla piastra calda (65 ° C) della macchina incorporamento. Versare quantità sufficiente di paraffina liquida nello stampo base in acciaio inox (preriscaldata a 65 ° C) fino a metà piena. Trasferire la sezione del fegato dalla cassetta nello stampo. Assicurarsi che il campione sia posizionato con la superficie di taglio (da esaminare al microscopio) piatta sul fondo dello stampo. </li><li> Riempire lo stampo completamente con paraffina liquida, montare la cassetta vuota sulla parte superiore e posizionare lo stampo sul piatto C 4 ° della macchina incorporamento raffreddare per almeno 30 minuti. </li><li> Controllare che la cera si è raffreddato e solidificato, e rimuovere il blocco di paraffina dallo stampo. Il blocco dovrebbe saltar fuori facilmente e non attaccare o crack. In questo caso, sciogliere il blocco e ripetere questo passaggio. Il blocco di paraffina può essere sezionato una volta si solidifica. I blocchi possono essere conservati a temperatura ambiente per molti anni. </li><li> Posizionare il blocco di paraffina nel microtomo e la sezione a 10 micron di spessore fino a quando lo strato di ceraviene rimosso sufficientemente per il tessuto epatico incorporato sia visibile. </li><li> Modificare l&#39;impostazione sul microtomo per tagliare a 5 micron di spessore. Utilizzando pinze, prendere una sezione ben tagliato tenendolo sul bordo e galleggiare attentamente la sezione nel bagnomaria alla temperatura di 40 ° C. </li><li> Posizionare delicatamente un vetrino pulito nella sezione galleggiante e sollevarlo sulla superficie del vetrino. Posizionare il vetrino su un vetrino più caldo a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 5. Masson colorazione tricromica <ol><li> Prima di applicare le macchie, trattare i vetrini per rimuovere la cera e reidratare i tessuti come segue: <ol><li> Immergere le sezioni in xilene per 5 min. Ripetere 2x. </li><li> Immergere le sezioni in 100% di etanolo per 3 min. Ripetere 1x. </li><li> Porre le sezioni per 1 min in ciascuna delle seguenti soluzioni di etanolo: 90%, 80% e 70%. </li></ol></li><li> Sciacquare il vetrino sotto l&#39;acqua del rubinetto per rimuovere ogni etanolo esistente sulla diapositiva. </li><li> Immergere i vetrini in ferro ematossilina per 10 min a macchiare il nucleo. </li><li> Risciacquare i vetrini con acqua per rimuovere l&#39;eccesso di colorante dalla diapositiva. </li><li> Immergere i vetrini in Biebrich Scarlet-Fucsina acida per 2 minuti a macchiare il citoplasma. </li><li> Sciacquare i vetrini con acqua. </li><li> Porre i vetrini in fosfotungstico / fosfomolibdico soluzione di acido per 10 minuti a promuovere l&#39;adozione di anilina blu. Cambiare la soluzione di acido fosfotungstico / fosfomolibdico dopo 2 giri di utilizzo. </li><li> Porre i vetrini in soluzione blu di anilina per 10 minuti per colorare le fibre di collagene. </li><li> Lavare la macchia in eccesso con acqua e posizionare i vetrini in soluzione all&#39;1% di acido acetico per 1 min per consentire differenziazione avvenga per rendere il colore della diapositiva più delicato e trasparente. </li><li> Sciacquare i vetrini con acqua e procedere a disidratare le sezioni di tessuto. I passi disidratazione sono i seguenti: </li><li> Immergere i vetrini successivamente per 10 secondi ogni volta, nel seguente concentrations di etanolo: 70%, 80%, 95% e 100%. </li><li> Immergere i vetrini per 30 secondi in 100% di etanolo. Ripetere 1x. </li><li> Sciacquare i vetrini attraverso 3 stazioni di xilene per 5 minuti ciascuna per rimuovere l&#39;etanolo. </li><li> Montare un vetrino di vetro sulle campione con mezzo di montaggio (ad esempio, DPX di montaggio) e lasciare asciugare. Nota: DPX è una resina sintetica che asciuga rapidamente, conserva macchia e protegge la sezione di tessuto. </li></ol> 6. Fibrosi punteggio su di Masson Tricoma macchiate Sezioni di fegato <ol><li> Avere un patologo veterinario valutare la gravità della fibrosi secondo il punteggio di fibrosi 25. Sarebbe ottimale se il punteggio di fibrosi è fatto da due o tre patologi indipendentemente in modo cieco. In un tale scenario, è necessario ottenere un punteggio finale dopo la discussione e la revisione di gruppo per risolvere eventuali differenze di punteggio. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Punto </td><td> Descrizione </td></tr><tr><td> 0 </td><td> No fibrosi </td></tr><tr><td> 1 </td><td> espansione fibrosa di alcune aree del portale, con o senza breve setti fibrosi </td></tr><tr><td> 2 </td><td> espansione fibrosa della maggior parte delle aree del portale, con o senza breve setti fibrosi </td></tr><tr><td> 3 </td><td> espansione fibrosa della maggior parte delle aree del portale, portale occasionale a portale (PP) bridging </td></tr><tr><td> 4 </td><td> espansione fibrosa aree del portale con marcata ponte (portale a portale (PP) e portale centrale (PC) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Contrassegnato bridging (PP e / o PC) con noduli occasionali (cirrosi incompleta) </td></tr><tr><td> 6 </td><td> Cirrosi, probabile o certa </td></tr></tbody></table> Tabella 1: punteggio di fibrosi utilizzato per la lettura Sezioni Tricoma macchiato fegato del Masson 25.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo descritto un metodo per rendere un modello animale di fibrosi epatica e di valutare la gravità della fibrosi epatica. E &#39;importante per fornire la dose corretta di DMN e rispettare il calendario delle iniezioni intraperitoneali settimanali. Mentre il test procede, è fondamentale per pesare i ratti e ricalcolare la dose all&#39;inizio di ogni settimana di iniezioni DMN. Tenete a mente che DMN è tossico e deve essere gestita nel quadro dei fumi. Eseguiamo le iniezioni intraperitoneali nell&#39;armadio fumi pure. Con la necessità di iniezioni ripetute, il sistema di ritenuta corretta e la tecnica di iniezione è importante per evitare l&#39;introduzione di contaminanti e danni agli organi interni. Raramente abbiamo la mortalità per le iniezioni intraperitoneale. I ratti devono essere monitorati 2 volte al giorno per tutto il periodo sperimentale. Durante l&#39;ultima settimana di iniezione DMN, gli animali devono essere osservati anche più frequentemente e strettamente per i segni moribondi. Questo è il period quando danni al fegato è più grave e ratti affetti verrà inappetenti, perdere peso corporeo e la condizione. 25 - 40% dei ratti può diventare gravemente malati durante questo periodo e morire se non vi è alcun intervento veterinaria. Quindi un attento monitoraggio permette al ricercatore di valutare le condizioni dell&#39;animale e piano adeguato cessazione dell&#39;esperimento in modo che gli organi possono essere appena raccolte da un topo eutanasia invece di essere perso a decadere dalla morte inaspettata. Abbiamo trovato la misurazione settimanale dei livelli di ALT e AST per essere utili indicatori di progressione del danno epatico. Abbiamo anche osservato che l&#39;AST è meno specifico di ALT e attribuire questo al suo rilascio dalla eritrociti danneggiati e il tessuto muscolare in aggiunta al fegato. Assicurarsi che il volume sufficiente di sangue viene raccolto per fornire il volume richiesto di siero per l&#39;analisi. Noi di solito raccogliere 200 - 300 ml di sangue al topo. Durante il collection di tessuto epatico per l&#39;esame istologico, si consiglia il campione essere ottenuto dalla stessa lobo. Questa operazione viene eseguita dopo aver verificato che i cambiamenti nel fegato sono uniformi. DMN provoca cambiamenti generalizzati nel fegato. Nelle fasi iniziali dello studio, abbiamo provato dai lobi laterali e mediale sinistro e il lobo mediale destra. Non abbiamo osservato differenze nei cambiamenti microscopici tra questi lobi. sezioni epatici devono essere fissati in 10% formalina tamponata per almeno 24 ore e processati subito dopo. L&#39;immersione prolungata oltre una settimana può provocare nel tessuto divenire fragile e difficile sezione dopo paraffina. Taglio adatti 5 micron sezioni sottili richiede pratica e pazienza. Le sezioni che sono valutati per essere adatto ad occhio nudo (Punto 4.11) possono essere esaminate con il microscopio per controllare che non hanno artefatti come pieghe o strappi all&#39;interno della sezione. La procedura di colorazione è meglio completato in base tO i periodi di tempo di immersione slitta ad ogni passo, senza pause di riposo. Durante il processo di colorazione, assicurano che le sezioni sono mantenute umido sempre e trasferiti da una soluzione colorante per la successiva non appena possibile. Valutazione delle sezioni di Masson Tricoma macchiato per il grado di fibrosi richiede l&#39;inserimento di un patologo veterinario. Lui / Lei è un membro fondamentale della squadra che dovrebbe essere parte dello studio fin dall&#39;inizio, come lui / lei sarebbe in grado di consigliare e partecipare alla corretta raccolta di organi in tutte le fasi dell&#39;esperimento. Così l&#39;attuale gold standard per la fibrosi epatica di punteggio è la valutazione delle sezioni di tessuto opportunamente colorate da un patologo. Anche se sarebbe ottimale avere l&#39;ingresso di più di un patologo, questo potrebbe non essere possibile in piccole organizzazioni. In tali casi, l&#39;obiettività può essere migliorata con l&#39;uso di tecnologia di imaging 26. Abbiamo trovato che i risultati di tecnologia di imagingsono paragonabili a punteggio patologico (dati non pubblicati), e raccomanda che venga usato come metodo supplementare di valutazione. In sintesi, il modello indotta DMN di fibrosi epatica ha molti vantaggi rispetto ad altri modelli animali. È un modello relativamente facile da fare in quanto non richiede abilità chirurgiche. DMN è l&#39;ambiente più sicuro e meno tossici per l&#39;uomo e gli animali di CCl 4 e richiede un tempo più breve per indurre la malattia di TAA. Rispetto alle malattie del fegato prodotto da CCl 4, TAA e del dotto biliare legatura, DMN produce una rappresentazione più vicina della fibrosi epatica umana. Per queste ragioni, si prevede che il modello continuerà ad essere ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi della fibrosi epatica, così come per lo screening di potenziali agenti anti-fibrotiche.

DMN è una tossina specifica potente del fegato. Il suo metabolismo, distribuzione tissutale, e la capacità di causare lesioni a fegato di ratti è stato segnalato da Magee 1, e il meccanismo di danno degli epatociti e la morte cellulare per apoptosi è stato descritto da Pritchard e Butler 2. La somministrazione intermittente di questo composto è stato segnalato per indurre la fibrosi epatica nei cani e nei ratti 3,4. I meccanismi e le variazioni morfologiche della fibrosi epatica sono stati ampiamente studiati utilizzando questo modello. Nei primi studi con il topo, il trattamento di 3 settimane con DMN ha prodotto necrosi emorragica centrolobulare seguito da cirrosi micronodulare senza steatosi 5. E &#39;stato dimostrato che nella fibrosi precoce, il collagene formato era più trasversale collegata con il tipo III di essere più prominente di tipo I 6. In comune con altre cause, i cambiamenti fibrotici DMN-indotta sono stati associati con un aumento delle cellule di Kupffer; macrofagi epatici che risiedonon sinusoidi. Queste cellule si trasformano in miofibroblasti e producono quantità eccessive di matrice extracellulare, che è il problema principale nella fibrosi 7. In termini di segnalazione cellulare, Nakamura et al. Hanno dimostrato che il TGF-β gioca un ruolo critico nella progressione della fibrosi epatica 8. Hanno usato un adenovirus che esprime un tronco di tipo II recettore TGF-β, di inibire specificamente la segnalazione del TGF-β. fibrosi epatica in questi ratti è stata spettacolare interrotta durante il trattamento DMN rispetto ai gruppi di controllo. Altri studi hanno confermato che la soppressione del TGF-β porta alla riduzione di fegato sviluppo della fibrosi 9,10. Il modello è stato utilizzato anche in uno studio globale profilazione genetica per identificare altri marcatori di fibrosi e le proteine ​​che potrebbero essere utilizzati come bersagli farmacologici per la terapia anti-fibrotica 11. Altri agenti chimici usati per indurre la fibrosi epatica includere tioacetammide (TAA) e Ctetracloruro di arbon (CCL 4). TAA è stato usato per la prima nei ratti e poi nei topi 12. I vantaggi di questo modello sono: facilità di somministrazione chimica nell&#39;acqua, la riproducibilità del modello con caratteristiche cirrosi micronodulare e biochimici potabile. Gli svantaggi sono: il lungo periodo di tempo di 3 mesi per la fibrosi epatica per lo sviluppo e la mancanza di comprensione del meccanismo molecolare per l&#39;induzione della fibrosi epatica. Per quanto riguarda CCl 4, il suo uso è diminuito per i seguenti motivi: non imitare malattie del fegato umano, hanno effetti nocivi per lo strato di ozono, provoca dolore e sofferenza agli animali, è molto tossico per l&#39;uomo e non richiede ulteriori precauzioni nella sua manipolazione e lo smaltimento 13,14. Prolungata ostruzione biliare (mediante intervento chirurgico) come modello sperimentale per la cirrosi epatica è stato riportato da Kountouras et al. 15. Questo metodo non è tossico per l&#39;uomo e gli animali. HTuttavia, il punto tempo richiesto per la fibrosi epatica sviluppare varia. Una revisione di 30 rapporti di Marques et al. 16, ha scoperto che ci sono voluti da sette giorni a quattro settimane dopo l&#39;intervento chirurgico per la fibrosi epatica a svilupparsi. I cambiamenti patologici descritti imitano quelli di fibrosi biliare cronica umana e il modello sarebbe più adatto per i ricercatori interessati a questo settore. In sintesi, la somministrazione intermittente di una dose costante di DMN nel ratto per 4 settimane produce fibrosi epatica che imita la malattia umana. Ratti Dosed mostrano lo sviluppo progressivo di danni al fegato e parenchimale la fibrosi 4,17. Progressione e la gravità della malattia possono essere monitorati tramite campioni di sangue o sacrificio degli animali in punti temporali specifici e l&#39;effetto è altamente riproducibile 18. Così il modello è stato ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi della fibrosi epatica e cirrosi nonché per lo screening per potenziali agenti anti-fibrotica 10,19,20.

<table><tbody><tr><td>Dimethylnitrosamine</td><td>Wako</td><td>147-03781</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sinopharm chemicals</td><td>F63257009</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Masson trichome stains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aniline Blue</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#42755</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuschin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT42685</td><td></td></tr><tr><td>Scarlet Red</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#26905</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>ALFA AESAR</td><td>ALFA40116.4</td><td></td></tr><tr><td>Phosphomolybdic Acid Hydrate</td><td>Sigma SG</td><td>221856-25G</td><td></td></tr><tr><td>Weigert&#039;s Iron Hematoxilyn</td><td>Merck</td><td>1.15973.0002</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>Merck</td><td>HX066873</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Leica</td><td>Leica TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Embedding machine</td><td>Sakura</td><td>&amp;nbsp;Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>Leica RM 2235</td><td></td></tr><tr><td>Vet Test Analyzer</td><td>Idexx</td><td>Vet Test 8008</td><td></td></tr></tbody></table>

the dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat

Da quattro a sei settimane di età, i ratti maschi Wistar sono stati usati per la produzione di modelli animali di fibrosi epatica. Il processo richiede quattro settimane di somministrazione di 10 mg / kg dimetilnitrosamina (DMN), dato per via intraperitoneale per tre giorni consecutivi a settimana. iniezioni intraperitoneali sono state eseguite nella cappa come DMN è un hepatoxin noto e cancerogena. Il modello presenta diversi vantaggi. In primo luogo, i cambiamenti del fegato possono essere studiati in sequenza o in particolari fasi di interesse. In secondo luogo, lo stadio della malattia epatica può essere monitorato attraverso la misurazione di aminotransferasi sierica aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) enzimi. In terzo luogo, la gravità del danno epatico in diverse fasi può essere confermata dal sacrificio di animali in momenti designati, seguita da esame istologico dei tessuti del fegato Tricoma macchiate di Masson. Dopo quattro settimane di trattamento DMN, il tipico punteggio di fibrosi è da 5 a 6 sulla scala di Ishak. Il modello può essere riprodotto in modo coerente ed è stataampiamente utilizzato per valutare l&#39;efficacia di potenziali agenti anti-fibrotiche.

DMN ratti trattati perdere peso e diventare meno vigorosa con il cappotto di capelli arruffati. Vi è una significativa perdita di peso corporeo medio di ratti trattati DMN; prima rilevabile dopo 2 settimane di trattamento DMN, e questa differenza rimane attraverso settimane 3 e 4 dopo il trattamento DMN (Figura 1a). Mentre i topi ricevono DMN over settimane successive, danni al fegato induce a diventare più piccolo. L&#39;indice del fegato; che è la percentuale di peso del fegato in peso finale era significativamente inferiore per i ratti trattati DMN (Figura 1b). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54208/54208fig1.jpg" /> Figura 1: a) Il peso corporeo di DMN trattati ratti. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard (n = 6 - 8). * P &lt;0.05 rispetto al gruppo di controllo normale b) l&#39;indice del fegato.; per cento in peso del fegato al peso corporeo finale della DMN trattati ratti dopo 4 settimane di DMN treatment. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard (n = 6 - 8). * P &lt;0.05 rispetto al normale gruppo di controllo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54208/54208fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Al sacrificio, dopo 4 settimane di trattamento DMN, il fegato è più piccolo e più difficile (figura 2a) rispetto a quelli di età compresa tra animali di controllo corrispondenti (Figura 2b). Fibrina può essere presente sulla superficie fegato e lobi epatici adiacenti sono rispettate. Circa il 20% dei ratti hanno ascite. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54208/54208fig2.jpg" /> Figura 2: a) di fegato da un ratto dopo 4 settimane di trattamento DMN b) fegato da età ratti di controllo abbinato.. In (a) il fegato è rimpicciolito, fermo e pallido con una sfumatura giallastra rispetto al fegatodal suo controllo abbinato età. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54208/54208fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Lesioni al fegato causa un aumento della permeabilità della membrana cellulare degli epatociti. L&#39;aumento di ALT e AST siero sono indicatori di danno degli epatociti. Sierica (Figura 3a) e AST (Figura 3b) del gruppo DMN trattati sono significativamente più alto rispetto al gruppo di controllo dopo settimane 2 e 4 di iniezione di DMN. I livelli sierici di ALT e AST aumentano tipicamente dopo ogni settimana di trattamento DMN. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54208/54208fig3.jpg" /> Figura 3: a) aminotransferasi sierica aminotransferasi (ALT) e b) aspartato aminotransferasi (AST) livelli di ratti trattati DMN alle settimane 0, 2 e 4 dopo l&#39;ultima iniezione di DMN. I dati sono represented come mezzo ± SD (n = 6 - 8). * P &lt;0.05 rispetto al normale gruppo di controllo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54208/54208fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;esame istologico di fegati di ratti trattati DMN mostrano che vi è progressivo aumento e l&#39;espansione dei setti fibrosi, con perdita di epatociti, nel tempo rispetto ai ratti di controllo. Tricoma macchia di Masson è comunemente usato per evidenziare depositi di collagene nel tessuto del fegato: questi sono macchiati blu. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54208/54208fig4.jpg" /> Figura 4: microfotografie di sezioni di fegato colorati con Tricoma di Masson: a) sezione di fegato da un normale topo di controllo; b) sezione di fegato da un ratto dopo aver ricevuto 1 settimana dalla dimethylnitrosamine (DMN); c) sezione di fegato da un ratto dopo aver ricevuto 2 settimane di DMN. C&#39;è fibroso espansione della maggior parte delle aree del portale con il portale a portale occasionale colmare. D) sezione di fegato da un ratto dopo aver ricevuto 3 settimane di DMN. Si noti l&#39;espansione fibrosa di aree del portale con marcata portale a portale, così come portale per e) sezione del fegato centrale a ponte. Da un ratto dopo aver ricevuto 4 settimane di DMN. Vi è la cirrosi con formazione di noduli. Il fegato è il controllo del gruppo sacrificato insieme a ratti dopo 4 settimane di iniezione DMN. Vi è un modello di aumento progressivo di fibrosi da 0 in (a); 2 (b); 3 (c) 4 (d) a 5/6 in (e). Tutti microfotografie sono state prese con un ingrandimento di 40X con 1 unità di lunghezza della barra di livello equivalente a 100 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54208/54208fig4large.jpg" target="_blank">Prega c</a>leccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Il dimetilnitrosamina indotta fibrosi epatica modello nel ratto

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.0K Views.  Temasek Polytechnic. We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

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Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sviluppo di un modello di fegato Fibrotic etanolo-indotta in zebrafish per studiare progenitrici cellulo-mediata epatociti Rigenerazione

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently host immune responses to microbial and environmental agents. Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis allows one to study the pathogenesis of IBD associated environmental triggers such as stress and diet, the effects of potential therapies, and the mechanisms underlying intestinal inflammation and mucosal injury. In this paper, we investigated the effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on the colonic mucosal inflammatory response to DNBS-induced colitis in rats. All rats were fed identical diets with the exception of different types of fatty acids [safflower oil (SO), canola oil (CO), or fish oil (FO)] for three&#160;weeks prior to exposure to intrarectal DNBS. Control rats given intrarectal ethanol continued gaining weight over the 5 day study, whereas, DNBS-treated rats fed lipid diets all lost weight with FO and CO fed rats demonstrating significant weight loss by 48&#160;hr and rats fed SO by 72&#160;hr. Weight gain resumed after 72&#160;hr post DNBS, and by 5 days post DNBS, the FO group had a higher body weight than SO or CO groups. Colonic sections collected 5&#160;days post DNBS-treatment showed focal ulceration, crypt destruction, goblet cell depletion, and mucosal infiltration of both acute and chronic inflammatory cells that differed in severity among diet groups. The SO fed group showed the most severe damage followed by the CO, and FO fed groups that showed the mildest degree of tissue injury. Similarly, colonic myeloperoxidase (MPO) activity, a marker of neutrophil activity was significantly higher in SO followed by CO fed rats, with FO fed rats having significantly lower MPO activity. These results demonstrate the use of DNBS-induced colitis, as outlined in this protocol, to determine the impact of diet in the pathogenesis of IBD.

DNBS/TNBS induced colitis offers an alternative and inexpensive method to study the pathobiology of inflammatory bowel disease. The protocol discussed in this paper outlines the successful application of DNBS to induce colitis in mice and rats and allows one to thoroughly study host-mediated intestinal responses.

DNBS / TNBS Colite Modelli: Fornire Insights Into malattia infiammatoria intestinale e gli effetti di grassi

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

Medicina

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well as to excrete bilirubin and other metabolic products. In the liver, the experimental obstruction of the extrahepatic biliary system initiates a complex cascade of pathological events that leads to cholestasis and inflammation resulting in a strong fibrotic reaction originating from the periportal fields. Therefore, surgical ligation of the common bile duct has become the most commonly used model to induce obstructive cholestatic injury in rodents and to study the molecular and cellular events that underlie these pathophysiological mechanisms induced by inappropriate bile flow. In recent years, different surgical techniques have been described that either allow reconnection or reanastomosis after bile duct ligation (BDL), e.g., partial BDL, or other microsurgical methods for specific research questions. However, the most frequently used model is the complete obstruction of the common bile duct that induces a strong fibrotic response after 21 to 28 days. The mortality rate can be high due to infectious complications or technical inaccuracies. Here we provide a detailed surgical procedure for the BDL model in mice that induce a highly reproducible fibrotic response in accordance to the 3R rule for animal welfare postulated by Russel and Burch in 1959.

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Immunologia e infezioni

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Bioingegneria

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, such as type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Recent research has established that pro-inflammatory immune cells infiltrate obese hypertrophic adipose tissue and liver. Given the emerging importance of immune cells in the context of metabolic homeostasis, there is a critical need to quantify and characterize their modification during the development of type 2 diabetes and NASH. However, animal models that induce pathophysiological features typical of human NASH are sparse.
In this article, we provide a detailed protocol to identify immune cell subsets isolated from liver and adipose tissue in a reliable mouse model of NASH, established by housing high-fat diet (HFD) mice under non-specific pathogen-free (SPF) conditions without a barrier for at least seven weeks. We demonstrate the handling of mice in non-SPF conditions, digestion of the tissues and identification of macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B and T cell subsets by flow cytometry. Representative flow cytometry plots from SPF HFD mice and non-SPF mice are provided. To obtain reliable and interpretable data, the use of antibodies, accurate and precise methods for tissue digestion and proper gating in flow cytometry experiments are critical elements.
The intervention to restore physiological antigen exposure in mice by housing them in non-SPF conditions and unspecific exposure to microbial antigens could provide a relevant tool for investigating the link between immunological alterations, diet-induced obesity and related long term complications.

A simple and reliable diet-induced rodent animal model for nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is described, achieved through non-SPF housing of the animals and administration of a specific high-fat diet. We describe identification of hepatic and adipose immune cell subsets to recapitulate human immunological conditions by exposing mice to environmental germs.

Un modello avanzato di murine per la steatoepatite non alcolica in associazione con il diabete di tipo 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has hindered the development of a preventative drug. Primarily, finding a suitable animal model is challenging in understanding the mechanism of Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis pathology. Here, we adopted an effective method where TNBS chemical exposure to mice rectums produces substantially deep ulceration and chronic inflammation, and the mice then chronically develop intestinal fibrosis. Also, we describe a technique where a rapamycin injection shows inhibitory effects on TNBS-mediated fibrosis in the mouse model. To assess the underlying mechanism of fibrosis, we methodically discuss a procedure for purifying Cx3Cr1+ cells from the lamina propria of TNBS-treated and control mice. This detailed protocol will be helpful to researchers who are investigating the mechanism of fibrosis and pave the path to find a better therapeutic invention for Crohn&#39;s-associated intestinal fibrosis.

In this study, we describe a detailed procedure of TNBS-mediated intestinal fibrosis, which exhibits comparable pathophysiology to Crohn&#39;s fibrosis. We also discuss this approach in light of rapamycin facilitated inhibitory effects on intestinal fibrosis.

Approfondimenti meccanicistici sullo sviluppo della fibrosi intestinale mediata dalla TNBS e sulla valutazione degli effetti inibitori della rapamicina

Significant studies have been carried out to understand effective management of intestinal fibrosis. However, the lack of better knowledge of fibrosis has ...

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and detoxifying functions of the liver. In most irreversible liver damage cases, orthotropic liver transplant (OLT) remains the only available treatment. To study the therapeutic potential of a treatment for ALF, its prior testing in an animal model of ALF is essential. In the current study, an ALF model in rats was developed by combining 70% partial hepatectomy (PHx) and injections of acetaminophen (APAP) that provides a therapeutic window of 48 h. The median and left lateral lobes of the liver were removed to excise 70% of the liver mass and APAP was given 24 h postsurgically for 2 days. Survival in ALF-induced animals was found to be severely decreased. The development of ALF was confirmed by altered serum levels of the enzymes alanine amino transferase (ALT), aspartate amino transferase (AST), alkaline phosphatase (ALP); changes in prothrombin time (PT); and assessment of the international normalized ratio (INR). Study of the gene expression profile by qPCR revealed an increase in expression levels of genes involved in apoptosis, inflammation, and in the progression of liver injury. Diffused degeneration of hepatocytes and infiltration of immune cells was observed by histological evaluation. The reversibility of ALF was confirmed by the restoration of survival and serum levels of ALT, AST, and ALP after intrasplenic transplantation of syngeneic healthy rat hepatocytes. This model presents a reliable alternative to the available ALF animal models to study the pathophysiology of ALF as well as to evaluate the potential of a novel therapy for ALF. The use of two different approaches also makes it possible to study the combined effect of physical and drug-induced liver injury. The reproducibility and feasibility of current procedure is an added benefit of the model.

The acute liver failure animal model developed in the current study presents a feasible alternative for the study of potential therapies. The current model employs the combined effect of physical and drug-induced hepatic injury and provides a suitable time window to study the potential of novel therapies.

Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Biologia

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Applicazione dell'imaging ecografico a ultrasuoni e dell'elastografia a onde di taglio in un modello di ratto di NAFLD / NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...