We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).

1. Polymer e agarosio Preparazione Nota: guanti e un camice da laboratorio deve essere indossato in qualsiasi momento durante questo protocollo. Occhiali di sicurezza sono altresì tenuti durante il lavoro con qualsiasi solvente organico o qualsiasi passaggio con possibili spruzzi. <ol><li> Preparare a 5 mg / ml soluzione di polimero in cloroformio. Aggiungere 1 ml di cloroformio a 5 mg di poli solido (ossido di etilene) - poli b- (butadiene) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) diblock copolimero in una fiala di vetro e agitare per dissolvere completamente. Eseguire tutti i passaggi utilizzando cloroformio in una cappa. </li><li> Mescolare in un lipide fluorescente (acquistato già disciolto in cloroformio) a 0,5 moli% concentrazione finale nel polimero marcato 99,5 moli%. <ol><li> Ad esempio, pipetta ~ 12 microlitri di 1 mg / ml lipide fluorescente in cloroformio nelle 997,58 microlitri PEO-PBD, EO 22 -BD 37 polimero in cloroformio (con un peso molecolare di 2.950 Daltons) per una concentrazione finale di 0.5 moli% di lipidi etichettato mescolati e 99,5 moli% di polimero. </li><li> Conservare la soluzione in una fiala chiusa ermeticamente con un coperchio di cloroformio resistente a -20 ° C. Avvolgere idraulici nastro sul bordo fiala dove le viti coperchio sul flacone e fissare il coperchio sul flacone. Avvolgere un altro pezzo di nastro idraulici sulla parte esterna del coperchio e infine avvolgere Parafilm all&#39;esterno del nastro per garantire un&#39;evaporazione minima. </li></ol></li><li> Fare un 1% w / v soluzione di agarosio miscelando 0,5 mg agarosio standard 50 ml di acqua (o 50 ml 100 mM saccarosio) in una beuta da 250 ml. Far bollire la soluzione di agarosio in un forno a microonde standard per ~ 1 min (o fino a quando completamente sciolto come ha rilevato la compensazione della soluzione). Nota: La soluzione di agarosio può essere utilizzato dopo pochi minuti di raffreddamento o lascia solidificare, immagazzinato e ri-fusa utilizzando la stessa procedura. </li></ol> 2. Agarosio Film Preparazione <ol><li> Tagliare l&#39;estremità fuori di un puntale di 1.000 ml per evitare intasamenti. Utilizzando la punta di taglio, pipetta 300 ml di soluzione di agarosio fuso SU UN 25 millimetri coprioggetto di vetro quadrato direttamente dal produttore. </li><li> Lasciare che il agarosio raffreddare a ~ 65-75 ° C prima della deposizione. Se l&#39;agarosio è troppo freddo, inizierà a ciuffo sulla superficie durante il processo di diffusione. Viceversa, se l&#39;agarosio è troppo caldo, che richiederà più diffondendo aderire l&#39;agarosio alla superficie. </li><li> Tenere solo il bordo del vetrino con dita guantate e utilizzare il lato lungo di un altro puntale 1.000 microlitri per diffondere l&#39;agarosio in modo uniforme su tutta la superficie del vetrino. Spostare la punta della pipetta avanti e indietro attraverso il vetrino fino a quando l&#39;agarosio aderisce completamente e copre il vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino agarosio rivestite su un pezzo di Parafilm con l&#39;agarosio rivolto verso l&#39;alto. Una volta che il numero desiderato di vetrini sono rivestiti, posizionare il Parafilm con i coprioggetti in un incubatore a 37 ° per disidratare l&#39;agarosio sulla superficie per almeno 1 ora. Nota: disidratazioneè determinata dalla scomparsa dello strato visibile di agarosio; il vetrino dovrebbe essere piatta e chiaro. Una volta che i film sono completamente disidratato, negozio coprioggetto con la superficie agarosio rivolta verso l&#39;alto in una plastica monouso Petri. </li></ol> Formazione 3. Polymer Film <ol><li> Pipettare 30 ml preparati soluzione polimerica sulla pellicola agarosio. </li><li> Tenere solo il bordo del vetrino con dita guantate e utilizzare il lato lungo di un ago 18 G per diffondere la soluzione attraverso i film di agarosio con un movimento circolare diffusione. Continuare diffusione fino evapora la soluzione. Nota: Fare attenzione la punta dell&#39;ago. </li><li> Collocare le pellicole polimeriche in una piastra di Petri lato polimero plastico rivolto verso l&#39;alto e mettere il piatto Petri in un essiccatore sotto vuoto casa serie, rivestiti in lamina di alluminio (per evitare photobleaching del lipide marcato) per almeno 1 ora per rimuovere completamente qualsiasi solvente residuo. </li></ol> 4. Formazione di Polymersomes <ol><li> Rispettare un coverwell, o un polidimetilsilossano fatto in casa (PDMS) e (un ~ 0,5 centimetri di spessore blocco di PDMS curato con ~ 1 cm di diametro di mezzo perforato) o di un disponibile in commercio ben al vetrino rivestito con il film polimerico. Premere il coverwell delicatamente sul vetrino polimero rivestito con il polimero rivolto verso l&#39;alto fino ad ottenere una tenuta ottimale tra coverwell e il vetrino. Fare attenzione a non premere troppo forte e rompere il vetrino. </li><li> Aggiungere 200-500 microlitri soluzione di reidratazione (acqua è soddisfacente, ma una serie di tamponi o media funziona anche) alla camera (volume reidratazione dipende dalla dimensione del coverwell aderito). </li><li> Creare una camera umida per ridurre l&#39;evaporazione della soluzione di reidratazione. Posizionare un laminato, Kimwipe bagnato lungo i bordi di un piatto di vetro Petri. Posizionare il film polimerico con l&#39;coverwell aderito nella camera umida e coprire con un coperchio. Coprire la piastra di Petri con un foglio di alluminio per ridurre al minimo photobleaching. Postola piastra di Petri su una piastra calda impostata a 40 ° C per almeno 30 min. </li><li> Regolare la temperatura della piastra calda durante la reidratazione dal 24-70 ° C per regolare la dimensione delle vescicole formate (Figura 5). 70 ° C si trova vicino alla T m del agarosio quindi deve essere usata cautela quando si procede al di là di questa temperatura. </li></ol> 5. Caratterizzazione di Polymersomes di Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) <ol><li> Spostare il vetrino con il aderito coverwell direttamente a un microscopio invertito per l&#39;imaging. </li><li> Scegliere il set di filtri appropriata in base al lipide fluorescente incluso nella soluzione polimerica. Per lipidi rodamina-etichettati drogati nelle soluzioni polimeriche, utilizzare un 560/25 nm filtro di eccitazione e di un filtro 607/36 nm di emissione, o set di filtri comparabili. </li><li> Utilizzare un obiettivo olio 100X a concentrarsi sulla superficie superiore del vetrino in cui verranno rispettati i polymersomes. Se i polymersomes sono particolarmentegrande (&gt; 20 micron) oppure se il film polimerico è troppo spesso, un obiettivo di potenza inferiore (ad esempio, 40X) deve essere utilizzato per visualizzare meglio i polymersomes. </li><li> Identificare i polymersomes usando la microscopia a fluorescenza. Identificare polymersomes dalla caratteristica cava, vescicole sferico con un diametro&gt; 5 micron. </li><li> Caratterizzare fluidità di membrana con recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) su un microscopio a fluorescenza contenente un condensatore regolabile. A causa della natura aderente e stretto imballaggio polymersomes sui substrati, movimento naturale delle polymersomes è limitata, aumentando la qualità delle immagini FRAP. <ol><li> Mettere a fuoco il microscopio sul polymersome di interesse. Chiudere il condensatore ad una piccola regione e assicurare che il bordo di un polymersome è all&#39;interno della regione di imaging di interesse. </li><li> Aumentare l&#39;esposizione della fotocamera e garantiscono tutti i filtri a densità neutra vengono rimossi per photobleach efficacemente la regione di interesse. Lasciare che il fl membrana<html> fluorescenza intensità per photobleach per 30-60 secondi o fino a quando l&#39;intensità di fluorescenza è significativamente diminuita. </li><li> Spegnere la lampada e aprire completamente il condensatore. Ridurre l&#39;esposizione alle impostazioni di partenza e di iniziare immediatamente catturare immagini ogni 30 secondi per 3 min. </li><li> Calcola coefficienti di diffusione a membrana utilizzando metodi standard 12. Se la regione sbiancato riacquista intensità di fluorescenza ai 3-5 min, ciò indica che la membrana è fluido. </li></ol></li></ol> 6. Caratterizzazione di Polymersome Size <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Figura 6. Procedimento per l&#39;analisi delle dimensioni polymersomes utilizzando software di imaging. Passo-passo le istruzioni su come misurare il diametro delle vescicole formate. L&#39;utente deve conoscere le unità di taratura in pixel / micron del microscopio utilizzato.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <ol><li> Aprire le immagini acquisite di polymersomes nell&#39;immagine software di analisi 13. </li><li> Impostare la scala per l&#39;immagine cliccando sulla casella analizzano discesa e la &quot;scala set&quot; clic. <ol><li> Calibrare la scala per il microscopio usando metodi standard (ad esempio, un micrometro). </li><li> Riempire le unità di calibrazione e fare clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Fare clic sulla casella strumento a riga e tracciare una linea che attraversa il diametro di una vescicola. </li><li> Raccogliere le misure di lunghezza, cliccando sulla casella analizzano discesa e facendo clic su &quot;misura&quot;. </li><li> Continuare misurazione vescicole individuali in seguito alla procedura di cui sopra ed ogni nuova misurazione sarà aggiunto alla finestra misurazioni dati. </li><li> Premere il tasto &quot;Ctrl + D&quot; dopo aver disegnato ogni riga e misurando la lunghezza per imprimere la linea tracciata sulimmagine rendendo più facile per tenere traccia che le vescicole sono stati analizzati. </li></ol>

<ol>
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Sandia National Laboratories is a multi-program laboratory managed and operated by Sandia Corporation, a wholly owned subsidiary of Lockheed Martin Corporation, for the U.S. Department of Energy's National Nuclear Security Administration under contract DE-AC04-94AL85000.

Polymersomes stanno diventando ampiamente esplorati come imita membrana biologica. Le proprietà robuste e versatili di polimeri li rendono molto attraente per gli studi che richiedono funzionalizzazione della membrana, la longevità e la reattività sintonizzati. I metodi tradizionali per la formazione di giganti di dimensioni polymersomes 9,10 (&gt; 4 micron) sono ad alta intensità di manodopera e richiedono costose attrezzature e specializzato. Qui vi presentiamo per la prima volta, un metodo rapido, versatile e robusta per la formazione di polymersomes giganti di dimensioni utilizzando reagenti di laboratorio a basso costo standard e attrezzature. Utilizzando reidratazione gel assistita, polymersomes unilamellari possono essere formate rapidamente (&lt;30 min), in una varietà di soluzioni di reidratazione (compresi mezzi di coltura cellulare) e con una varietà di diversi polimeri (dati non mostrati). La formazione di vescicole multilamellari o asimmetrici non è stato osservato utilizzando questa tecnica. In tutto questo lavoro, abbiamo utilizzato poli (ossido di etilene) - poli b- (butadiene) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) copolimero diblock neutro. Molte composizioni di polimeri diversi (compresi i copolimeri diblock cariche) funzionano bene con questo metodo (non mostrato). Tuttavia, alcuni copolimeri triblocco disponibili in commercio e superiori copolimeri peso molecolare diblock (~&gt; 5.000 Dalton) non formano polymersomes distinti. Per tutti gli esperimenti in questo manoscritto, una bassa concentrazione di lipidi marcato è stato drogato nelle soluzioni polimeriche solo per scopi di visualizzazione. Altri metodi per la visualizzazione, compresi i polimeri funzionalizzati direttamente con un colorante fluorescente possono anche essere utilizzati. Polymersomes possono parimenti essere ripreso con la microscopia in campo chiaro, anche se la microscopia a fluorescenza fornisce una maggiore risoluzione. La maggior parte delle piccole modifiche al protocollo di solito non alterano i risultati. Ad esempio, piccole differenze nella concentrazione della soluzione polimerica spargere sul coprioggetto non alterano la formazione del polimero film formata. Mentre la gamma completa concentrazione non è stato determinato, formazione polymersome avverrà con successo con una vasta gamma di concentrazioni film polimerico (per esempio, 1-10 mg / ml). Tuttavia, ci sono alcune modifiche di protocollo che influenzano negativamente la formazione polymersome. La più notevole è che vetrini rotondi (invece di quadrato) risultato in pessime formazione di polymersomes. Noi attribuiamo questo al estremamente strato uniforme di agarosio sul vetro che ostacola di fatto la formazione di polymersomes. Una delle sfide più importanti di questa tecnica è la capacità di recuperare i polymersomes dalla superficie con una resa elevata. Ci sono alcuni casi in cui la rimozione delle polymersomes dalla superficie originale può essere vantaggioso. A causa della elevata fluorescenza di fondo del film polimerico disidratato, rimuovere singole polymersomes e aderendo loro di pulire coprioggetti aumenterà la qualità delle immagini e caratterizzazione (partilare durante l&#39;analisi FRAP). Per fare questo, delicato pipettaggio con un puntale in cui alla fine è stata tagliata sarà desorbire le polymersomes dalla superficie (anche se il numero di vescicole recuperati è significativamente inferiore rispetto a quelli originariamente formate). Polymersomes possono quindi essere posizionati su superfici coprioggetto modificati, permettendo polymersome di interagire con il nuovo coprioggetto. In genere, per neutri polymersomes PEO-PBD, coprioggetto trattata con ozono per 15 minuti permettono alle polymersomes a cadere verso la superficie per l&#39;imaging. Diverso modifica della superficie è necessario per diverse composizioni polymersome (ad esempio, negativamente o positivamente accusato polimeri). La maggior parte dei materiali utilizzati in questo protocollo sono memorizzati con successo e utilizzati per giorni o settimane. L&#39;agarosio solidificato può essere ribollita e riutilizzato fino alla agarosio comincia ad avere aggregati anche dopo l&#39;ebollizione, o agarosio solidificato comincia ad asciugare. Coprioggetto con film agarosio secchi possono essere memorizzati e l&#39;usod indeterminato (es mesi). Il polimero disciolto in cloroformio può essere conservato a -20 ° C per diversi mesi. Una volta che il film polimerico viene essiccato sui film agarosio, tuttavia, i film devono essere conservati sotto vuoto casa e utilizzati entro due settimane (conservazione a lungo termine non è stato determinato direttamente, ma ci sono differenze notevoli nella polymersomes formate da pellicole polimeriche più di due settimane). Utilizzando il protocollo di reidratazione gel assistita presentato qui, centinaia di polymersomes a forma di uniforme si formano rapidamente con poche ore di lavoro con dotazioni di serie e reagenti di laboratorio a basso costo. Inoltre, polymersomes possono essere formati in una varietà di soluzioni tampone fisiologici e dalle differenti composizioni polimeriche (non mostrato). Eventuali modifiche minori metodo non modificano negativamente la formazione di polymersomes, rendendo reidratazione gel assistita una tecnica versatile e accessibile a scienziati variando tecnica expertise. La possibilità di creare facilmente polymersomes giganti sulla scala dimensioni delle cellule è fondamentale per la costruzione di sistemi di celle simili artificiali. La facilità d&#39;uso e la versatilità di reidratazione gel assistita per rendere questi polymersomes offre un grande progresso nel campo biomimetico per la creazione di solidi imita membrana cellulare. Ad esempio, utilizzando questa tecnica, strategie per l&#39;incapsulamento delle diverse componenti intracellulari, funzionalizzazione del polimero con le proteine ​​cellulari membrana e incorporazione di trasportatore di membrana, solo per citarne alcuni, può essere progettato per costruire cellule artificiali polymersome-based.

Creazione di vescicole, sintetici cellulari dimensioni giganti unilamellari (GUVs) è di crescente interesse per la ricostruzione in vitro di diversi processi cellulari per costruire un quadro per la generazione di un alveolare 1,2 sistema artificiale. Mentre GUVs composti da membrane lipidiche sono ottimi imita di membrane biologiche, naturali, sono instabili contro le fluttuazioni ambientali e hanno una abbastanza breve durata. A causa di queste limitazioni, copolimeri a blocchi anfifilici sono stati usati come imita lipidi per formare vescicole polimeriche o polymersomes. In questo contesto, polymersomes sono vantaggiose nello sviluppo di sistemi cellulari biomimetici a causa della loro maggiore stabilità 3, versatilità chimica 4,5 e caratteristiche fisiche modificabili 6 - 8. I metodi attuali per formare polymersomes giganti di dimensioni includono electroformation 9 e reidratazione su modelli 10, entrambi which sono in termini di tempo, attrezzature alta intensità di lavoro, richiedono specializzata e produrre basse rese di polymersomes giganti intatti. Un metodo semplice reidratazione gel assistita stato recentemente sviluppato per la produzione di lipidi GUVs 11. Qui, descriviamo un adattamento della tecnica reidratazione gel assistita per creare polymersomes giganti con differenti composizioni polimeriche, dimensione controllata e in varie composizioni tampone. In breve, 1% w / v del gel DNA Films elettroforesi di agarosio standard sono disidratato su un vetrino di vetro. soluzioni polimeriche preparate in cloroformio sono poi diffuse in tutta la pellicola agarosio disidratati e lasciare evaporare. Dopo allontanamento del solvente completo, film polimerici vengono reidratate nel buffer di scelta con moderato riscaldamento (40-70 ° C) e gigante (&gt; 4 micron) polymersomes dimensioni sono formati in 30 min. Questo metodo produce rapidamente centinaia di completamente intatte, polymersomes ben formate utilizzando attrezzature di laboratorio standard ed Reagents a costi minimi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Figura 1. Schema raffigurante il metodo reidratazione gel assistita. Polymersomes giganti composte da un copolimero diblocco sono formate dopo ~ 30 minuti di reidratazione. Il blocco idrofilo è indicato in magenta e il blocco idrofobico è indicato in verde. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 guage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD-305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm square coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>A standard agarose for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>288306-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commerical coverwell</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70336</td>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Download: http://fiji.sc/Fiji&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial with Teflon Lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66009-556</td>
			<td>1.9mL capacity, case of 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150C</td>
			<td>1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>10.2 cm x 38.1 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2904-BdEO</td>
			<td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastic Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300001-057</td>
			<td>1/2&#34; width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forming giant-sized polymersomes using gel-assisted rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

Polymersomes sono formate utilizzando la procedura sopra descritta (figura 1) e l&#39;equipaggiamento di laboratorio mostrato in Figura 2. Polymersomes stati reidratato con acqua deionizzata (Figura 3) e ripreso su un microscopio invertito in epifluorescenza con obiettivo olio 100X. Si noti che se polymersomes non sono visibili, potrebbero hanno formato con dimensioni troppo grandi per catturare con un obiettivo di olio 100X; un obiettivo di potenza inferiore può avere bisogno di essere utilizzato. Uno dei vantaggi di utilizzare reidratazione gel assistita è la versatilità di formare polymersomes in una varietà di soluzioni di reidratazione. Polymersomes sono formati successo in acqua deionizzata, un mezzo di coltura cellulare di mammifero piena, soluzioni di saccarosio e due soluzioni tampone fisiologicamente rilevanti (tampone fosfato salino (PBS) o soluzione salina tamponata con Tris (TBS)), come mostrato in Figura 4. In condizioni standard (reidratazionecon acqua a 40 ° C per 1 ora), maggiori di ~ 70 polymersomes trovano tipicamente a 40 x 40 micron 2 campo visivo. Mentre la produzione di superficie di polymersomes non è omogeneo, ci sono decine di campi di vista con questo resa rappresentativa. Inoltre, polymersomes erano stabili in soluzione per almeno 24 ore. dimensione Polymersomes è stato facilmente messo a punto dalla reidratazione film polimerici a temperature variabili. Polymersomes formate in acqua deionizzata a RT avevano un diametro medio di 2,9 ± 0,7 micron. Come la temperatura aumenta durante la reidratazione, la dimensione media delle polymersomes aumenta anche (Tabella 1). Alle alte temperature (&gt; 60 ° C), polymersomes formati con dimensioni ancora maggiore di 100 micron (Figura 5). Tutto l&#39;elaborazione delle immagini è stata completata utilizzando open-source software di imaging (Figura 6).Immagini raccolte sono stati aperti nel programma software. La dimensione dei pixel calibrata è stato stipulato scatola scala impostato. Utilizzando lo strumento linea, linee sono state elaborate attraverso i diametri. Dopo ogni singola linea è stata tracciata, la lunghezza calibrata è stata misurata e aggiunta alla casella di risultati. I dati possono poi essere tracciata nel software matematico di scelta (ad esempio, Excel, Prisma, origine, ecc) <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Figura 2. Immagine dei materiali di laboratorio comuni e poco costosi necessari per la formazione di polymersomes Gli articoli richiesti sono: Parafilm, un 18,5 ago G, polimero in cloroformio o altro solvente appropriato, una pipetta punta 1.000 microlitri, una beuta, pinzette, agarosio, 25 mm coprioggetto quadrati, pozzi di imaging PDMS e un bicchiere capsula di Petri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">cliccate qui per</a>visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini del metodo reidratazione gel-assistita. Disciolto agarosio si sviluppa su un vetrino piazza 25 millimetri fino a un anche cappotti di film l&#39;intera coprioggetto. Coprioggetto vengono poi messi in un incubatore a 37 ° e il film è disidratata. Una soluzione di polimero viene depositato sulla pellicola agarosio disidratati e diffondersi tramite un ago in un movimento circolare. Il vetrino viene poi posto in un essiccatore O / N di evaporare completamente eventuali residui di solvente. Infine, e camera di imaging viene fatto aderire al substrato e polimeri sono reidratato con soluzione di scelta e collocato in una capsula di Petri a 40 ° C per almeno 25 minuti per consentire la formazione di polymersomes. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> </p<html> &gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Figura 4. Polymersomes possono formare in una varietà di diversi tamponi. Pellicole polimeriche PEO-PBD state reidratate con il buffer indicato a 40 ° C per 1 ora. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;aumento della temperatura durante la reidratazione aumenta la dimensione delle polymersomes. Immagini epifluorescenza rappresentativi di polymersomes formate in acqua alle temperature indicate reidratazione. L&#39;aumento di temperatura risultati in polymersomes più grandi. Barra di scala = 10 micron._blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temperatura (° C) </td><td> Dimensione media (micron) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2.93 ± 0.7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5.76 ± 2.5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6.65 ± 2.4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11.46 ± 5.8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7.0 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. L&#39;aumento della temperatura durante la reidratazione risultati in aumento delle dimensioni polymersome. Diametri medio per superiore a 100 polymersomes in acqua per diverse condizioni di temperatura sono stati calcolati e sono raffigurati qui. Errore è la deviazione standard.

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Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Formare giganti di dimensioni Polymersomes Uso reidratazione Gel-assistita

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Views.  Sandia National Laboratories. We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Ricerca

Bioingegneria

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Pattern-based Search of Epigenomic Data Using GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and other functional genomic data are very limited. GeNemo is the first online search tool that accomplishes this goal. Users input their functional genomic data in the Browser Extensible Data (BED), Peaks, and bigWig formats, and may search for data in any of the three formats. Users may specify which types of datasets to search against, choosing from a variety of online datasets, with the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) representing different epigenomic marks, transcriptional factor binding sites, and chromatin hypersensitivities or accessibilities in specific cell types, and developmental stages or species (mouse or human). GeNemo returns a list of genomic regions with matching patterns to the input data, which may be viewed in the browser as well as downloaded in the BED file format. The upgraded GeNemo has improved graphical display, has more robust interface, and is no longer prone to errors due to changes in the University of California, Santa Cruz (UCSC) genome browser. Troubleshooting steps for common problems are discussed. As the amount of functional genomic data is expanding exponentially, there is a critical need to develop and refine new bioinformatic tools such as GeNemo for data analyses and interpretation.

Unlike DNA sequence data, epigenomic data are not readily subjected to text-based searches. Presented here are the procedures to use an upgraded version of GeNemo, a web-based bioinformatics tool, to conduct pattern-based searches for similarities in epigenomic data comparing available online databases including Encyclopedia of DNA Elements with user&#39;s data.

Ricerca basata su pattern di Epigenomic dati utilizzando GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta risoluzione svevapacifico modellato mediante deposizione di Biofilm-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Modellazione semplice, economica e modulare delle cellule utilizzando il DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...