Sostenuto dalla JDRF, il NIH (R01-DK081469), il Commonwealth della Pennsylvania (Centro di Eccellenza in Medicina Rigenerativa concedere 4100043362), il March of Dimes (Basilio O&#39;Connor Starter Research Scholar Award), e della University of Pennsylvania pilota DERC e fattibilità di sovvenzione (DK19525).

1. I tessuti etichettatura con CldU e IDU <ol><li> Sciogliere analoghi della timidina (CldU o IDU) in acqua. Pesare mL 1mg / di ogni sostanza chimica e aggiungere a separare le bottiglie di vetro di acqua distillata. Noi di solito preparare 1 litro di ciascuno alla volta. </li><li> Sciogliere i prodotti chimici su un piatto mescolare o altra forma di agitazione. CldU si dissolve in 10 min. di agitazione a temperatura ambiente. Idu richiede più di un&#39;ora di agitazione a 37 ° C in uno shaker. Fonti d&#39;acqua può influenzare la solubilità Idu. Se Idu rimane sospese durante la notte dopo agitazione, provare una fonte di acqua pulita. Le soluzioni sono conservati a 4 ° C al buio. </li><li> Somministrare la prima soluzione contenente timidina (sia CldU o IDU) per i topi per il periodo desiderato etichettatura. Non lasciare che i topi di avere accesso all&#39;acqua senza etichetta durante il periodo di etichetta. Al termine del periodo di etichettatura designato è stato completato, iniziare un washout senza etichetta con l&#39;acqua per almeno 24 ore (il analoghi della timidina contenente siero hanno un&#39;emivita di parecchie ore). Somministrare la seconda soluzione contenente timidina (sia CldU o IDU) per i topi per il periodo desiderato etichettatura. Bottiglie d&#39;acqua ricarica regolarmente per prevenire la disidratazione! </li><li> In alternativa, i topi possono essere etichettati con iniezione sequenziale intraperitoneale di CdlU e poi Idu. Preparare CldU o Idu a 10 mg / ml concentrazione. Idu può richiedere goccia a goccia di soluzione concentrata di idrossido di sodio seguito da agitazione violenta di andare in sospensione. Non aggiungere idrossido di sodio in eccesso. Aggiungere una sola goccia di idrossido di sodio a una soluzione 10 mL di Idu seguita da un&#39;ora di agitazione a 37 ° C in uno shaker. Se non in soluzione, ripetere l&#39;aggiunta di idrossido di sodio. Iniettare 100 mcg per g di peso corporeo nello spazio intraperitoneale. </li><li> Vetrini di controllo sono essenziali per questo protocollo. Come risultato, si consiglia vivamente gli investigatori svolgono diverse varianti di etichettatura analogico timidina per assicurare la sensibilità e specificità. Queste dovrebbero includere 1. I topi che sono stati etichettati con solo CldU, 2. I topi che sono stati etichettati con solo Idu, 3. I topi che sono stati etichettati con CldU in sequenza e poi Idu, 4. I topi che sono stati etichettati in sequenza in ordine inverso, prima con IDU e poi CldU, 5 I topi che sono finte etichettati con sola acqua. Quando si impara ad etichettare con CldU e Idu, gli investigatori devono sempre effettuare l&#39;intero protocollo con tutti i 5 set di sopra di vetrini di controllo dal tessuto di interesse. </li></ol> 2. Tessuto Harvest, Fissazione, e Slide Preparazione <ol><li> Utilizzando opportuni anestetico, eseguire overdose letali e poi sacrificio del mouse tramite dissanguamento. Rimuovere il tessuto fresco e fissare con il 4% paraformalehyde a 4 ° C per 24 ore. Trasferimento di tessuto al buffer 01:04 formalina e conservare a 4 ° C per l&#39;incorporamento. </li><li> In alternativa, eseguire overdose letali e poi profumato con il mouse attraverso il ventricolo cardiaco sinistro con soluzione fisiologica fino a quando il sangue viene eliminato dal corpo, poi subito profumato con 30-50 cc di paraformaldeide 4%. Rimuovere i tessuti di interesse e conservare in formalina Buffer 01:04 a 4 ° C per l&#39;incorporamento. </li><li> Dopo la disidratazione dei tessuti e in paraffina, tagliato a 5 micron sezioni di tessuto e del luogo su vetrini carica. Cuocere le diapositive a 65 ° C per 16 ore per assicurare l&#39;adesione del tessuto a scivolare (essenziale con gradini recupero dell&#39;antigene sotto). </li></ol> 3. Disidratazione, permeabilizzazione e Antigen Retrieval <ol><li> Rimuovere l&#39;eccesso di paraffina immergendo le diapositive di due bagni xilene per 5 min. ciascuno. </li><li> Reidratare il tessuto immergendo diapositive in etanolo diluito con acqua: 100, 95, 90, 80 70 e il 50%. Immergere i vetrini per 3 min. per ogni concentrazione, a partire da 100% e andando verso il 50% per l&#39;immersione finale. </li><li> Lavare i vetrini per 5 min. in 1x PBS. </li><li> Permeabilize cellule immergendo le diapositive di 0,2% Triton-X soluzione per 5 minuti (preparata fresca ogni volta). </li><li> Preparare i vetrini per il recupero dell&#39;antigene tessuto microonde. Porre i vetrini in un bicchiere di vetro con un sufficiente volume di 0.01M pH 6,0 tampone di sodio citrato, in modo che la soluzione copre 5 cm sopra la parte superiore delle diapositive per tenere conto di perdite per evaporazione. </li><li> Microonde diapositive fino a quando la soluzione è bollente (3-10 min. A piena potenza). Ridurre il potere fino a quando la soluzione sta lentamente bollente (10-80%) e proseguire per altri 20 min. Controllare periodicamente a microonde per assicurare la soluzione rimane a bollire lentamente. </li><li> Coppa luogo contenente diapositive su un banco e lasciar raffreddare lentamente a temperatura ambiente (circa 2 ore). </li><li> Confermare che scorre siano a temperatura ambiente con un termometro. </li><li> Immergere i vetrini in 1.5N HCL per 40 min. a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte in PBS 1X, 5 min. a lavaggio. </li></ol> 4. Anticorpi primari e secondari <ol><li> E &#39;importante che le diapositive rimangono molto umido attraverso l&#39;intero protocollo. Tessuti a secco avrà auto molto piùFluorescenza, rendendo le immagini risultanti inutilizzabile. Per evitare di morire, il processo di una diapositiva alla volta. </li><li> Cerchio ogni sezione nelle diapositive con un liquido di blocco (cioè, cera) penna. Porre i vetrini nel contenitore di 1x PBS. </li><li> Fai una camera umida incubazione mettendo fazzoletti di carta bagnati a piatto sul fondo di un contenitore ermetico di plastica. </li><li> Make up soluzione bloccante di siero asino al 10% diluito in PBS 1x. E &#39;importante coprire interamente ogni sezione con la soluzione. Per le sezioni di tessuto che sono 1 x 1.5 centimetri, un volume di 50 micro-litri di soluzione per ogni sezione è sufficiente. </li><li> Aggiungere la soluzione di blocco per le diapositive. Rimuovere il vetrino dalla PBS 1x ed eliminare i liquidi in eccesso picchiettando delicatamente il bordo scivolare su una pila di tovaglioli di carta a secco. Porre il vetrino nella camera di incubazione e aggiungere 50 micro-litri di soluzione di blocco al 10% per ogni sezione. Quando tutte le diapositive sono stati completati chiudere il contenitore ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Preparare prima diluizione degli anticorpi per rilevare Idu. Diluire topo anti-BrdU ad una concentrazione di 1:250 asino siero 5% made in 1x PBS. Rubinetto soluzione isolato da diapositive e posto nella camera di incubazione. Aggiungere l&#39;anticorpo primario sopra a ciascuna sezione e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Preparare lavare alto rigore (che riduce al minimo vincolante da topo anti-BrdU antisieri CldU). Make up fresco a basso tampone TBST sale (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0.5% Tween-20, pH 8,0). Avrete bisogno di 40 mL di tampone per ogni coppia di diapositive. Aggiungere 40 ml di tampone ad ogni provetta 50 ml conica. Prima di aggiungere diapositive, preriscaldare la soluzione a 37 ° C. </li><li> Due alla volta, rimuovere le slide dalla camera di incubazione, metterli back-to-back (in modo che i campioni di tessuto viso lontano l&#39;uno dall&#39;altro) e toccare eccesso anticorpo primario. Porre i vetrini nei tubi riempiti con TBST iposodica e coprire. Agitare le provette per 20 min. in una agitazione batterica cultura incubatore con la temperatura a 37 ° C, e la velocità impostata a 225 giri al minuto. </li><li> Lavare le diapositive due volte in acqua dolce PBS 1X. 5 min. a lavaggio. </li><li> Preparare la soluzione successiva anticorpo primario per la rilevazione di CldU e l&#39;antigene tissutale, se lo si desidera. Diluire ratto anti-BrdU ad una concentrazione di 1:250 asino siero 5% made in 1x PBS. Diluire antisieri primaria contro l&#39;antigene di tessuto a lavorare concentrazione nella soluzione di anticorpo primario. </li><li> Toccare l&#39;eccesso di PBS 1x fuori delle diapositive, e metterli nella camera di incubazione. Aggiungere l&#39;anticorpo primario per ogni sezione e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le diapositive due volte in acqua dolce PBS 1X. 5 min. a lavaggio. </li><li> Preparare la soluzione secondaria di anticorpi. Diluire Cy2 asino anti-ratto a 1:250 e Cy5 asino anti-topo a 1:500 in una soluzione 1X PBS contenente siero di asino al 5%. Aggiungi Cy3 secondaria per individuare le specie primaria di antisieri tessuto antigene. Inoltre, diluire un 0,4 mg / ml soluzione madre di DAPI a 1:150 in soluzione anticorpo secondario. </li><li> Toccare eccesso 1X scivola via PBS e posto nella camera di incubazione. Aggiungere la soluzione secondaria di anticorpi a ciascuna sezione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le diapositive due volte in acqua dolce PBS 1X. 5 min. a lavaggio. </li><li> Toccare l&#39;eccesso di PBS 1X fuori delle diapositive e di aderire con copertura in vetro Prolungare Oro mezzi di montaggio anti-dissolvenza (NON usare Vectashield con coloranti dyanine!). Premere sul coprioggetto per eliminare le bolle d&#39;aria. Conservare a 4 ° C. </li></ol> 5. Imaging e analisi <ol><li> L&#39;immagine del tessuto di interesse con un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una sorgente di luce ad alta energia, piano-apocromatico obiettivi, e una macchina fotografica ad alta efficienza microscopio (ad esempio Hamamatsu Orca ER). Scatta foto in AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (antigene tissutale) e Cy5 (IDU) canali. Unire immagini per creare un unico multi-layer file di immagine. </li><li> Se eseguito correttamente, nuclei DAPI colorati saranno omogeneamente luminosa. Antigene tissutale (insulina ad esempio) dovrebbe rivelare le cellule di interesse. Se la colorazione con DAPI o tessuto-antigene è debole o inconsistente, scivolo immergere in PBS 1X durante la notte per rimuovere copertura antiscivolo e ripetere l&#39;applicazione di antisieri secondari. </li><li> Focus su antigeni tessuto Cy3. Controllare CldU e colorazione IDU in Cy2 e Cy5 canali, commutazione tra i canali. Cercare potenziale cross-reattività tra i marcatori, come indicato da un eccesso di IDU e CldU co-positività. Cercate tessuti che contengono solo CldU o Idu. La mancanza di nuclei CldU o IDU positivo può indicare un problema tecnico con etichettatura o colorazione. In questo caso, cercare un tessuto altamente replicativa (es. linfonodi nodo). </li><li> Analizzare le immagini. Visualizzare i layer contenente DAPI e l&#39;antigene tissutale. Con un pennarello bianco pensione in mano dominante e un contatore di cellule nella mano non dominante, contrassegnare ogni nucleo con un marchio in contrasto con un pennarello cancellabile (aka bianco marcatore bordo). Contare le celle DAPI positiva nel tessuto di interesse. Registrare il conteggio totale delle cellule. Utilizzare una gomma asciutto per rimuovere i segni. Display stratos contenente DAPI, l&#39;antigene tissutale, e CldU. Contare le celle CldU positiva nel tessuto di interesse. Record CldU conta delle cellule, ma non cancellare i segni. Cambia display per visualizzare layer contenente l&#39;antigene di tessuto, CldU e Idu. Conte CldU Idu cellule doppio positivo. Valore record, cancellare tutti i segni, e la visualizzazione strati contenenti DAPI, l&#39;antigene tissutale, e Idu. Contare il numero totale delle cellule Idu positivo all&#39;interno del tessuto di interesse. Record IDU conta delle cellule. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Siamo in sequenza etichettati 6 settimane i topi di sesso femminile con età CldU per una settimana e poi IDU per due settimane, seguite da immediata sacrificio. Pancreas sono state colorate per rilevare CldU, Idu, e l&#39;insulina (un antigene tessuto), così come DAPI. Isolotti erano uniformemente colorati con insulina. Nuclei CldU macchiato erano distinte da nuclei Idu macchiato (Figura 2). Molti nuclei al di fuori delle isole pancreatiche erano CldU Idu co-positivi (Figura 2, in basso a destra, frecce bianche). Una cellula di insulina solo positivo aveva colorazione nucleare sia per CldU e IDU (Figura 2, in basso a destra, freccia magenta). Topi. Tutti gli esperimenti con i topi sono stati eseguiti secondo le linee guida del comitato IACUC dell&#39;Ospedale dei Bambini di Philadelphia. Femmina B6.129 F1 topi wild-type sono stati acquistati dalla Taconic (Germantown New York), ospitato presso l&#39;impianto di animali di laboratorio presso l&#39;ospedale pediatrico di Filadelfia, e nutriti mouse Dieta 5015 da PMI Nutrition International (Richmond. Indiana). Etichettatura strategia. Mediante l&#39;etichettatura il primo evento divisione cellulare con CldU (contrassegnati in verde questo regime) e la divisione cellulare secondo con Idu (marcata in rosso in questo schema), sequenziale divisione risultati cellulare in co-etichettati cellule con entrambi CldU e IDU (verde / rosso) . Risultati rappresentativi di etichettatura timidina del fatturato delle cellule pancreatiche nei topi. Immunofluorescenza immagine di un pancreas mouse con isolotto di Langerhans nel centro. Mouse è stato infuso con CldU per 1 settimana e poi IDU per 2 settimane in acqua potabile prima del sacrificio immediato. Campione del pancreas è stato elaborato come descritto nel protocollo. 40x immagini oggettive, con strati distinti visualizzati adatto per il conteggio. Immagini fuse contengono DAPI (bianco) CldU (verde), IDU (rosso), insulina (giallo). (In alto, a sinistra) DAPI e insulina. (In alto, a destra) CldU e insulina. (In basso, a sinistra) IDU e insulina. (In basso, a destra) CldU, Idu, e insulina. Scala grafica: 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Strategia di etichettatura. Mediante l&#39;etichettatura il primo evento divisione cellulare con CldU (contrassegnati in verde questo regime) e la divisione cellulare secondo con Idu (marcata in rosso in questo schema), sequenziale divisione risultati cellulare in co-etichettati cellule con entrambi CldU e IDU (verde / rosso) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. I risultati rappresentativi di etichettatura timidina del fatturato delle cellule pancreatiche nei topi. Immunofluorescenza immagine di un pancreas mouse con isolotto di Langerhans nel centro. Mouse è stato infuso con CldU per 1 settimana e poi IDU per 2 settimane in acqua potabile prima del sacrificio immediato. Campione del pancreas è stato elaborato come descritto nel protocollo. 40x immagini oggettive, con strati distinti visualizzati adatto per il conteggio. Immagini fuse contengono DAPI (bianco) CldU (verde), IDU (rosso), insulina (giallo). (In alto, a sinistra) DAPI e insulina. (In alto, a destra) CldU e insulina. (In basso, a sinistra) IDU e insulina. (In basso, a destra) CldU, Idu, e insulina. Scala grafica: 100μm.

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Tutti gli esperimenti con i topi sono stati eseguiti nella struttura animale presso l&#39;ospedale pediatrico di Filadelfia secondo le linee guida della cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC).

Il nostro approccio alla timidina approccio di etichettatura turn-over cellulare ha molte potenziali applicazioni nella ricerca biomedica. Fino ad oggi, ci siamo concentrati sul pancreas, ma abbiamo anche applicato questa strategia di esaminare ricambio cellulare della pelle, intestino, fegato, surrene, rene, testicoli, ovaie, tiroide, linfonodi, ematopoiesi, e il cervello 1. Perché il turnover cellulare varia da tessuto a tessuto, le strategie di etichettatura devono essere personalizzati per ottenere le informazioni più interessanti dall&#39;organo di interesse. Morrison e colleghi hanno usato CldU e IDU per 1 giorno per ogni etichetta ematopoiesi 2. Kuhn e colleghi usare CldU e IDU per 4 giorni ciascuno per rilevare la divisione cellulare nel rigenerare miocardio 3. Al contrario, abbiamo usato CldU e Idu fino a 9 mesi di etichettare fatturato totale delle cellule basali in isole pancreatiche, un tessuto con un fatturato minimo di cellule con l&#39;invecchiamento animale 1,4-6. L&#39;applicazione più ovvia potenziale della nostra strategia di etichettatura per gli studi per definire il turnover cellulare all&#39;interno di omeostasi dei tessuti. Ma la nostra tecnica ha diverse altre applicazioni potenziali. Ad esempio, abbiamo anche recentemente applicato questa tecnica per identificare la trasformazione oncogena nei tessuti, dove aree focali di replica maggiore possono essere facilmente identificati per incorporazione aumentata di CldU o IDU 5. Morrison e colleghi hanno usato CldU e IDU per 1 giorno ciascuno per verificare il comportamento etichetta mantenendo di cellule staminali ematopoietiche 2. Abbiamo anche applicato sequenziale etichettatura analogico timidina per determinare se il transito-amplificazione cellule contribuiscono alla crescita o il rinnovo dei tessuti 1. In questa amministrazione applicazione sequenziale di analoghi della timidina rappresenta un nuovo approccio per studiare le origini e la sopravvivenza delle cellule coinvolte nella omeostasi dei tessuti. Analoghi della timidina non deve essere usato senza cautela. Analoghi della timidina sintetiche hanno tossicità potenziale di cellule in divisione, e il loro uso potrebbe teoricamente mettere in pericolo il rinnovamento cellulare negli animali in sviluppo. Analoghi della timidina sono stati utilizzati come radiosensibilizzante agenti per i malati di cancro, e può rallentare il turnover cellulare. Quindi chiediamo agli investigatori di indagare con cautela a causa della tossicità potenziale a loro tessuto di interesse. Per esempio, Trumpp e colleghi hanno trovato che sistemica BrdU può forzare le cellule staminali ematopoietiche per entrare ciclo cellulare 7. Per esempio, Rutter e colleghi hanno osservato che alte dosi analoghi della timidina sono tossici per lo sviluppo del pancreas 8. Più recentemente Hellerstein e colleghi KineMed, Inc ha scoperto che la somministrazione di BrdU rallenta intra-isolotto proliferazione 16-25% utilizzando una tecnica proprietaria pesante etichettatura acqua 9. I preparativi isolotto tutto usato da Hellerstein e colleghi contenute molte endocrini e altri tipi di cellule non-endocrino, che potrebbe comprendere anche il 50% di preparati isolotto totale. Tuttavia, troviamo che l&#39;infusione prolungata di BrdU non influenza la proliferazione delle cellule beta nei topi giovani adulti, come misurato da Ki67 espressione 4. Allo stesso modo, a lungo termine e di somministrazione di CldU Idu non sembra pregiudicare l&#39;espansione di massa delle cellule beta 1. Inoltre, i tassi di proliferazione delle cellule beta sono equivalenti tra topi etichettati con BrdU per lunghi periodi di tempo e di topi che sono solo etichettato per qualche ora (le tariffe sono normalizzati a periodi di tempo equivalente). Insieme, questi risultati suggeriscono che i topi possono tranquillamente tollerare a lungo termine a basso dosaggio somministrazione di analoghi della timidina. Eppure, non possiamo escludere la potenziale tossicità di analoghi della timidina nella crescita delle cellule beta pancreatiche. Di conseguenza, continuiamo ad eseguire i controlli per l&#39;etichettatura topi con analoghi della timidina, e invitiamo altri investigatori a fare altrettanto. La nostra tecnica di etichettatura sequenziale analogico timidina non sia esente da rischi e le sfide tecniche. Di conseguenza, vetrini di controllo sono particolarmente importanti. Abbiamo generato vetrini di controllo che consistono di vari tessuti da 1) I topi che erano solo etichettati con CldU;.. 2) I topi che erano solo etichettati con IDU;. 3) I topi che sono stati etichettati in modo sequenziale con CldU e poi IDU;. 4) I topi che sono stati etichettati in sequenza in ordine inverso, prima con IDU e poi CldU;. 5) I topi che sono finte etichettati con sola acqua. Quando si impara ad etichettare con CldU e Idu, gli investigatori devono sempre effettuare l&#39;intero protocollo con tutti i 5 set di sopra di diapositive dal tessuto di interesse. Lieve reattività crociata tra CldU e Idu è un aspetto negativo sfortunato ma inevitabile per l&#39;etichettatura con entrambi analoghi della timidina. La tecnica CldU e Idu si basa su differenze di affinità tra antisieri che erano originariamente derivati ​​contro BrdU in diverse specie (topo e ratto). Il nostro protocollo, mentre ingombrante, è progettato per minimizzare tale reattività crociata. Di conseguenza, invitiamo i cautela tra gli investigatori che considerano saltare passo (s) del protocollo. In particolare, abbiamoavuto problemi con antisieri secondari che sono reattivi croce in mezzo topo e ratto. Questo può essere minimizzato con l&#39;uso di antisieri Jackson che sono completamente cross-adsorbito in mezzo topo e ratto. Noi a volte non riescono a rilevare in modo adeguato timidina. In questi casi è estremamente importante utilizzare vetrini di controllo positivo per determinare quale reagente o passo non funzionava. Le difficoltà sono in genere a causa di cattiva aliquote di antisieri, diapositive a secco, o inadeguata permeabilizzazione nucleare. Non siamo riusciti a sviluppare con successo etichetta embrioni con Idu. Quindi, non tutti i tessuti possono essere permeabile al Idu. Alternative alla CldU e Idu per il doppio etichettatura analogico timidina sono all&#39;orizzonte. EdU (5-etinil-2 deossiuridina) può essere un substrato per la rilevazione chimica catalizzata in rame clicca 10,11. Metodi di rilevamento EdU non richiedono la separazione dei filamenti di DNA, e sono quindi altamente suscettibili di analisi del 12 citometria a flusso. Edu è compatibile, ma non a reazione crociata con BrdU 10. EdU è stato utilizzato per quantificare il ricambio cellulare dei tessuti del mouse vari tra cui le cellule beta pancreatiche 13, le cellule intestinali L epidermide 14 e 15. Edu è abbastanza costoso per il momento ($ 1000 dollari a 500mg). Ancora, la rilevazione Edu sembra essere molto più sensibili di BrdU rilevamento 10. Quindi, potrebbe essere economicamente fattibile per combinare Edu e BrdU invece di CldU e Idu. Questo metodo può inoltre consentire l&#39;individuazione di tre turni diversi di divisione cellulare nei topi triplamente etichettati per EdU, CldU e Idu. In sintesi, la nostra tecnica di etichettatura sequenziale analogico timidina è un nuovo approccio per la rilevazione turn-over cellulare. Ci auguriamo che il nostro approccio consente agli scienziati di altri per quantificare con maggiore precisione la divisione cellulare, e ci aspettiamo che si aprirà nuovi paradigmi in omeostasi dei tessuti.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

Misurazione accurata della divisione cellulare è una sfida fondamentale in biologia sperimentale che diventa sempre più complesso, quando lentamente cellule in divisione vengono analizzati. Modalità stabilite per rilevare la divisione cellulare comprendono la visualizzazione diretta al microscopio continuo nelle cellule in coltura, la diluizione di coloranti vitali come carboxyfluorescein di-aetate succinimidile estere (CFSE), immuno-rivelazione di antigeni mitogenica come Ki67 o PCNA, e analoghi della timidina. Analoghi della timidina può essere rilevato da una varietà di metodi, compresa la radio-rilevamento per timidina triziata, immuno-rivelazione per bromo-deossiuridina (BrdU), cloro-deossiuridina (CldU) e iodo-deossiuridina (IDU), e individuazione di prodotti chimici per etinil-deossiuridina (UDE). Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di diversi analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti. Il nostro metodo consente agli investigatori di quantificare con precisione due turni successivi di divisione cellulare. Ottimizzando protocolli immunocolorazione il nostro approccio in grado di rilevare molto basso analoghi della timidina dose somministrata con l&#39;acqua potabile, sicuri per i topi per periodi prolungati di tempo. Di conseguenza, la nostra tecnica può essere usata per rilevare il ricambio cellulare nei tessuti molto longevi. Ottimi risultati colorazione immunofluoresent può essere ottenuto in diversi tipi di tessuto, tra cui pancreas, cute, intestino, fegato, surrene, testicoli, ovaie, tiroide, linfonodi e nel cervello. Inoltre abbiamo applicato questa tecnica per identificare la trasformazione oncogena all&#39;interno dei tessuti. Abbiamo inoltre applicato questa tecnica per determinare se il transito-amplificazione cellule contribuiscono alla crescita o il rinnovo dei tessuti. In questo senso, la somministrazione sequenziale di analoghi della timidina rappresenta un nuovo approccio per studiare le origini e la sopravvivenza delle cellule coinvolte nella omeostasi dei tessuti.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti per quantificare due turni successivi di divisione cellulare. Questa strategia è utile per rilevare il ricambio cellulare del longevo tessuti, la trasformazione oncogena, o di transito amplificazione cellule.

Rilevazione immunofluorescenza di due analoghi della timidina (CldU e IDU) in tessuto primario

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.5K Views.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Abbiamo derivato una strategia per rilevare incorporazione sequenziale di analoghi della timidina (CldU e IDU) nei tessuti di topi adulti per quantificare due turni successivi di divisione cellulare. Questa strategia è utile per rilevare il ricambio cellulare del longevo tessuti, la trasformazione oncogena, o di transito amplificazione cellule.

Video: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Miglioramento Tecnica Swiss-laminazione per intestinale Preparazione del tessuto per immunoistochimica e analisi immunofluorescenza

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Semplice rilevamento delle ciglia primarie per immunofluorescenza

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano