Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIAID concessione AI45889 a SAP di citometria a flusso studi sono stati effettuati utilizzando FACS strutture di base supportati dal Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) e Centro per l&#39;AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).

Gli esperimenti sugli animali sono fatte secondo le linee guida approvate dal comitato istituzionale cura e l&#39;uso di animali (IACUC). Tutte le procedure che richiedono la sterilità sono eseguite in un armadio biosicurezza. 1. Impianto di B16.Flt3L melanoma nei topi <ol><li> Culture l&#39;espressione B16 linea cellulare di melanoma Flt-3 in T25 fiasche di coltura tissutale con una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml in terreno DMEM completo con il 10% di CO 2 a 37 ° C. Crescere fino a quando le cellule raggiungono ~ 90% di confluenza (~ 20 ore). </li><li> Raccogliere le cellule dalla tripsina digestione. terreni di coltura delle cellule Aspirare e lavare le cellule aderenti con PBS. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere freddo 20 ml completo DMEM (4 ° C) contenente siero fetale di vitello (FCS) per spegnere la digestione proteasi. Sollevare le cellule off battendo leggermente seguita pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300xg per 10 min a 4 ° C. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore vitalità cellulare automatizzata. Risospendere ad una densità di 10 8 cellule / ml in PBS. </li><li> Topi Implant (C57BL / 6 o altro ceppo istocompatibili) con cellule tumorali per via sottocutanea come descritto da Machholz et al. 19 alla base del collo con 100 ml di sospensione cellulare (10 7 cellule). </li><li> Lasciare che il tumore di crescere fino palpabili o visibili (2 - 10 mm di diametro, solitamente 7 - 12 giorni) prima di sacrificare animali per l&#39;espianto di organi. </li></ol> 2. Preparazione di splenica cellulare Sospensione Singola da tumore Bearing Mice <ol><li> Anestetizzare i topi con una dose eccessiva di isoflurano (regolare flusso di isoflurano a&gt; 5% e continuare l&#39;esposizione di almeno 2 minuti dopo smette di respirare). Sacrificare il melanoma tumore del mouse Flt-3 cuscinetti da dislocazione cervicale secondo le linee guida istituzionali per l&#39;eutanasia. </li><li> disinfect la pelle con il 70% di etanolo e la raccolta della milza con tecnica asettica con l&#39;ausilio di forbici sterili 20. </li><li> Posizionare la milza in una piastra di Petri sterile per il trasporto al cabinet biosicurezza. Eseguire tutti i passi da qui in condizioni sterili. </li><li> Trasferimento milza per un piatto fresco di Petri e lavare con RPMI. Tagliare la milza in piccoli pezzi (~ 0,2 centimetri 2) utilizzando un bisturi. Incubare per 30 minuti a 37 ° C con 10 ml di soluzione di collagenasi / DNasi. </li><li> Versare la sospensione parzialmente digerito del tessuto della milza su un colino cella di 70 micron. Comprimere i frammenti di tessuto rimanenti attraverso le maglie del filtro utilizzando una siringa da 5 ml stantuffo. </li><li> Lavare il filtro a rete con 10 ml di mezzo fresco e gettare il filtro. Centrifugare la sospensione a 300 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare le cellule. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di lisi RBC. Incubare a RT Fo 10 min. Placare il tampone di lisi RBC con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno completo RPMI. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere in volume adeguato per raggiungere densità cellulare di 10 8 cellule / ml nella cella di smistamento tampone (ad esempio, MACS) contenente 20 mg / ml di anticorpi Fc-blocco (2.4G2). </li></ol> 3. Purificazione di plasmacitoidi DC, CD8α Pos DC e CD8α Neg DC da milza cellulare Sospensione Singola Nota: Isolamento dei sottoinsiemi DC spleniche di sospensione singola cellula è una procedura multi-step come illustrato in figura 1 eseguire tutte le fasi utilizzando tampone pre-raffreddato e un bagno di acqua ghiacciata per mantenere la temperatura a 4 - 8 ° C.. Tutti i volumi di reagenti nella sezione seguente del protocollo sono calcolati per un ingresso iniziale di 200 ml di sospensione cellulare della milza a 10 8 cellule / ml). Questo può essere scalata verso l&#39;alto ogiù in base alle proprie esigenze modificando il volume di sospensione cellulare (sempre ad una densità di 1 x 10 8 cellule / ml) e altri reagenti proporzionalmente nella fase iniziale (3.1.1 e 3.2.1). Regolare i volumi di reagenti in tutte le fasi successive di conseguenza. Ad esempio, se si parte con 100 ml di sospensione cellulare splenica a 1 x 10 8 / ml, utilizzare metà dei volumi di reagente indicati in tutti i passaggi. <ol><li> L&#39;isolamento di plasmacitoidi DC (PDC) <ol><li> Aggiungere 300 ml di cocktail di anticorpi biotina marcata con fornito nel plasmacitoidi Kit di isolamento DC a 200 ml di sospensione cellulare della milza. </li><li> Mescolare accuratamente e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo ogni 3 minuti per mantenere le cellule in sospensione, e per massimizzare legame dell&#39;anticorpo. </li><li> Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante per rimuovere gli anticorpi biotinilati non legati. </li><li> Risospendere cellapellet in 500 ml di buffer di ordinamento delle cellule. Aggiungere 300 ml di anti-biotina perline anticorpo-coniugato. Ripetere il passaggio 3.1.2 e 3.1.3. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Eseguire tutti i passaggi da questo punto in poi a temperatura ambiente usando tamponi pre-raffreddato. </li><li> Posizionare una nuova cella di attivazione magnetico ordinamento colonna LS nel supporto magnetico. Lavare ed equilibrare colonna con 5 ml di tampone di ordinamento delle cellule. </li><li> Pipetta la sospensione cellulare in colonna, applicando delicatamente al centro della superficie del letto della colonna. Raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Lavare la colonna con 10 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Raccogliere questo flusso attraverso e si combinano con il flusso attraverso dal punto 3.1.7. PDC sono arricchiti in questo flusso della colonna attraverso (FT1). </li><li> Agglomerare le cellule da FT1 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, risospendere in 2 ml di cellule tampone di smistamento e passare le cellule attraverso una colonna LS frescaripetendo i punti 3.1.6 - 3.1.8. Questo uso di due colonne sequenziali produce una maggiore purezza delle cellule isolate. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 2 ml di RPMI completo. Mettere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Isolamento di CD8α Pos e CD8α Neg DC Nota: Il primo passo in questa procedura è la deplezione delle cellule B, PDC, T e NK. <ol><li> A partire con tutta la sospensione di cellule della milza (1 ml di 10 8 cellule / ml ottenuti nella fase 2.8), aggiungere 100 ml di cocktail di anticorpi biotina coniugato fornito nel kit di isolamento CD8α Pos DC. </li><li> Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo delicatamente ogni 3 min per massimizzare il legame degli anticorpi biotina marcata con le loro cellule bersaglio. </li><li> Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare eccellentenatant per rimuovere gli anticorpi biotinilati legati. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di smistamento delle cellule e 100 ml di perline anti-biotina forniti nel kit di isolamento CD8α Pos DC. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml di cellule di smistamento tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 ml di cellule e passare sopra una colonna LS fresco in base alla procedura dei passi 3.1.6 tramite 3.1.8. </li><li> Raccogliere il flusso senza etichetta attraverso 2 (FT2) ed eliminare il retentato colonna. Questa frazione senza etichetta si arricchisce per CD8α Pos e CD8α Neg DC. </li><li> Agglomerare le cellule in FT2 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 cella ml e aggiungere 200 ml di-CD8α anti-sfere magnetiche coniugate forniti nel kit di isolamento CD8α Pos DC. </li><li> rappresentantemangiare passi 3.2.2 tramite 3.2.6. Il flusso attraverso la colonna si arricchisce per CD8α Neg DC e impoverito per CD8α Pos DC. Questo è etichettato flusso attraverso 3 (FT3). </li><li> Per eluire il CD8α Pos PVS trattenuto in colonna, rimuovere la colonna dal magnete, aggiungere 5 ml di tampone di smistamento cellulare e spurgare la matrice colonna utilizzando lo stantuffo fornito con la colonna LS. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere in tampone di smistamento 1 ml di cellule. Per aumentare la purezza, eseguire le cellule eluiti nuovo attraverso una colonna LS fresca ripetendo i punti da 3.1.6 a 3.1.8, ad eccezione di scartare il flusso attraverso e raccogliere le cellule conservate come in 3.2.11. </li><li> Per purificare il CD8α Neg DC dalla sospensione FT3, pellet la FT3 mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere in 300 microlitri di tampone di ordinamento delle cellule. </li><li> Aggiungere 100 ml di anti-CD11c MAGperline tiche. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. </li><li> Aggiungere smistamento cellule tampone e pellet 10 ml di cellule mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Ripetere i passaggi 3.1.5 tramite 3.1.8. Il CD8α Neg DC vengono selezionati positivamente con perline CD11c e sono legato alla colonna. Il flusso attraverso può essere scartato. </li><li> Eluire le cellule conservate nella colonna come descritto al punto 3.2.11 per raccogliere il purificato CD8α Neg DC. </li></ol></li></ol> 4. Pulsing APC con gli antigeni e trasferimento di cellule <ol><li> Contare le cellule vive dopo la purificazione mediante trypan esclusione blu da 21 a distinguere le cellule vive e morte. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;antigene di scelta. Utilizzare analoghi di antigene glycolipid chiamato alfa-galactosyl ceramide (αGalCer) a 100 concentrazioni nM 13. In genere, la piastra 10 6 cellule vitali / bene in mezzo completo RPMI con ultra-low Attachment U-bottom piastre da 96 pozzetti per ridurre al minimo l&#39;adesione cellulare. Incubare le cellule in CO 2 atmosphere 5% a 37 ° C per 1 - 4 hr. </li><li> Celle di raccolta pipettando delicatamente diverse volte. Utilizzare ampi suggerimenti foro pipette per ridurre al minimo i danni cellulari da forze di taglio. Lavare i pozzetti con PBS e in comune questi lavaggi per massimizzare la raccolta delle cellule. </li><li> Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere alla densità desiderata in PBS. In genere, iniettare 1 milione di cellule in 200 microlitri per destinatario degli animali. Mantenere le cellule in ghiaccio per massimizzare la redditività prima della somministrazione in animali ospiti. </li><li> Iniettare cellule per via endovenosa in topi sia attraverso il vano coda laterale o il plesso venoso retro-orbitale 19. Utilizzare un ago G 27 su una siringa da 1 ml e iniettare un volume massimo di 0,1 ml per topo. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Le cellule dendritiche sono accettati per essere il principale antigene professionale, presentando le cellule coinvolte nella adescamento di risposte delle cellule T. La loro funzione principale è quella di rilevare il microambiente del tessuto riprendendo e l&#39;elaborazione di antigeni per la presentazione di cellule T. Al fine di studiare la funzione di specifiche sottopopolazioni DC, questi devono essere isolati in numero sufficiente usando un approccio che mantiene loro normale fenotipo e funzioni. La maggior parte dei protocolli si basano su l&#39;isolamento di specifica sottoinsieme CC da topi naive. Poiché queste cellule sono rari, le procedure di isolamento non sono efficienti e producono un basso numero di cellule. Ad esempio, una milza produrrà solo circa 0,5 - 1 milioni DC CD8 pos, mentre maggior parte degli esperimenti effettuati con studi trasferimento utilizzano almeno questo numero di cellule per animale. Pertanto, un importante limitazione dei metodi esistenti è l&#39;incapacità di isolare il numero di cellule sufficiente senza utilizzare un gran numero di topi donatori e notevoli volumidei reagenti. Il nostro metodo supera sostanzialmente questi problemi utilizzando topi impiantati con un tumore secernente Flt-3L per espandere notevolmente PVS, permettendo purificazione numero molto maggiore dei tre ben riconosciuto sottoinsieme DC utilizzando una serie di fasi di purificazione immunomagnetiche. Il protocollo qui descritto prevede quindi un grande miglioramento rispetto metodi esistenti in termini di rese di almeno diverse volte. Esistono Qualche distinguo per il protocollo di isolamento qui descritto. La limitazione principale è che la procedura utilizzata per isolare queste cellule potrebbero inavvertitamente modificare il loro fenotipo. DC sono squisitamente sensibili alla contaminazione endotossine e stimoli meccanici che possono portare a cambiamenti nella loro fenotipo e funzione. Un altro limite di questa tecnica è la dipendenza Flt-3L secrezione per espandere sottoinsiemi DC. Il risultato è la mancanza di espansione nel tessuto residenti sottoinsiemi DC che non esprimono il recettore Flt-3. Ilprotocollo qui descritto si basa su arricchimento cellulare utilizzando reagenti commercialmente disponibili. Il kit per l&#39;isolamento di purificazione cellulare dotato di un protocollo che contiene i volumi consigliati di reagenti da utilizzare. La composizione delle cellule del tumore cuscinetto topi è totalmente diverso da quello di topi naive (Figura 2C), e quindi abbiamo modificato i valori per i reagenti utilizzati nella nostra tecnica per ottenere la purezza cellulare ottimale. Le cellule dendritiche sono cellule aderenti e possono allegare alla matrice colonna non specifico. Equilibrazione del letto colonna con tampone contenente EDTA minimizza l&#39;adesione cellulare, e l&#39;uso di passaggio seriale su due colonne consecutive migliora ulteriormente la purezza delle cellule. Dendritiche sono cellule altamente aderenti e in vivo sono generalmente strettamente associata alla matrice di tessuto extracellulare. Per aumentare la resa, è molto importante per digerire il tessuto splenico con collagenasi e DNasi una sufficiente time per estrarre un numero massimo di queste cellule. E &#39;anche importante assicurarsi che i frammenti di tessuto splenici sono completamente immersi nella soluzione di collagenasi / DNasi I, mentre in fase di digestione. Un&#39;altra caratteristica fondamentale di isolamento DC è quello di mantenere la massima sterilità e condizioni di assenza di endotossine nel corso della procedura di isolamento, dal momento che queste cellule sono altamente reattivo endotossine. Utilizzare i reagenti appena preparati dalle scorte senza endotossine, e filtro sterilizzare tutti i reagenti prima dell&#39;uso. Tutti i buffer di isolamento delle cellule e dei media dovrebbero essere integrati con FCS che è certificato per essere liberi di endotossina rilevabile. Queste cellule sono anche molto sensibili agli stimoli meccanici e ripetuta stimolazione meccanica può alterare lo stato di maturazione di queste cellule. Anche se è necessaria una certa forza meccanica per forzare il tessuto attraverso un colino cella dopo collagenasi digestione, questo dovrebbe essere fatto il più delicatamente possibile. Inoltre, vigorosa pipettaggio delle cellule dovrebbe essere evitato il più possible, e larga pipetta foro punte dovrebbero essere utilizzati per ridurre al minimo le forze di taglio. Il modello di trasferimento adottivo è utile per le indagini di presentazione dell&#39;antigene e priming delle cellule T da specifici sottoinsiemi di cellule dendritiche. Tuttavia, è stato dimostrato in altri studi che trasferiscono di antigene possono verificarsi da antigene pulsato DC a DC endogene. Quindi, la risposta immunitaria adattativa istigata dalle cellule antigene pulsata può riflettere presentazione da DC endogene che presentano l&#39;antigene &quot;catturati&quot; e non quello di trasferire APC. Questo tipo di trasferimento è esponenzialmente aumentata se gli isolati preparati DC contengono le cellule morte o morenti. È quindi importante effettuare l&#39;isolamento e trasferimento protocollo CC più rapidamente possibile, utilizzando condizioni sterili con buffer pre-raffreddata a migliorare la sopravvivenza cellulare. Abbiamo scelto un periodo relativamente breve antigene pulsazione di 4 ore per questo motivo, con incubazione in piastre di coltura cellulare a basso legame di minimizzare l&#39;adesione cellulare durantequesto passaggio. Inoltre, esteso condizione cultura può alterare lo stato di maturazione delle DC in coltura, e può influenzare l&#39;esito degli esperimenti trasferimento adottivo 22. In sintesi, la biologia delle cellule dendritiche è una zona molto attiva di ricerca, e lo sviluppo di un metodo affidabile per generare cellule dendritiche che rispecchiano fedelmente il loro fenotipica in vivo e divergenza funzionale fornisce un&#39;immensa opportunità di studiare queste cellule. Questo diventa particolarmente importante per gli studi che coinvolgono sostanze chimiche che possono modulare le funzioni di DC, ma non possono essere somministrati per via sistemica in modelli animali. Trattare gli isolati sottoinsiemi DC di interesse ex vivo con queste sostanze è un approccio pratico e fattibile che può aiutare a chiarire i dettagli meccanicistici di percorsi di presentazione dell&#39;antigene.

Le cellule dendritiche (DC) sono stati scoperti quasi quarant&#39;anni fa come il &quot;grande stellate (dendron greco) cella&quot; trovata negli organi linfoidi 1. Molti studi hanno dimostrato che le cellule dendritiche sono le uniche cellule che presentano l&#39;antigene in grado di stimolare efficacemente le cellule T naive 2. Una delle principali funzioni di queste cellule è l&#39;assorbimento e la presentazione di antigeni e la loro elaborazione efficiente e carico di questi su molecole presentanti l&#39;antigene. In milza del mouse, DC può essere separato in plasmacitoidi e sottoinsiemi convenzionali. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono caratterizzati da una bassa espressione di CD11c e alti livelli di B220 e Gr-1. Essi sono anche positivo per il marcatore mPDCA1 superficie ed interferone di tipo I in risposta a pedaggio like receptor 9 (TLR9) ligandi secernono. I DC convenzionali sono alti per CD11c e MHC di classe II espressione. Essi possono essere suddivisi in tre sottogruppi distinti in base alla superficie espressione di marcatori fenotipici quali CD4, CD8α, DEC205, CD11b e delle cellule dendritiche del recettore inibitorio 2 (DCIR2, riconosciuto dal anticorpo 33D1) proteine ​​3,4. I CD8α Pos DC sono noti anche come CDC1, sono positivi per DEC205, ma negativo per i marcatori mieloidi, come CD11b e 33D1. Il CD8α Neg DC, chiamato anche CDC2, sono positivi per 33D1, CD11b e CD4, ma mancano DEC205. Il sottoinsieme negativo doppio (vale a dire, negativo sia per CD4 e CD8α) è relativamente rara, ed è negativo per DEC205 e 33D1. È il sottoinsieme almeno caratterizzati e può essere una forma meno differenziata di CD8α Neg DC. Differenze fenotipiche nei diversi sottoinsiemi DC estendono anche alle loro funzioni in vivo. Il CD8α Neg DC sono altamente fagocitosi e si pensa di presentare l&#39;antigene esogeno principalmente attraverso MHC di classe II a cellule T CD4 3. Al contrario, i CD8α Pos DC sono specializzati per la presentazione dell&#39;antigene proteina solubile in MHC di classe Iin un meccanismo chiamato cross-presentazione. Il risultato di cross-presentazione dipende dallo stato di attivazione di queste cellule dendritiche 5, e può sia portare alla espansione delle cellule T citotossiche (CTL) o lo sviluppo di cellule T regolatorie 6 2,7. Targeting di antigene di CD8α Pos DC utilizzando i risultati di consegna anti-DEC205-mediata da anticorpi in gran parte nella eliminazione delle cellule T 8, mentre la presentazione di antigeni derivati ​​da cellule apoptotiche infettate induce una forte risposta CTL 9. Oltre al riconoscimento di antigeni peptidici, il sistema immunitario dei mammiferi è evoluto per riconoscere lipidico e antigeni glicolipidi. Questi antigeni sono presentati da molecole CD1, che sono MHC di classe proteine ​​di superficie cellulare i-like che esistono in molteplici forme legate in vari mammiferi. Nei topi, un unico tipo di molecola altamente conservata CD1 chiamato CD1d è responsabile per la presentazione di antigeni glicolipidi 10. Il sindaco<html> popolazione di cellule T che riconoscono CD1d / complessi glicolipidici è chiamato cellule NKT invarianti (cellule iNKT). Queste cellule esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T (TCR) composto da una catena TCRα invariante che è associato con catene TCRβ che hanno limitato la diversità 11. A differenza delle cellule T convenzionali che hanno bisogno di proliferare e differenziarsi per diventare cellule T effettrici attivate, le cellule iNKT esistono come una popolazione effettrici e iniziano a reagire rapidamente dopo la somministrazione glycolipid 12. L&#39;identificazione di cellule che presentano l&#39;antigene fisiologicamente rilevanti dei lipidi è un&#39;area attiva di ricerca, e di diversi tipi di cellule distinte, come B cellule, i macrofagi e le cellule dendritiche sono state proposte per svolgere questa funzione. Tuttavia, è stato dimostrato che il sottoinsieme CD8α Pos delle DC è la cellula primaria mediazione captazione e presentazione di antigeni lipidici alle cellule del mouse iNKT 13 e glycolipid mediata cross-priming di cellule T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Per confrontare l&#39;efficienza di presentazione dell&#39;antigene da diverse cellule presentanti l&#39;antigene, un approccio semplice è quello di trasferire diversi tipi di APC purificate pulsate con quantità equivalenti di antigene in host naive. esperimenti di trasferimento cellulare di questo tipo sono spesso eseguite per studi immunologici. Tuttavia, l&#39;esecuzione di studi trasferimento con ex vivo antigene trattata DC è impegnativo, poiché queste cellule esistono popolazioni come rare in organi linfoidi in cui costituiscono meno del 2% delle cellule totali 15. è pertanto necessario migliorare lo sviluppo di queste cellule in animali donatori per aumentare l&#39;efficienza di protocolli di isolamento. E &#39;noto che il linfoide comune e progenitori mieloidi comuni, che sono necessari per la generazione di PDC CD8 Pos e sottoinsiemi CD8 Neg DC, fms legati espresso recettore tirosin-chinasi 3 (Flt-3). Al momento in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) amministrazione, emigratione di Flt-3 che esprimono cellule progenitrici del midollo osseo è aumentato, con conseguente aumento della semina organi linfoidi periferici e l&#39;espansione della loro progenie matura DC 16. L&#39;espressione di Flt-3 è perso durante impegno per la B, i percorsi di differenziazione delle cellule T o NK. Pertanto, solo alterazioni minime sono osservati in queste cellule con la somministrazione Flt-3L. Espansione simile nelle popolazioni DC è osservata in topi portatori di tumori generati da impianto di una linea di cellule di melanoma B16-secernenti murino Flt-3L, che fornisce un metodo semplice ed economico per fornire livelli sistemici sostenuti di Flt-3L 17,18. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato un protocollo basato su l&#39;impianto di cellule B16-melanoma secernenti Flt-3L per stimolare l&#39;espansione di tutte le normali sottoinsiemi DC nella milza del mouse, quindi aumentando notevolmente le rese di queste cellule che possono essere isolate per esperimenti successivi . Abbiamo costantemente troviamo che entro 10 - 14 giorni dopo im sottocutaneopiantagione del tumore secernente Flt-3, i topi sviluppano splenomegalia con marcata arricchimento delle DC per costituire 40 - 60% delle cellule totali milza. Da queste milza, diversi sottoinsiemi DC possono essere isolati con elevata purezza utilizzando standard di kit di purificazione delle cellule disponibili in commercio che utilizzano marcatori fenotipici specifici sottoinsieme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (dry powder)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9-6705-004-220</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11130-051&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (dry powder)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146-5G&#160;</td>
			<td>Prepare 0.08% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-152-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;Pos mouse DC isolation kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c-FITC&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945;-PerCP&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220-PE&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>26048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G1 needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri plates&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand MACS separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore 200 &#956;l pipette tips&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>111623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Jackson Research Laboratories, Jax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described by Mach et al. ,2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free DMEM and RPMI media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 
			 
			5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml HEPES Buffer (1 M)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml L-glutamine (200 mM)&#160; 
			 
			0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.&#160; Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &#181;m vacuum filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI and DMEM media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase D and DNase 1 stock solution 
			Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 Units of collagenase activity per ml 
			 
			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &#176;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule professionali presentanti l&#39;antigene principalmente responsabili per l&#39;acquisizione, l&#39;elaborazione e la presentazione di antigeni sulla presentanti l&#39;antigene molecole di avviare l&#39;immunità T-cellulo-mediata. Le cellule dendritiche possono essere separati in diversi sottoinsiemi fenotipico e funzionalmente eterogenee. Tre sottogruppi importanti delle cellule dendritiche della milza sono plasmacitoidi, cellule CD8α Pos e CD8α Neg. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono produttori naturali di interferone di tipo I e sono importanti per l&#39;anti-virale immunità cellulo T. Il sottoinsieme CD8α Neg DC è specializzata per MHC di classe II presentazione dell&#39;antigene ed è coinvolto nel centro di adescamento cellule T CD4. Il CD8α Pos DC sono i principali responsabili per la cross-presentazione di antigeni esogeni e priming delle cellule T CD8. I CD8α Pos DC hanno dimostrato di essere più efficace in occasione della presentazione degli antigeni glicolipidici da molecole CD1d ad un cel T specializzataL popolazione noto come T (iNKT), le cellule natural killer invarianti. La somministrazione di Flt-3 ligando aumenta la frequenza della migrazione dei progenitori delle cellule dendritiche dal midollo osseo, in ultima analisi, con conseguente espansione delle cellule dendritiche in organi linfoidi periferici in modelli murini. Abbiamo adattato questo modello per purificare un gran numero di cellule dendritiche funzionali per l&#39;utilizzo in esperimenti di trasferimento di cellule per confrontare competenza in vivo di diversi sottoinsiemi DC.

L&#39;esito di questa procedura si basa sull&#39;espansione di sottoinsiemi DC da murino Flt-3L espressa dalle cellule di melanoma impiantati. Il tumore B16.Flt3L è stato derivato da un C57BL / 6 del mouse, e dovrebbe essere impiantato in animali con quello sfondo sforzo al fine di evitare il fallimento del tumore per stabilirsi a causa di rifiuto. In alcuni casi, può essere desiderabile utilizzare topi geneticamente modificati per derivare DC con difetti noti vie di segnalazione o recettori di interesse. È importante tenere presente che il tumore può svilupparsi con differenti cinetiche in tali animali, quindi è importante controllare la crescita tumorale basato su aspetto e la palpazione al sito di inoculazione. Nella nostra esperienza, una volta che il tumore è palpabile, il tumore B16.Flt3L cuscinetto topi dimostrano costantemente un marcato aumento della cellularità milza che correla con l&#39;espansione di tutti i sottoinsiemi DC (Figura 2A). Noi di solito vedere un 2 a 3 volte increase del numero di splenociti totali ottenuti da topi di melanoma fruttiferi B16.Flt3L rispetto agli animali ingenuo. L&#39;aumento del numero di DC in parte contribuisce alla apparente riduzione della frequenza delle cellule B, mentre non vi è poco o nessun cambiamento nel numero assoluto di linfociti B. È interessante notare che, mentre una grande espansione (~ 15 ei aumento di 20 volte nel numero assoluto) viene osservato per DC convenzionali in questi topi, c&#39;è solo un modesto aumento (circa 4 volte) osservato nel plasmacitoidi sottoinsieme DC. La strategia di gating per identificare diversi sottoinsiemi DC è mostrato in Figura 2A e si basa sull&#39;espressione di B220, CD11b, CD11c e CD8α come marcatori fenotipici specifici sottoinsieme (Figura 2B). Abbiamo anche studiato DEC205, CD11b ed espressione mPDCA1 su questi sottoinsiemi come mostrato nella Figura 2B. Questo mostra lo schema previsto, con mPDCA solo sul sottoinsieme PDC mentre dicembre<html> 205 si esprime fortemente sulla CD8α Pos DC e CD11b viene rilevato più prominente sul CD8α Neg DC. Abbiamo anche analizzato le alterazioni frequenze di cella per ciascuno dei sottoinsiemi purificate ad ogni passo del protocollo qui descritto (riassunto nella Figura 2C, con esempi dettagliati dei dati di citometria di flusso della figura 3). L&#39;isolamento dei sottoinsiemi DC spleniche descritte in questo metodo è una procedura multi-step (figura 1). Purificazione di cellule dendritiche plasmacitoidi si basa sulla selezione negativa per arricchire queste cellule dopo l&#39;esaurimento di tutte le popolazioni indesiderate come B, T, cellule NK e DC convenzionali. Purificazione della CD8α Pos DC, e CD8α Neg DC è eseguita da selezione positiva di queste cellule dopo l&#39;esaurimento delle cellule T, B e NK. L&#39;elevata purezza di ciascuno dei sottoinsiemi DC ottenuta utilizzando questa procedura (tipicamente ~ 95%) è illustrato anche nella figura 3. ve_content. &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; A seconda degli esperimenti da eseguire, queste cellule possono essere pulsati con un antigene desiderato e trasferiti in istocompatibili host murini per Studi immunologici Inoltre, queste cellule possono anche essere utilizzati per studi in vivo di attività di stimolo e regolamentari di sottoinsiemi DC fisiologici. i rendimenti delle celle per i purificati sottoinsiemi DC a 2 x 10 7 splenociti totali sono circa un milione di pDCs, 2 milioni CD8α Pos DC e 4 milioni CD8α Neg DC. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53824/53824fig1.jpg" /> Figura 1. Isolamento delle cellule dendritiche. Uno schema che illustra le varie fasi del protocollo per l&#39;isolamento di diversi sottoinsiemi di cellule dendritiche. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53824/53824fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </a<html> &gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53824/53824fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi di splenici DC sottoinsiemi nei topi con tumori B16.Flt3L. A) strategia di gating è illustrata per individuare le popolazioni di cellule corrispondenti a pDCs (R1), CD8α Pos DC (R5) e CD8α Neg DC (R6). B) Espressione di mPDCA1, 33D1, DEC205 e CD11b su diversi sottoinsiemi. Le cellule contenute nel cancello R4 (un sottoinsieme di linfociti, negativi per la B220, CD11c, CD11b) sono utilizzati come una popolazione di controllo manca l&#39;espressione di questi marcatori C) arricchimento relativo di DC e sottopopolazioni linfocitarie isolati da la milza di topi a giorno. 14 dopo l&#39;inoculazione delle cellule di melanoma B16.Flt3L è mostrato nella trama sinistra come barre nere, mentre la frequenza di queste popolazioni di cellule in topi naive è mostrata come barre bianche. La trama destra visualizza gli stessi dati come il numero di cellule.https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53824/53824fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi delle splenici DC sottoinsiemi Durante arricchimento protocollo. A) l&#39;arricchimento di cellule dendritiche plasmacitoidi (B220 High e CD11c Bassi, R1) dal 10% della popolazione di partenza di splenociti da B16.Flt3L tumore cuscinetto topi al ~ 95% di purezza nella colonna fluire attraverso 1. Si noti che le cellule retentato eluiti da questa colonna sono esauriti di questa popolazione. B) arricchimento delle DC convenzionali (in CD11c alta, misto di CD8α positivo e negativo) da ~ 33% la milza di B16.Flt3L melanoma-cuscinetto topi il giorno 10 dopo l&#39;impianto del tumore al ~ 78% in il flusso attraverso 2 frazione. Nella colonna retentato 2 terreni, le popolazioni positive CD11c sembrano essere partially impoverito, corrispondente alla rimozione di un numero considerevole di DC durante selezione negativa deplezione delle cellule T, B e NK. Ulteriore frazionamento del flusso attraverso 2 sospensione con selezione positiva per anti-CD8 rese vincolanti&gt; 95% di purezza del CD8α Pos DC. Il flusso attraverso di questo è stato poi sottoposto a selezione positiva per il legame di anti-CD11c, producendo una popolazione di&gt; 95% puro CD8α Neg DC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53824/53824fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K Views.  Albert Einstein College of Medicine. Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Video: An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

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Immunologia e infezioni

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Purificazione di<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiti Per l&#39;uso in opsonizzante anticorpo saggi

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l'isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

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Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Isolamento di cellule polmonari mouse dendritiche

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall'intestino mouse

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

High Yield Purificazione di

Mouse Naïve CD4

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo