Work in the authors' laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.

Etica Dichiarazione: allevamento e la gestione del mouse sono in conformità alla normativa del Regno Unito del Ministero degli e le linee guida del Comitato Etico UCL, rispettando gli animali (procedure scientifiche) Act 1986 del Regno Unito e la sua modifica Regolamento 2012. NOTA: Tutte le soluzioni devono essere effettuate con dietilpirocarbonato (DEPC) - acqua trattata a distruggere ogni residuo RNasi. Per il trattamento DEPC, aggiungere DEPC (1 ml per litro), agitare energicamente fino a quando tutti i globuli DEPC sono scomparsi poi in autoclave a degradare il DEPC. 1. RNA Probe Synthesis <ol><li> ATTENZIONE: Quando si maneggia formammide, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) e utilizzare una cappa di sicurezza. Preparare tampone di ibridazione: trattata con DEPC acqua deionizzata con il 50% (v / v) formammide deionizzata, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml tRNA di lievito, 1 × soluti di Denhardt, e 10% w / v destrano solfato. </li><li> Scegliere un clone di DNA che contiene la sequenza di cDNA del gene di interesse in un plasmide con i promotori RNA polimerasi. Per questo esempio, utilizzare un clone pCMV-SPORT6, IRAVp968C0654D (GenBank accessionBC024934), con T7 e promotori polimerasi RNA Sp6 per Aspa (Figura supplementare 1). </li><li> Preparare DNA plasmide linearizzato come modello. <ol><li> Grow il clone DNA, estrarre il plasmide con una piccola scala kit di purificazione plasmide secondo il protocollo del produttore e sequenza con il T7 e SP6 primers universali. </li><li> Digest 1.020 mg DNA plasmide con un enzima di restrizione che taglia all&#39;estremità 5 &#39;del filamento senso del cDNA. Per questo esempio, utilizzare il 100 unità Sai I a digerire il plasmide pCMV-SPORT6- Aspa. Incubare per 1,5 ore a 37 ° C. </li><li> Eseguire una piccola aliquota su gel di agarosio per verificare che il plasmide è completamente linearizzata. </li></ol></li><li> purificare ilplasmide linearizzate con fenolo-cloroformio. <ol><li> Aggiungere 1/10 volume di 3 M acetato di sodio, un volume di 10 mM Tris HCl (pH 8,0) - fenolo equilibrato e un volume di cloroformio / alcool isoamilico (IAA) (24: 1). </li><li> Centrifugare a 16.000 xg per 1 min a RT (20 - 25 ° C, RT) ed estrarre fase acquosa superiore. </li><li> Aggiungere un volume di cloroformio / IAA, centrifugare a 16.000 xg per 1 min e estrarre fase acquosa superiore. </li><li> Ripetere il punto 1.4.3. </li><li> Aggiungere 2 volumi di etanolo e lasciare a -20 ° C per 1 ora o O / N. </li><li> Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 10 min. Eliminare il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con il 70% di etanolo freddo e risospendere in approssimativamente 1 mg cDNA per 2,5 microlitri di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5). </li></ol></li><li> Sintetizzare le due sonde, uno marcato con digossigenina (DIG) e l&#39;altra con isotiocianato di fluoresceina (FITC). <ol><li> Selezionare la RNA polimerasi appropriata per rendere l&#39;anti-seSonda NSE (complementare al bersaglio mRNA). Per questo esempio, utilizzare T7 RNA polimerasi a fare sonda Aspa. </li><li> Preparare in vitro reazione di trascrizione: aggiungere 1 mg di DNA linearizzato, 4,0 ml 5 x buffer di trascrizione, 6.0 ml di 100 mM DTT, 2,0 ml di 10x DIG o FITC RNA etichettatura miscela contenente dNTP, 1 inibitore della RNasi ml, e 20 - 40 unità di RNA polimerasi; rendere il volume finale a 20 microlitri con acqua trattata con DEPC. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1,5 ore. </li></ol></li><li> microlitri Run1 della reazione di trascrizione su un gel di agarosio 1,0% per verificare che la reazione ha lavorato. Il gel dovrebbe mostrare il modello lineare e una banda luminosa della sonda. </li><li> Portare al volume di 100 ml con tampone di ibridazione e di memorizzare 10 aliquote microlitri a -80 ° C. </li></ol> 2. Perfusione, Fissazione e tessuto Collection <ol><li> ATTENZIONE: Quando si maneggia paraformaldeide (PFA), sia solido eacquosa, indossare DPI e utilizzare una cappa di sicurezza. Preparare la soluzione di formaldeide sciogliendo 4% (w / v) di PFA in 1x tampone fosfato salino (PBS) utilizzando il calore (55 ° C). Filtrare la soluzione di formaldeide con carta da filtro. </li><li> Preparare la soluzione di saccarosio sciogliendo 20% (w / v) di saccarosio in acqua distillata e aggiungere 0,1% (v / v) DEPC. Lascia O / N a temperatura ambiente con un coperchio sciolto e poi in autoclave. </li><li> Terminally anaesthetize un topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbitone (50 mg / kg). Valutare la profondità dell&#39;anestesia per pizzico punta e l&#39;assenza di recesso riflesso indica anestesia profonda. </li><li> Una volta che il mouse è sotto anestesia profonda, fare un&#39;incisione sotto la gabbia toracica e tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati, sollevarlo per esporre il cuore. </li><li> Inserire un ago da 25 G nel ventricolo sinistro del cuore. Fai una piccola incisione nell&#39;atrio destro del cuore. </li><li> Profumato l&#39;animale con 20 ml di PBS e quindi 40 ml di soluzione di formaldeide. Per P30 e anzianitopi, utilizzare un tasso di perfusione di 12 ml / min, ma per gli animali giovani utilizzano un tasso inferiore (7 - 10 ml / min). </li><li> Sezionare il cervello. <ol><li> Sever la testa del mouse con le forbici chirurgiche facendo una posteriore tagliata dalle orecchie. Effettuare una incisione mediana caudale nella pelle e lavorare rostralmente per rimuovere la pelle dal cranio. </li><li> Partendo dalla parte caudale, tagliare la parte superiore del cranio lungo la linea mediana e tra gli occhi con le forbici Iris. Rimuovere parietale e placche ossee frontali inclinando un lato di una piastra ossea ogni volta e facendo scattare via con pinzette. </li><li> inclinare leggermente il cervello verso l&#39;alto dalla parte anteriore con una pinzetta e tagliare i nervi ottici e di altri nervi cranici. Sollevare delicatamente il cervello fuori dal cranio. </li></ol></li><li> Mettere il cervello in una matrice cervello coronale del mouse. Tagliare il cervello in 3 circa 4 pezzi mm con una lama di rasoio piuma. </li><li> Trasferire le fettine in soluzione al 4% PFA e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Trasferimento del cervellofette di DEPC-trattati del 20% soluzione di saccarosio e incubare O / N a 4 ° C </li><li> Mettere ogni fetta cervello in un cryomould secca, circondare con la temperatura di taglio ottimale (OCT) di medie e congelare in ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. criosezionamento <ol><li> Tagliare 15 sezioni micron di tessuto congelato in un criostato e raccogliere le sezioni su vetrini da microscopio. Se necessario, bagnare le sezioni con DEPC trattati con PBS e appiattire con un pennello fine. </li><li> Lasciare le diapositive asciugare per circa 1 ora a garantire che il tessuto aderisce alla slitta. </li></ol> 4. ibridazione <ol><li> Preparare 65 ° C tampone di lavaggio: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x salina di sodio citrato), 50% (v / v) formammide e 0,1% (v / v) Tween- 20. </li><li> Preparare MABT buffer: 100 mM di acido maleico, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5. </li><li> Diluire le due sonde (DIG-etichettati e FITC-Labelled) 1 / 1.000 in tampone di ibridazione pre-riscaldato a 65 ° C e mescolare bene. </li><li> Applicare circa 300 ml di miscela di ibridazione su ogni diapositiva, coverslipwith (C 200 o) coprioggetto da forno e incubare O / N a 65 ° C in una camera umidificata. </li><li> Trasferire i vetrini in una vaschetta Coplin contenente tampone di lavaggio pre-riscaldato. Lavare i vetrini per 30 minuti due volte a 65 ° C con tampone di lavaggio. </li><li> Lavare i vetrini per 10 minuti tre volte con MABT a temperatura ambiente. </li></ol> 5. Visualizzazione del FITC Probe <ol><li> Preparare tampone di bloccaggio ISH: MABT con il 2% di bloccaggio del reagente e il 10% di siero di pecora inattivato al calore. </li><li> Opzionale: utilizzare una penna idrofobico per disegnare cerchi intorno sezioni di tessuto sul vetrino per ridurre il volume di soluzioni anticorpi necessari. </li><li> Incubare i vetrini per 1 ora a RT con ISH tampone di bloccaggio in una camera umidificata. </li><li> Incubare la vetrini O / N a 4 ° C con perossidasi di rafano (POD) - coniugatod anticorpo anti-FITC diluito 1/500 (v / v) in tampone bloccante ISH. </li><li> Porre i vetrini in una vaschetta Coplin contenente PBS con 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Lavare 3 volte per 10 min in PBST e sostituirlo con PBST fresco ogni volta. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare il tiramide fluorescente diluendo 100 volte nel diluente di amplificazione. Per questo esempio, utilizzare FITC-tiramide. </li><li> Aggiungere questo per le diapositive e lasciare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Porre i vetrini in una vaschetta Coplin e lavare 3 volte in PBST per 10 min. </li></ol> 6. Visualizzazione della DIG Probe <ol><li> Preparare 0.1 M Tris- HCl pH 8,2. </li><li> Incubare i vetrini con tampone ISH di blocco per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la vetrini O / N a 4 ° C con una fosfatasi alcalina (AP) coniugata anticorpo anti-DIG diluito 1 / 1.500 (v / v) in tampone bloccante ISH. </li><li> Lavare con MABT per 10 minuti tre volte. </li><li> Lavare due volte con 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 per 5 minuti a RT. </li><li>Immediatamente prima dell&#39;uso, preparare la soluzione Red veloce sciogliendo le tavolette in 0.1 M Tris pH 8,2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron. </li><li> Incubare i campioni a 37 ° C con una soluzione Fast Red in una camera umidificata. Poiché il tempo per lo sviluppo ottimale varia, controlla le diapositive regolarmente con un microscopio a fluorescenza per monitorare la formazione di precipitato. Per questo esempio, arrestare la reazione dopo 2 - 3 ore. </li><li> Lavare con PBST per 10 minuti tre volte. </li></ol> 7. immunoistochimica <ol><li> Preparare IHC tampone bloccante: 10% (v / v) di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario) in PBST. </li><li> Incubare i vetrini con IHC tampone bloccante per 1 ora a RT in una camera umidificata. </li><li> Preparare l&#39;anticorpo primario: diluire l&#39;anticorpo primario ad una diluizione appropriata in PBST con 5% di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario). Per questo esempio, utilizzare un anticorpo di coniglio anti-Olig2 a 1/400 (v / v) di diluizione. </li><li>Incubare la soluzione di anticorpo primario a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare con PBST per 10 minuti tre volte. </li><li> Preparare anticorpo secondario: diluire un anticorpo secondario fluoroforo coniugato ad una diluizione appropriata in PBST con il 5% (v / v) di siero (di una specie diversa per ospitare anticorpo primario) e 0,1% (v / v) Hoechst 33258. Per questo esempio , utilizzare un asino anti-coniglio Alexa647 anticorpo secondario a 1 / 1.000 (v / v) di diluizione. </li><li> Incubare la soluzione di anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare con PBST per 10 minuti tre volte. </li></ol> 8. Montaggio <ol><li> Parzialmente asciugare le diapositive a temperatura ambiente, e montare con un mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare le diapositive asciugare e poi l&#39;immagine in un microscopio confocale sotto 10X, 20X e 63X obiettivi utilizzando 4 canali diversi con le seguenti lunghezze d&#39;onda di eccitazione: 570 nm per Fast Red, 488 nm per FITC, 647 nm per Olig2 immunolabelling e 350 nm per la Hoechst . </li></ol>

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	<li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease.">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li><li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain:+metabolism+and+function.">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li><li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canavan+disease:+clinical+features+and+recent+advances+in+research.">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li><li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease.">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li><li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease.">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li><li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease.">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li><li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Acetylaspartate+in+the+CNS:+from+neurodiagnostics+to+neurobiology.">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li><li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+(aminoacylase+II)+in+the+developing+rat.">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li><li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue.">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li><li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aspartoacylase+(ASPA)+and+Canavan.">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li><li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain.">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li><li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system.">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li><li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme.">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li><li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS:+therapeutic+implications+for+Canavan+disease.">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li><li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination.">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia,+neurons,+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex.">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per un doppio RNA ibridazione in situ seguito da immunocolorazione. Abbiamo usato questo protocollo per confermare che Aspa è espresso in oligodendrociti maturi in diverse aree del cervello. Questa procedura multi-step ha molti potenziali insidie ​​che possono influenzare la sensibilità e dovrebbero essere evitati. In primo luogo, tutte le soluzioni e buffer di memorizzazione per la reazione di trascrizione devono essere-RNasi libero. In secondo luogo, la scelta di modelli di cDNA è importante e preferiamo modelli approssimativamente 1 kb di lunghezza. È necessario pulire i modelli cDNA con fenolo / estrazione con cloroformio e ri-precipitato prima trascrizione in vitro. Inoltre, la trascrizione della sonda deve essere ottimale; Se la sonda non viene prodotto in quantità sufficiente, si ridurrà la qualità della ISH. La qualità della sonda può essere controllato esaminando su un gel di agarosio e buona qualità saràevidenziato dalla forte luminosità della banda della sonda rispetto alla banda template (Figura 2). Per il doppio ISH, due sonde diversamente etichettati vengono utilizzati, di solito uno marcato con DIG e l&#39;altra con FITC. La sonda marcata con FITC è considerato il minimo rilevabile e deve essere scelto in cui l&#39;mRNA bersaglio dovrebbe essere più alta nel tessuto. Questa sonda è solitamente sviluppato prima e la sonda DIG marcato è sviluppato secondo. Un altro passo importante è la preparazione dei tessuti. I topi sono perfusi con PBS DEPC trattati seguito da 4% PFA, post-fissati in 4% PFA O / N e poi crioprotetti in soluzioni di saccarosio 20% che sono stati DEPC trattati per distruggere qualsiasi RNasi residuo. tempo di fissazione è molto importante; sovra o sotto-fissaggio può portare a un segnale più debole, forse a causa di penetrazione ridotta sonda (over-fissazione) o la degradazione del mRNA (sotto-fissazione). Il tessuto viene poi cryosectioned e due sonde sono ibridate O / N. La formammideutilizzato nel tampone di ibridazione deve essere deionizzata. Una considerazione molto importante durante la O / N ibridazione a 65 C è per evitare l&#39;evaporazione e la concentrazione della miscela di ibridazione come potrebbe compromettere sensibilità. Nell&#39;esperimento descritto ci siamo esibiti ibridazione a 65 CO / N, ma potrebbe essere la pena di provare temperature più basse per le diverse sonde se sembra essere difficile da rilevare l&#39;mRNA bersaglio. Vi è una scelta di reagenti per rilevare le sonde ibridate. Fast Red è un reagente fluorescente sensibile ma non tutti i lotti di Fast Red dare lo stesso risultato. Ha bisogno di AP per lo sviluppo e dà la fluorescenza con rodamina eccitazione. Nella nostra esperienza, è importante rendere fresco con 0,1 M Tris-HCl pH 8.2 e filtrata prima dell&#39;uso. Un&#39;opzione non fluorescente è lo sviluppo del colore con tetrazolio nitro-blu (NBT) e 5-bromo-4-cloro-3&#39;-indolyphosphate (BCIP) che funziona con lo stesso anticorpo AP-coniugato. Anoopzione che ci sia utilizzando tiramide fluorescenza per il rilevamento. Sebbene i sistemi Tyramide fluorescenti non sono i metodi più sensibili, la reazione di sviluppo con perossidasi di rafano è molto veloce e ci sono almeno tre colori fluorescenti (FITC, Cyanine 3 e Cyanine 5) che può essere utilizzato. Una limitazione di questo protocollo è che alcuni antigeni bersaglio (o epitopi), in particolare proteine ​​poco abbondanti, potrebbero non essere rilevabili dopo il processo di ISH e quindi non sono adatti per IHC dopo ISH. Nel nostro immunostaining, la rilevazione di anticorpi di Olig2 appare inalterato. L&#39;utente dovrà scegliere l&#39;anticorpo giusto per immunolabelling seguente ISH. IHC e ISH sono comunemente utilizzate tecniche per studi pattern di espressione genica, ed entrambi hanno pro e contro. IHC è un metodo altamente sensibile per rilevare l&#39;espressione cellulare di geni in sezioni di cervello, ma la sua dipendenza l&#39;anticorpo influenza la sua specificità e limita la sua applicazione. Per contro, ISH ha un alto specificity e la sonda di qualsiasi gene possono essere facilmente sintetizzati mediante trascrizione in vitro usando il cDNA specifico gene come template. Il protocollo che abbiamo sviluppato sfrutta entrambi i metodi, che unisce doppio ISH con IHC per ottenere il rilevamento tripla di espressione genica con elevata specificità. In breve, il protocollo che descriviamo qui consente colorazione simultanea di due mRNA e una proteina, in modo che fornisce uno strumento utile per illustrare l&#39;espressione genica co-localizzato. Nonostante il fatto che l&#39;espressione di mRNA non sempre correlata con l&#39;espressione della proteina, ISH è una tecnica potente che ci permette di esaminare l&#39;espressione genica con elevata specificità. Il nostro protocollo di doppia ISH fluorescenza combinato con IHC ha dimostrato di essere un successo nel rilevare espressione Aspa in un sottoinsieme di oligodendrociti nel tessuto cerebrale di topi adulti, e può essere facilmente adattato per una varietà di tessuti di diversa origine e stadi di sviluppo. Inoltre, questo protocollopuò essere utilizzato anche per rilevare espressione di piccoli RNA come miRNA.

cellule gliali, che sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale (CNS), comprendono oligodendrociti (cellule mielinizzanti di CNS), oligodendrociti precursori (PO, noto anche come &quot;cellule NG2&quot;), astrociti e microglia. Vi è un crescente interesse per le funzioni delle cellule gliali e dei loro ruoli potenziali nelle malattie neurologiche 1. Ad esempio, malattia di Canavan (CD) è una malattia neurodegenerativa ereditaria di partenza nella prima infanzia con leucodistrofia spongiforme e una progressiva perdita di neuroni, che porta alla morte di solito prima dei 10 anni di età 2,3. Le mutazioni nel gene Aspartoacyclase (ASPA), che portano a ridurre drasticamente l&#39;attività ASPA 4 nel CD sono stati identificati. ASPA è un enzima che catalizza la deacetilazione di N-acetilaspartato (NAA), una molecola altamente concentrata nel cervello, acetato di generazione e aspartato 5-7. Molti pazienti CD mostrano livelli più elevati di NAA causa della mancanza di ASPA actività. Alcuni studi ipotizzano che l&#39;acetato NAA-derivato potrebbe essere una delle principali fonti di acidi grassi / lipidi nel cervello durante lo sviluppo e CD può derivare da una diminuzione sintesi della mielina durante lo sviluppo causata dal fallimento di NAA essere ripartiti 3,5,6. ASPA si trova soprattutto nel rene, fegato e materia bianca del cervello, e dato il ruolo importante ASPA in CD, l&#39;espressione cellulare di questo enzima nel cervello è stato studiato da molti laboratori. Osservando ASPA attività enzimatica nel cervello, studi precedenti hanno trovato che l&#39;aumento dell&#39;attività ASPA durante lo sviluppo cerebrale parallelo l&#39;andamento temporale della myelination 8-10. A livello cellulare, saggi di attività enzimatica e ibridazione in situ (ISH) e immunoistochimica (IHC) analisi suggeriscono che ASPA è espresso principalmente in oligodendrociti nel cervello, ma non nei neuroni o astrociti 11-16. Alcuni studi hanno trovato che ASPA potrebbe ancheessere espresso in microglia nel sistema nervoso centrale 12,14. i dati finora su espressione ASPA OPS sono limitati. Secondo un recente studio in cui trascrittomi di diversi tipi di cellule nel topo corteccia cerebrale compresi i neuroni, astrociti, PO, oligodendrociti di nuova formazione, oligodendrociti mielinizzanti, microglia, cellule endoteliali e periciti sono stati analizzati da RNA sequenziamento 17, ASPA è espresso esclusivamente in oligodendrociti , in particolare nel mielinizzanti oligodendrociti (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Nonostante questi studi sulla ASPA modello di espressione nel cervello, una serie di incertezze rimangono. Diverse tecniche possono essere utilizzati per studiare gli schemi di espressione genica. IHC è un metodo comunemente utilizzato per rilevare il prodotto funzionale (cioè, proteine) dell&#39;espressione genica in sezioni di tessuto. Nonostante la sua grande utilità, questa tecnica ha limitazioni sua applicazione e specificità sono soggetti to la disponibilità e specificità dell&#39;anticorpo necessaria. In confronto, ISH ha il vantaggio di essere in grado di rivelare l&#39;espressione di un gene a livello di mRNA. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile utilizzare più sonde contemporaneamente per localizzare una espressione genica di specifici tipi di cellule. In questo articolo, si descrive un protocollo che combina doppia RNA fluorescente in situ con fluorescenza ibridazione immunolabelling di una proteina. Abbiamo utilizzato questo insieme di tecniche per esaminare il pattern di espressione di Aspa in cervello di topo. Questo metodo permette la preciso studio dell&#39;espressione genica mediante microscopia confocale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="460">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">QIAprep&#174; Miniprep</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:111px;">27104</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Deionized formamide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F9037</td>
			<td style="width:131px;">for ISH blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S3014</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T1503</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">20252.290</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S8282</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">30435</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Yeast tRNA</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">10109495001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">50x Denhardt&#39;s solution</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">750018</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Dextran sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D8906</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Aspa cDNA clone</td>
			<td style="width:111px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:111px;">IRAVp968C0654D</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">SalI</td>
			<td style="width:111px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:111px;">R0138</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S2889</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Equilibrated phenol</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P4557</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Chloroform</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C2432</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:111px;">Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">496200</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">20821.321</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P4074</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Transcription buffer</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P118B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">100mM DTT</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">P117B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">UTP-DIG NTP mix</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11277073910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Rnasin</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">N251B</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6148</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Filter paper</td>
			<td style="width:111px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">005479470</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Sucrose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">59378</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D5758</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Pentobarbitone</td>
			<td style="width:111px;">Animalcare Ltd</td>
			<td style="width:111px;">BN43054</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">15922</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">25 gauge needle</td>
			<td style="width:111px;">Terumo</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:111px;">Cole-Parmer Instrument Co. Ltd</td>
			<td style="width:111px;">WZ-07522-30</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Iris scissors</td>
			<td style="width:111px;">Weiss</td>
			<td style="width:111px;">103227</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">No.2 tweezers</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">500230</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coronal Brain Matrix</td>
			<td style="width:111px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">RBMS-200C</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Razor blade</td>
			<td style="width:111px;">Personna Medical</td>
			<td style="width:111px;">PERS60-0138</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">OCT medium</td>
			<td style="width:111px;">Tissue tek</td>
			<td style="width:111px;">4583</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Cryostat/microtome</td>
			<td style="width:111px;">Bright</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Superfrost plus slides</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:111px;">J1800AMNZ</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S4641</td>
			<td style="width:131px;">for 65&#176;C wash buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Formamide</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">F7503</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Tween-20</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1379</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coverslips</td>
			<td style="width:111px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">631-0146</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Coplin Jar</td>
			<td style="width:111px;">Smith Scientific Ltd</td>
			<td style="width:111px;">2959</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11096176001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Heat-inactivated sheep serum</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S2263</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Hydrophobic pen</td>
			<td style="width:111px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:111px;">DAI-PAP-S</td>
			<td style="width:131px;">1:500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:111px;">&#945;-FITC POD-conjugated antibody</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11426346910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">TSA&#8482; Plus Fluorescein System</td>
			<td style="width:111px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:111px;">NEL741001KT</td>
			<td style="width:131px;">1:1500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">&#945;-DIG AP-conjugated</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11093274910</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">Fast red tablets</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:111px;">11496549001</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:111px;">.22&#181;M filter</td>
			<td style="width:111px;">Millex</td>
			<td style="width:111px;">SLGP033RS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">&#945;-Olig2 Rabbit antbody</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AB9610</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:111px;">Alexa Fluor&#174; 647-conjugated &#945;-rabbit antibody</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">A-31573</td>
			<td style="width:131px;">1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">bisBenzimide H 33258</td>
			<td style="width:111px;">sigma</td>
			<td style="width:111px;">B2883</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:111px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:111px;">S3023</td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:111px;">Leica SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:111px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining double fluorescence in situ hybridization with immunolabelling for detection of the expression of three genes in mouse brain sections

Rilevazione di espressione genica in diversi tipi di cellule cerebrali ad esempio, i neuroni, astrociti, oligodendrociti, precursori degli oligodendrociti e microglia, può essere ostacolato dalla mancanza di specifici anticorpi primari o secondari per immunocolorazione. Qui si descrive un protocollo per rilevare l&#39;espressione di tre diversi geni nella stessa sezione del cervello utilizzando doppia ibridazione in situ fluorescente con due sonde gene-specifici seguiti da immunocolorazione con un anticorpo di alta specificità diretto contro la proteina codificata da un terzo gene. Il gene Aspartoacyclase (ASPA), mutazioni che possono portare a una malattia della sostanza bianca umana rara - malattia di Canavan - è pensato per essere espresso in oligodendrociti e microglia ma non in astrociti e neuroni. Tuttavia, deve ancora essere stabilito il pattern di espressione precisa ASPA nel cervello. Questo protocollo ha permesso di stabilire che ASPA è espresso in un sottogruppo di oligodendrociti maturi unnd può essere generalmente applicata a una vasta gamma di studi pattern di espressione genica.

Questo articolo descrive un metodo per un ISH doppia fluorescenza seguita da immunolabelling in sezioni cervello di topo. Una breve descrizione di questo protocollo è mostrato in Figura 1. Il primo passo è stato quello di sintetizzare sonde specifiche per Aspa e Mbp (proteina basica della mielina). Per controllare che le sonde erano sintetizzati, una piccola aliquota di ciascuna reazione è stata eseguita su gel di agarosio. Il modello lineare debole e una grande quantità di sonda RNA può essere visto (Figura 2). Doppia ISH fluorescenza per Aspa e Mbp, seguita da Olig2 immunolabelling e Hoechst colorazione nucleare, è stata eseguita su sezioni cervello di topo. Abbiamo analizzato il sezioni del cervello in un microscopio confocale e cucito le immagini insieme per rivelare la distribuzione di segnali di espressione genica nel cervello. Espressione Aspa in Mbp -positivo cellule (MBP +) è stato osservato in tutto il reggiseno<html> (Figura 3). Abbiamo anche esaminato l&#39;espressione Aspa in diverse strutture cerebrali con un ingrandimento maggiore. Espressione Aspa in oligodendrociti nella corteccia e corpo calloso sono mostrati in Figura 4. La co-localizzazione Mbp, Olig2 e Aspa indica che Aspa è espresso in un sottoinsieme di oligodendrociti maturi nella corteccia e il corpo calloso (Figura 4). Questi risultati dimostrano che questo protocollo può rilevare simultaneamente l&#39;espressione di tre diversi geni in sezioni di cervello. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig1.jpg" /> Figura 1. Protocollo per Double ibridazione in situ fluorescente Seguito da Immunocolorazione. Questo protocollo viene eseguito in 5 giorni e rileva l&#39;espressione di tre geni./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;esame di Aspa RNA sonda su agarosio gel. Il modello lineare e una grande quantità di RNA sonda di peso molecolare minore può essere osservato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53976/53976fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig3.jpg" /> Figura 3. Doppia fluorescenza in situ ibridazione per Aspa e Mbp nel cervello di topo sezioni. </strong&gt; Sezioni del cervello sono stati scansionati con un microscopio confocale e le immagini sono state cucite insieme per mostrare la distribuzione di Aspa (rosso) e Mbp (verde) nel cervello. Barra di scala:. 500 micron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53976/53976fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53976/53976fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;espressione di Aspa negli oligodendrociti nella corteccia e il corpo calloso. Pannelli mostrano le immagini rappresentative di ISH per Aspa (rosso) e Mbp (verde), seguita da immunocolorazione di Olig2 (blu) in combinazione con Hoechst colorazione. Aspa è stata espressa in un certo Mbp + / + Olig2 cellule nella corteccia (a e B) e nel corpo calloso (C e D). M<html> BP + / Olig2 + / + Aspa cellule sono indicati con le frecce e Mbp + / Olig2 + / Aspa - le cellule sono indicate con frecce nei pannelli allargati (B e D). Barre di scala: 100 micron (A e C); 20 micron (B e D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53976/53976fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Supplementare Figura 1" src="/files/ftp_upload/53976/53976supfig1.jpg" /> Supplementare Figura 1. Sequenza e mappa degli Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1.5kb sequenza cDNA di Aspa stato inserito nel pCMV-Sport6 ​​plasmide (A). La mappa di pCMV-Sport6-Aspa plasmide è mostrata in (B).m / files / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per scaricare il file.

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Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinazione di doppio Fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione con Immunolabelling per il rilevamento della Manifestazione di tre geni nel cervello di topo Sezioni

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

13.0K Views.  University College London. Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Video: Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppia fluorescenza In situ</emIbridazione> nelle sezioni cervello fresco

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Ricerca

Neuroscienze

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Rilevazione di assoni localizzato mRNA nelle sezioni del cervello Utilizzando ad alta risoluzione<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rapido<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell&#39;antenna di Locust da RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Rilevazione dell'espressione del recettore accoppiato alla proteina G nei neuroni afferenti vagali di topo utilizzando l'ibridazione multiplex in situ

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...