This study is supported by a grant from Comunidad de Madrid (S2010/BMD-2326, Inmunothercan-CM), by Fundacio La Marato de TV3 (70/C/2012) and by and by Spanish Economy Ministry (MAT2013-47303 P).

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare 1 mM HEPES Buffer sciogliendo 23,8 mg di HEPES in 100 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 7. </li><li> Preparare 10% NaHSO 3 sciogliendo 10 g di NaHSO 3 in 100 ml di acqua distillata. Mescolare la miscela per 15 min. </li><li> Preparare la soluzione NaOH sciogliendo 1 g di NaOH in 100 ml di acqua. Agitare per 10 min. </li><li> Preparare 10 mM tampone fosfato sciogliendo 600 mg di NaH 2 PO 4 in 1 L di acqua. Aggiungere attentamente 0,34 ml di acido fosforico e mescolare per 30 min. Regolare il pH a 2,9 (intervallo di accettabilità 2,7-3,0). </li><li> Preparare 10 mM tampone fosfato sciogliendo 269 mg di NaH 2 PO 4 e 1,09 g di Na 2 HPO 4 all&#39;acqua distillata per ottenere un volume di 1 L. Regolare il pH a 7,2. </li></ol> 2. Sintesi di acido oleico rivestiti nanoparticelle (OA-IONP) <ol><li> In un pallone adattato microonde aggiungere 0,5 g di Fe (acac) 3, 1.4 ml di oleiacido c, 0,6 ml di oleilammina e 1,19 g di 1,2-hexadodecanediol. Aggiungere 10 ml di fenil etere con attenzione attraverso la parete pallone con una pipetta graduata. </li><li> Introdurre la muffola nel reattore a microonde e avviare il protocollo forno a microonde. NOTA: software Microwave consente di scegliere l&#39;entità di diversi parametri come temperatura, pressione, velocità di agitazione, potenza e tempo di reazione. Inoltre, ha la possibilità di caricare tre diverse fasi nella stessa protocollo che permette la sintesi sintonizzabile. Una volta che il protocollo sintetica caricata inizia, microonde riscalda il campione più velocemente possibile (processo rampa) e mantiene durante il tempo di reazione prescelta (processo in esecuzione). Elezione del potere determina il tempo di rampa. </li><li> Caricare un studio dinamico nel forno a microonde. Il protocollo contiene tre fasi: <ol><li> Fase 1: impostare la temperatura a 60 ° C, 2 min, pressione 250 psi e 150 W di potenza. Mescolare la velocità deve essere in posizione alta e massima potenza in su. </li><li> Cervoe 2: impostare la temperatura a 200 ° C, tempo di 20 min, pressione 250 psi e 300 W di potenza. Mescolare la velocità deve essere in posizione alta e massima potenza in su. </li><li> Fase 3: impostare la temperatura a 250 ° C, tempo di 10 min, pressione 250 psi e 300 W di potenza. Mescolare la velocità deve essere in posizione alta e massima potenza in su. </li></ol></li><li> Dopo aver terminato il protocollo, permettono raffreddare il pallone a temperatura ambiente. NOTA: Raffreddamento processo può essere fatto con o senza flusso di gas. Entrambi i casi forniscono stessi risultati. Aggregati appaiono nella ancoretta e nella parete del pallone, lavare con EtOH e metterlo sul Erlenmeyer. </li><li> Trasferire la miscela di reazione a una beuta con una pipetta di vetro e aggiungere 10 ml di EtOH 98%. Mettere un magnete Nd-Nb-B sotto la beuta, attendere 5 minuti e rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro. </li><li> Aggiungere 10 ml di EtOH, sonicare il campione a temperatura ambiente per 2 min e 40 kHz, mettere il campione sul magnete ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passo alla LEAt tre volte. </li><li> Disperse nanoparticelle oleico in 30 ml di CHCl 3 e ultrasuoni a 40 kHz per 5 minuti a temperatura ambiente. Verificare la dimensione idrodinamica nel Zetasizer secondo le istruzioni del produttore. Mettere 0,5 ml di OA-IONP nella cuvetta di vetro e aggiungere 0,5 ml di CHCl 3. intervallo di accettabilità 7-10 nm espressa come dimensione Z-media intensità. NOTA: OA-IONP può essere ben disperso in esano. </li></ol> 3. Sintesi di azelaico Acido nanoparticelle (Azelaic Acid-IONP) <ol><li> Disciogliere 44,3 mg di KMnO 4 e 150,4 mg di BTACl in una miscela di H 2 O: CHCl 3 (3: 2 ml). Aggiungere la soluzione risultante ad un&#39;aliquota di 5 ml di OA-IONP nel microonde adattato matraccio. </li><li> Avviare il protocollo microonde per azelaico acidi IONP. Impostare temperatura a 105 ° C, tempo di 9 min, pressione 250 psi e potenza a 300 W. Mettere 10 ml di tampone fosfato pH = 2.9 nel pallone e ripetere il protocollo microonde. Dopo fase di raffreddamento, recuperare le nanoparticelleutilizzando un magnete ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 5 ml di 10% NaHSO 3 a una beuta, ultrasuoni a 40 kHz per 2 minuti a 25 ° C, raccogliere le particelle utilizzando un magnete ed eliminare il surnatante. (Il passo viene ripetuto 2 volte). Lavare le nanoparticelle altre tre volte con 1% NaOH ed infine nuovamente disperdere in 5 ml di tampone fosfato pH = 7.2. </li><li> Verificare la dimensione idrodinamica e potenziale zeta. Mettere 0,7 ml di azelaico-IONP nella cella capillare piegato usa e getta e inserirla sul Zetasizer. NOTA: intervallo di accettabilità per dimensioni 25-35 nm espressa come dimensione Z-media intensità. intervallo di accettabilità per Z-Potenziale -45 ± 5 mV. nanoparticelle maggiore (~ 70 nm) possono essere ottenuti con tampone fosfato pH&gt; 7 invece pH = 2,9 (ref Chem Eur J 2008). </li></ol> 4. Sintesi di neridronato nanoparticelle (neridronato-IONP) <ol><li> Aggiungere 12 mg di EDC e 15 mg di solfo-NHS in una centrifuga con 2 ml aliquota di azelaico-IONP. Metterela miscela in un vortice a temperatura ambiente per 35 min. </li><li> Mettere un magnete sotto la centrifuga di destabilizzare le nanoparticelle, aspirare il surnatante e lavare le particelle con 1,5 ml di HEPES 1 mM pH = 7 buffer. (Ripetere questo passaggio due volte.) In seguito, aggiungere 5 mg di neridronato e agitare il composto in un vortice per 2 ore. </li><li> nanoparticelle separate con un magnete e di lavaggio (3 x 2 ml) con 1 mM HEPES pH = 7 tampone. Infine, disperdere neridronato-IONP in 2 ml di 1 mM HEPES pH = 7 buffer. </li><li> Verificare la dimensione idrodinamica e potenziale zeta. Mettere 0,7 ml di neridronato-IONP nella cella capillare piegato usa e getta e inserirla sul Zetasizer (vedi l&#39;installazione attrezzature). NOTA: intervallo di accettabilità per dimensioni 40-45 nm espressa come dimensione Z-media intensità. intervallo di accettabilità per Z-Potenziale -20 ± 5 mV. </li></ol> 5. In Vivo Rilevazione di Ateroma placca in ApoE - / - mice by MRI <ol><li> La preparazione per la risonanza magnetica Acquisition NOTA: Diversi exSono necessari sistemi di TRA per la sperimentazione animale. Quindi, sarà necessario: <ol><li> Utilizzare attrezzature adeguate per anestetizzare gli animali. </li><li> Ottenere una stretta Impianto acqua calda del circuito a circolazione con aria calda esterna per mantenere la temperatura della stalla animali. NOTA: In questo caso il sistema di monitoraggio e gating compatibili MRI registra la temperatura dell&#39;animale all&#39;interno del magnete MRI. </li><li> Monitorare la temperatura esterna in prossimità dell&#39;animale, il corpo (termometro rettale) Temperatura dell&#39;animale, il sensore di respirazione trova sotto il corpo dell&#39;animale vicino al torace utilizzando un&#39;interfaccia integrata nella console MRI. </li></ol></li><li> Esperimento MRI <ol><li> Anestetizzare gli animali con isoflurano vaporizzata (2% per l&#39;induzione per due o tre minuti e 1-1,5% per manutenzione durante l&#39;esperimento MRI) con una linea di ossigeno al 100%. </li><li> Posto l&#39;animale nel centro del magnete con l&#39;aiuto di una acquisizione profilo. </li><li> Dopo il punto 5.2.2, sintonizzare la bobina RF a 300 MHz (7 T) frequenza di risonanza e abbinare l&#39;impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm per una ricezione ottimale del segnale. NOTA: Prestare attenzione al cablaggio esterno e le connessioni che vanno al sistema di misura tramite l&#39;adattatore / splitter per ogni parte della batteria del trasmettitore singolarmente (nel nostro caso si trattava di una bobina in quadratura). </li><li> Dopo aver sintonizzato e la congruenza delle bobine, collegare le bobine nello scanner. </li><li> Per la calibrazione RF impulso (di forma e lunghezza) e la regolazione frequenza centrale eseguire la calibrazione sia di impulso e il centro della frequenza manualmente. Eseguire le regolazioni della taratura impulso a 90 °, spessora grossolana (vedi sotto), la frequenza centrale e guadagno del ricevitore manualmente. </li><li> Eseguire la posizione esatta con un eco di gradiente (flash o GRE) scansione localizzatore (3 piano di acquisizione scout: assiale, coronale e sagittale, chiamato anche tripilot. </li><li> Eseguire il shimming magnete per ottimizzare il campo magnetico nella omogeneità center del magnete. Eseguire questa operazione manualmente (vedi 5.2.3) utilizzando una sequenza FID uno o singolo impulso e regolare detti primo e secondo ordini spessori o qualsiasi sequenza shimming automatico incluso nel sistema NOTA: Un campo magnetico ben spessorato è facilmente riconoscibile e misurata con il T2 * (come grande è meglio) o stretto FWHM degli spettri. </li></ol></li><li> MRI acquisizione dati della targa 5 <ol><li> Iniettare 100 ml (1 mg [Fe] ml -1) di nanoparticelle neridronato per via endovenosa in coda vena e acquisire le immagini dopo l&#39;iniezione 1 ora. Caricare i parametri per l&#39;acquisizione MRI di placca aterosclerotica guardando l&#39;aorta addominale (biforcazione renale). </li><li> Mettere multistrato, da 10 a 20 fette in modalità interleave per ridurre al minimo gli artefatti. </li><li> Acquisire ad alta risoluzione rotazione veloce echo T1 pesate risonanza magnetica in vista coronale o assiale con i seguenti parametri: FOV 60 x 30 mm (coronale), 30 x 30 mm (assiale), affettare spessore 0,8 mm (con la piccola pendenza serpentina configuration questo può essere ridotto a 0,6 mm), 400 msec TR, 8 msec TE, 256 x 256 di acquisizione e di matrice ricostruzione dei dati, 6 (grande gradiente) a medie (segnale 8 piccolo gradiente) per tempi di acquisizione medi 5-8 min. NOTA: TE è particolarmente critica e la presenza del segnale di sangue e di flusso e manufatti chemical shift che può limitare le applicazioni. In questi casi il flusso insensibile fast spin echo T2-IR può contribuire a ridurre gli artefatti e l&#39;acquisizione di dati complementari nella stessa esatta posizione può aiutare a caratterizzare la placca. Inoltre, un impulso presaturazione può essere utilizzato per ridurre il tessuto grasso che circonda la parete arteriosa per una migliore delineazione del confine esterno della riduzione degli artefatti muro e chemical shift. </li><li> Trasferire le immagini utilizzando un formato standard, quali DICOM e vista software appropriato (per esempio OsiriX software di imaging o AMIDE: Medical Imaging Data Examiner) 5. Quantificare l&#39;effetto di contrasto che delimita manualmente i veszona sel, lo spessore della parete, zona del lume e la placca onere 5. </li></ol></li></ol>

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Ferro nanoparticelle di ossido (IONP) sono uno dei nanomateriali più importanti ed è stato utilizzato per applicazioni diverse da molto tempo fa. L&#39;uso di questi materiali come agente di contrasto per risonanza magnetica (MRI) è un campo ben consolidata. Tuttavia, le vie di sintesi spesso prendono più volte e l&#39;ambiente è complicato. A causa di ridurre drasticamente i tempi di reazione e migliora la riproducibilità l&#39;uso di sintesi a microonde-driven sembra essere una valida alternativa per la produzione di nanoparticelle di alta qualità. Nel protocollo descritto sopra, la tecnologia a microonde è stato utilizzato per la sintesi di due differenti nanoparticelle. Forno a microonde consentono una messa a punto dei principali parametri che possono influenzare le caratteristiche finali delle particelle. È importante notare che le proprietà fisiche delle nanoparticelle cambieranno se una delle condizioni descritte sono cambiati. Poiché alcune sostanze chimiche sono utilizzate nella procedura di sintesi, la purification passi sono fondamentali per ottenere nanoparticelle di alta qualità. In OA-IONP eccesso di tensioattivi sono utilizzati al fine di ottenere abbastanza stabilità nelle nanoparticelle. Dopo la sintesi, tre passaggi di purificazione sono obbligatori per rimuoverlo. Per la sintesi di acido azelaico IONP, sono richiesti due diverse fasi microonde. Nella seconda fase, la dimensione finale delle particelle può essere sintonizzata da ultra-piccole IONP (D h &lt;50 nm) usando pH = 2,9 a grande dimensione idrodinamica (D h&gt; 50 nm) usando pH fisiologico. Nella purificazione del azelaico acido IONP, la quantità di NaOH usata è essenziale. quantità sufficiente di NaOH deve essere aggiunta per stabilizzare le nanoparticelle, tuttavia troppi NaOH possono desorbire il tensioattivo da nanoparticelle di rendering materiale instabile. Tipicamente, IONP possiedono il tempo di circolazione breve sangue che è uno dei principali svantaggi. Per il suo utilizzo come mezzo di contrasto, le nanoparticelle hanno bisogno di circolare abbastanza tempo nel sangue per raggiungere l&#39;area desiderata. Per aumentare il tempo di circolazione nel sangue diversi approcci vengono effettuate classicamente fuori. Queste strategie si basano principalmente su l&#39;attaccamento di un residuo pegilato che misura il tempo di circolazione della nanoparticella. Tuttavia, nel caso di neridronato-IONP, l&#39;accumulo viene prodotto molto veloce. L&#39;uso di un aminobifosfonato come biomolecole sulle nanoparticelle per indirizzare ateroma placca è un concetto nuovo in base alle capacità di calcio di questi tipi di composti. Il suo accumulo nella zona della lesione, in meno di un ora dimostra l&#39;alta affinità di neridronato-IONP verso calcio contenuto nella placca dell&#39;ateroma. Per la visualizzazione di ateroma placca, molte tecniche di imaging avanzate sono di solito impiegati. Tra questi, tomografia ad emissione di positroni (PET) e MRI sono le tecniche più standardizzate. PET fornisce i migliori risultati in termini di informazioni funzionali a causa della elevata sensibilità eMRI i migliori risultati in informazioni anatomiche causa della alta risoluzione. Sebbene PET potrebbe essere l&#39;opzione ideale per seguire una sonda sintetica, la risoluzione di questa tecnica in piccoli animali (~ 1 mm) limita il suo utilizzo per visualizzare calcificazioni minori nelle lesioni aterosclerotiche. RM è l&#39;alternativa ideale che fornisce una migliore risoluzione (~ 0.1 micron). La sensibilità inferiore di questa tecnica non evita la visualizzazione del mezzo di contrasto nella regione di interesse e la risoluzione migliore permette di identificare piccole calcificazioni. Inoltre, i risultati mostrano che la combinazione di rapida accumulazione unica di neridronato-IONP con l&#39;alta risoluzione della RM è uno scenario ideale per la rilevazione di ateroma placca nei piccoli animali.

L&#39;aterosclerosi è una malattia infiammatoria cronica multifattoriale della parete arteriosa risultante da un metabolismo lipidico deregolamentato e una risposta infiammatoria difettoso. A causa della prevalenza e dei costi economici e sociali di questa e delle relative malattie cardiovascolari vi è un crescente interesse per affrontare la patologia con nuovi strumenti, di cui la nanotecnologia è uno dei più promettenti. 1-3 Tuttavia ci sono pochissimi esempi di veloce produzione e caratterizzazione di sonde che è essenziale per la traduzione alla clinica 4 in questo protocollo usiamo una sintesi a microonde di nanoparticelle di ossido di ferro per ulteriore funzionalizzazione con un bifosfonato e nel rilevamento vivo dell&#39;aterosclerosi in ApoE -. / -. topi in 1 ora 5 ferro nanoparticelle di ossido (IONP) sono un nanomateriale noto e il suo utilizzo come agente di contrasto per risonanza magnetica (MRI) è stato stabilito per il rilevamento di malattie differentis negli ultimi anni. 6-8 Forno a microonde di sintesi (MWS), permette di sintetizzare le nanoparticelle in tempi estremamente brevi, con alta riproducibilità e rese migliorate. 9,10 nel nostro protocollo otteniamo IONP con targa capacità di targeting in tre fasi. Quella finale è l&#39;attaccamento di un aminobifosfonato, neridronato, che è la chiave nella nostra strategia per le sue proprietà leganti il ​​calcio. Grazie alla loro pirofosfato analogo naturale (ppi), neridronato è stato utilizzato nel trattamento di osteogenesi imperfetta (OI) e malattia di Paget ossea (PPB) per la loro elevata affinità verso minerale ossea. 11-13 Le tre fasi del protocollo sono riassunti nello schema 1. passaggi uno e due vengono effettuate con tecnologia a microonde. Il primo passo prevede oleico nanoparticelle di ossido di ferro acido rivestite (OA-IONP) da una modifica di metodi pubblicati. 14 Il protocollo è un adattamento alla sintesi a microonde della traditional sintesi termica decomposizione. 15,16 Una miscela contenente Fe (acac) 3, acido oleico, oleilammina e 1,2-dodecandiolo viene sciolto in alcool benzilico e sottoposti a due processi di riscaldamento. La purificazione è effettuata lavando con EtOH e raccogliendo le particelle con un magnete Nd-Fe-B per eliminare l&#39;eccesso di tensioattivi nel surnatante. Poi, OA-IONP siano stabilizzati in CHCl 3. Come previsto, a causa del riscaldamento molto veloce, i risultati attesi hanno mostrato che le nanoparticelle sintetizzate da microonde sono inferiori in termini di nucleo (3,7 ± 0,8 nm) e la dimensione idrodinamica (7,5 nm) rispetto decomposizione termica tradizionale; tuttavia, le nanoparticelle presentano ancora un ottimo cristallinità. La seconda fase consiste in una modificazione chimica diretta del doppio legame, presente nel acido oleico, usando un forte ossidante come KMnO 4, la metodologia originale sviluppato nel nostro gruppo è stato modificato per condizioni MW.17 Una prima fase forma complessi tra MnO 4 - e il doppio legame. Poi, una seconda fase in condizioni acide, produce la scissione della molecola di acido oleico dando azelaico acido IONP. Dopo queste due fasi di 9 min ciascuno, il campione viene purificata, primo lavaggio con NaHSO 3 1% per ridurre l&#39;eccesso di MnO 4 - di MnO 2 e poi con NaOH 1% per neutralizzare l&#39;acido. Dopo la fase di purificazione, azelaico-IONP siano stabilizzati in 10 mM tampone fosfato pH = 7.2. Questo buffer è l&#39;ambiente migliore per la stabilità colloidale di particelle analogamente a quanto avvenuto nella reazione originale, termica. 18 L&#39;uso della microonda per l&#39;ossidazione diretta del doppio legame contenuta in OA-IONP è un buon esempio dei vantaggi di utilizzare questa tecnologia nella sintesi di nanoparticelle. Con il metodo classico della reazione avviene 24 ore, l&#39;utilizzazione di microonde diminuire il riattiin tempo per 18 min. Inoltre, il protocollo microonde-driven mostra un&#39;ottima riproducibilità dando nanoparticelle con 30 ± 5 nm di dimensione idrodinamica dopo 4 ripetizioni. A parte della variazione della dimensione idrodinamica, il potenziale zeta è un buon parametro per verificare velocemente il successo della reazione. A causa della presenza dei nuovi gruppi carbossilici in azelaico-IONP, il valore del potenziale zeta è di circa -44 mV, molto simile al valore ottenuto con il metodo termico. Per il fissaggio di neridronato per azelaico-IONP, tradizionale coniugazione EDC / sulfo-NHS viene utilizzato. 19 Questo approccio sintetico è ben stabilito dal impiegando un carbossilato attivabile con il sulfo-NHS assicura stabilità colloidale durante la reazione. Dopo l&#39;eliminazione del tampone fosfato reazione con neridronato viene condotta in 1 tampone mM HEPES (pH ~ 7). La reazione rende neridronato-IONP con una dimensione idrodinamica di 40 ± 4 nm in una dimensione ristretta distribution e -24,1 mV di zeta-potenziale. La procedura è descritta per una rapida sintesi di IONP per la visualizzazione in vivo della placca aterosclerotica, sebbene la fattibilità del metodo consente il fissaggio di qualsiasi peptide / anticorpo con ammine libere, utilizzando le stesse condizioni, per scopi diversi all&#39;interno T 2 pesate agente di contrasto MRI campo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1107">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Microwave Explorer/Discover Hybrid-12</td>
			<td style="width:176px;">CEM Corporation, USA</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:311px;">Any microwave for chemical synthesis can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable PD-10 desalting columns&#160;</td>
			<td>GE Healthcare life sciences</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td>Any size exclusion column will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon&#174;Ultra-0.5 ml&#160;</td>
			<td>Merck Millipore Ltd</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated pH meter&#160;</td>
			<td>SI analytics</td>
			<td>285105127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neodymium magnet&#160;</td>
			<td>Aiman Gz</td>
			<td>ND010B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genius 3&#160;</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3340000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZetaSizer Nano ZS&#160;</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard (macro) cell Optical glass&#160;</td>
			<td>Labbox</td>
			<td>11718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Bruker Minispec mq60</td>
			<td style="width:176px;">Bruker</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwave-driven synthesis of iron oxide nanoparticles for fast detection of atherosclerosis

Un protocollo veloce e riproducibile microonde-driven è stato sviluppato per la sintesi di nanoparticelle neridronato-funzionalizzato. Partendo dalla sintesi di nanoparticelle idrofobiche, il nostro metodo si basa su un adattamento dal metodo di decomposizione termica a microonde guidato sintesi. La nuova metodologia produce una diminuzione dei tempi di reazione in confronto con i procedimenti tradizionali. Inoltre, l&#39;utilizzo della tecnologia a microonde aumenta la riproducibilità delle reazioni, cosa importante dal punto di vista delle applicazioni cliniche. La novità di questo nanoparticelle di ossido di ferro è l&#39;attaccamento di neridronato. L&#39;uso di questa molecola conduce una porzione bisfosfonato verso l&#39;esterno della nanoparticella che fornisce Ca 2+ immobili in vitro e l&#39;accumulo selettiva vincolante in vivo nella placca ateroma. Il protocollo consente la sintesi e la rilevazione della placca in circa 3 ore da quando la sintesi iniziale da organic precursori. Il loro accumulo nella zona aterosclerotica in meno di 1 ora fornisce un mezzo di contrasto particolarmente adatto per applicazioni cliniche.

In questo protocollo, la sintesi di tre diversi IONP è descritto. Partendo da idrofobica OA-IONP, nanoparticelle stabili acquose sono ottenuti con l&#39;aiuto di sintesi a microonde-driven. Tutte le nanoparticelle presentato ultra-piccola dimensione idrodinamica (Dh &lt;50 nm) in una distribuzione di dimensione molto stretta (Figura 1c). L&#39;utilizzo della tecnologia a microonde rende ultra-piccole nanoparticelle in termini di dimensioni di base. Poiché microonde produrre un riscaldamento veloce, il tasso di aumento nucleazione in confronto con altri metodi che danno più piccoli formati nel nucleo delle nanoparticelle. Tuttavia, le particelle presentano ancora eccellente cristallinità come mostrato nelle immagini TEM dove le frange di reticolo sui Fe 3 O 4 core possono essere chiaramente visibili (Figura 1a, b). Altro aspetto importante del metodo è la riproducibilità. Dopo quattro ripetizioni della sintesi di acido azelaico IONP, gli stessi risultatinella dimensione e la distribuzione idrodinamico sono stati ottenuti (Figura 1d). Dopo funzionalizzazione, il Ca 2+ proprietà a causa di bifosfonati presenti in nanoparticelle neridronato vincolante sono stati controllati incubazione queste nanoparticelle con diverse quantità di Ca 2+. È stato dimostrato che i loro incrementi T 2 tempo di rilassamento linearmente con la quantità di Ca 2+ e il tempo di incubazione a causa della formazione di cluster di nanoparticelle che nanoparticelle senza Ca 2+ è rimasto stabile (figura 1e), conforme nostra ipotesi iniziale. Negli esperimenti di risonanza magnetica in vivo sono stati eseguiti in 48 settimane di vita ApoE - / - mice. Carotidi e le immagini basali dell&#39;aorta addominale sono stati presi. Lesione causa della formazione della placca aterosclerotica può essere visto chiaramente. Poi, 100 ml (1 mg [Fe] ml -1 </sup&gt;) di nanoparticelle neridronato sono stati via endovenosa iniettato in vena della coda e le immagini acquisite dopo l&#39;iniezione 1 ora. Come mostrato (Figura 2), 1 ora dopo l&#39;iniezione forma il segnale della placca è ipointenso rispetto alle immagini basali. Selezione di due ROI (regione di interesse) permette la quantificazione del segnale di intensità nella zona della lesione per il confronto tra il basale e immagini di iniezione dopo 1 ora. La placca rapporto muscolo è significativamente diversa tra loro (p &lt;0.05, Figura 2b). Inoltre, il segnale nel fegato è stata monitorata in topi dopo l&#39;iniezione di 100 ml di nanoparticelle neridronato per valutare se la riduzione dell&#39;intensità era dovuto al tempo di circolazione nel sangue e non da accumulo selettiva. Come mostra il grafico (Figura 2C), le nanoparticelle sono state completamente eliminate dalla circolazione dopo 20 min conferma l&#39;accumulo selettivodi neridronato nanoparticelle nei confronti della placca aterosclerotica. Ex vivo l&#39;imaging finale e istologia sono state eseguite. I topi sono stati sacrificati e le aorte estratti. Imaging di aorte con e senza nanoparticelle ha mostrato differenze nel segnale in accordo con esperimenti in vivo (figura 2d). <img alt="schema 1" src="/files/ftp_upload/53472/53472sch1highres.jpg" width="700" /> Schema 1:. Passaggi sintetici seguiti nel protocollo e la caratterizzazione di base in ogni punto dal DLS <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53472/53472sch1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53472/53472fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1: Characterization di nanoparticelle (a) immagini TEM, a due ingrandimenti, per OA-IONP.; (B) immagini TEM, a due ingrandimenti, per neridronato-IONP; (C) le dimensioni idrodinamica per le nanoparticelle OA-IONP, azelaico acidi IONP e neridronato-IONP; (D) dimensione idrodinamica per azelaico acido IONP in quattro diverse sintesi e (e) l&#39;evoluzione di T tempo 2 relax in una soluzione di neridronato-IONP in funzione del tempo e della concentrazione di calcio (protocollo TEM ref: NIST - NCL misto Assay Protocol , PCC-X, misurare le dimensioni delle nanoparticelle Utilizzando microscopia elettronica a trasmissione). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53472/53472fig1highres.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53472/53472fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: dati MRIdella placca (a) In vivo MRI di ApoE - / - mouse prima (superiore) e un&#39;ora dopo l&#39;iniezione iv di neridronato-IONP (bottom).; (B) la placca al muscolo intensità di segnale relativa prima (basale) e un&#39;ora dopo l&#39;iniezione iv di neridronato-IONP; (C) il fegato al muscolo intensità del segnale relativa in diversi momenti dopo l&#39;iniezione di neridronato-IONP e (d) ex vivo immagini dell&#39;aorta per due topi, con e senza l&#39;iniezione di nanoparticelle 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53472/53472fig2highres.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.</a>

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Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

La tecnologia a microonde permette di sintesi estremamente veloce di nanoparticelle di ossido di ferro per la caratterizzazione di placca di aterosclerosi. L&#39;uso di un aminobifosfonato nel lato esterno della nanoparticella fornisce una rapida accumulazione nell&#39;area aterosclerotica.

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

microwave-driven-synthesis-iron-oxide-nanoparticles-for-fast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Views.  Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III and CIBER de Enfermedades Respiratorias.  La tecnologia a microonde permette di sintesi estremamente veloce di nanoparticelle di ossido di ferro per la caratterizzazione di placca di aterosclerosi. L'uso di un aminobifosfonato nel lato esterno della nanoparticella fornisce una rapida accumulazione nell'area aterosclerotica. 

Video: Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Ricerca

Bioingegneria

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Realizzazione di un funzionalizzato magnetico batterica Nanocellulose con nanoparticelle di Ossido di Ferro

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

Etichettatura delle cellule e Targeting con superparamagnetico ossido di ferro nanoparticelle

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. Atherosclerosis is also the leading cause of sudden death and myocardial infarction, instigated by unstable plaques that rupture and occlude the blood vessel without warning. Current imaging modalities cannot differentiate between stable and unstable plaques that rupture. Peptide amphiphiles micelles (PAMs) can overcome this drawback as they can be modified with a variety of targeting moieties that bind specifically to diseased tissue. Monocytes have been shown to be early markers of atherosclerosis, while large accumulation of monocytes is associated with plaques prone to rupture. Hence, nanoparticles that can target monocytes can be used to discriminate different stages of atherosclerosis. To that end, here, we describe a protocol for the preparation of monocyte-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs are self-assembled through synthesis under mild conditions to form nanoparticles of 15 nm in diameter with near neutral surface charge. In vitro, PAMs were found to be biocompatible and had a high binding affinity for monocytes. The methods described herein show promise for a wide range of applications in atherosclerosis as well as other inflammatory diseases.

This paper presents a method involving the synthesis and characterization of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles and the corresponding assays to test for biocompatibility and ability of the micelle to bind to monocytes.

Sintesi del monocito-targeting Peptide Amphiphile micelle per l'Imaging di aterosclerosi

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...