Gli autori si desidera ringraziare il sostegno finanziario alla University of Southern California, il National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli ed Edythe Broad Innovation Award e il L.K. Whittier Foundation Non-cancro Premio di ricerca traslazionale concesso a EJC. Gli autori ringraziano il centro per la microscopia elettronica e microanalisi, centro di eccellenza in NanoBiophysics, centro di eccellenza per la caratterizzazione molecolare e traduzione Imaging Center presso la University of Southern California per assistenza in configurazioni di strumentale.

Nota: Leggere la scheda di sicurezza per i reagenti e seguire tutte le misure di sicurezza chimica come richiesto dall'istituzione locale.
1. preparazione di MCP-1 PAMs
<ol><li>
Preparazione del peptide di MCP-1
	<ol>
<li>Pesare 0,25 mmol di Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in un recipiente di reazione (RV). Sciacquare il lato del camper con 5ml dimethylforamide (DMF) in una cappa chimica.</li>
		<li>Caricare il camper su un sintetizzatore di peptidi di benchtop automatizzato. Carico pre-confezionato aminoacido fiale, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', dal C a N-terminale. Includere un flaconcino vuoto alla fine per il passo finale deprotezione. Nota: Può anche essere sintetizzato un peptide strapazzato con la sequenza, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', usando lo stesso protocollo.</li>
		<li>Una volta terminata la sintesi, trasferire i peptidi su resina da RV nella fiala di scintillazione con 2-3 mL di metanolo fino a quando tutti le resine vengono trasferiti. Dopo la resina ha affondato verso il basso, rimuovere il surnatante di metanolo e far evaporare il rimanente fino a secco. Vuoto a secco per ulteriori 2 ore o una notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fare 12 mL di soluzione di clivaggio contenente trifluoracetic acido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane al 94:2.5:2.5:1 vol % in una cappa chimica. Agitare la soluzione di fenditura per assicurarsi che viene miscelato in modo uniforme. Attenzione: Poiché triisopropylsilane ed etanditiolo sono aria-sensibile, argon spurgo stock flaconcini di triisopropylsilane ed etanditiolo per 1 min prima di rimetterle.</li>
		<li>Posizionare il vaso di sintesi (SV) su un agitatore per braccio di bloccaggio nella parte inferiore metà della SV. Trasferimento del peptide-resina al SV con 2 mL di soluzione di fenditura fino a quando tutti il peptide-resine vengono trasferiti.</li>
		<li>Lavare i lati dello SV con 3 mL di soluzione di clivaggio. Chiudere il tappo della SV e agitare a 300 oscillazioni/min per 4 h.</li>
		<li>Pesare una provetta vuota 50ml. Registrare la massa.</li>
		<li>Dopo 4 h, è possibile scaricare la soluzione peptide fenduto dalla SV nella provetta da centrifuga 50 mL. Sciacquare la SV parecchie volte con la soluzione rimanente di clivaggio.</li>
		<li>Evaporare la soluzione peptide fenduto con azoto fino a quando c'è meno di 4 mL restanti la provetta da centrifuga.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di peptide-spaccati 36 mL di etere ghiacciata.</li>
		<li>Vortex la soluzione fino a quando è completamente bianca o gialla. Centrifugare a 3.000 x g per 5 min a 4 ° C e decantare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 40 mL di etere ghiacciata al tubo. Vortice e Sonicare nuovamente. Ripetere il processo di centrifugazione. Decantare il supernatante.</li>
		<li>Asciugare il pellet PA grezzo con azoto gas spurgo fino a che l'etere è visibilmente volatilizzato.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL bidistillata acqua, vortice e trattare con ultrasuoni fino a quando il peptide è completamente dissolto nella soluzione.</li>
		<li>Congelare la soluzione e lyophilize fino a secco.</li>
		<li>Una volta che il peptide è asciugato, pesare la massa della provetta da centrifuga contenente il peptide grezzo. Sciogliere il peptide grezzo in 5 mg/mL di acqua.</li>
		<li>Sciogliere 25 mg di greggio MCP-1 peptide in 5 mL di acqua bidistillata per rendere una concentrazione totale di 5 mg/mL. Purificare il peptide grezzo di MCP-1 mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con 0,1% TFA in acqua (solvente A) e 0,1% TFA in acetonitrile (solvente B) come fasi mobili su una colonna in fase inversa C8. Iniettare 5 mL del peptide in HPLC. Nota: La fase mobile iniziale consisteva di solvente al 100% A una portata di 9,0 mL/min diminuire solvente A lentamente al 30% in 27 min e tenere a questa composizione per 3 min ritorno la sfumatura al 100% solvente un oltre 3 min e permanenza a questa composizione per 1 min dare un totale di run-time di almeno 34 mantenere la temperatura della colonna a 55 ° C. Modalità di sorgente di ioni positivi di utilizzo per l'analisi. L'acido formico può essere utilizzato al posto di TFA, se TFA è troppo acido per la colonna HPLC. È consigliabile che la velocità di rampa di composizione solvente organico non deve superare 2%/min per la separazione migliore.</li>
		<li>Analizzare ogni frazione usando la spettrometria totale di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) per il prodotto previsto m/z a 2.890. Nota: Sciogliere l'acido α-ciano-4-idrossicinnamico a 1 mg/mL in acetonitrile/acqua (50: 50% in volume) come la soluzione di matrice. Spot 0,75 µ l di soluzione di matrix sulla piastra MALDI, seguita da 0,75 µ l di ciascuna frazione. Eseguire l'analisi utilizzando una modalità ioni positivi riflettente a un intervallo di massa di 500-5.000 Da.</li>
		<li>Combinare le frazioni di prodotto, soffiare via acetonitrile, congelare e lyophilize peptidi purificati fino a secco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di MCP-1 PA
	<ol>
<li>Preparare un 1,1 eccesso molare di 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide al peptide in flaconi separati scintillazione. Sciogliere entrambi i composti in acqua bidistillata per rendere ~ 15 mg/mL. Sottoporre ad ultrasuoni per 15 minuti o fino a quando entrambe le soluzioni sono completamente chiare. Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 è sintetizzato utilizzando lo stesso protocollo con DSPE-PEG (2000)-ammina e Cy5 estere-funzionalizzati N-Idrossisuccinimide (NHS), fatta eccezione per passo 1.2.3, dove il pH della soluzione è regolato a 8,5.</li>
		<li>Aggiungere DSPE-PEG (2000)-con soluzione alla soluzione del peptide. Vortice e Sonicare.</li>
		<li>Aggiungere 1 M NaOH goccia a goccia (1 µ l) alla volta fino a quando il pH della soluzione è 7.</li>
		<li>Soluzione di eliminazione dei fogli inceppati di azoto per 5 min, agitare la soluzione durante la notte.</li>
		<li>Congelare la soluzione e lyophilize fino a secco.</li>
		<li>Una volta essiccato il prodotto grezzo, sciogliere il solido a 5 mg/mL di acqua.</li>
		<li>Purificare con HPLC come descritto sopra. Nota: Peptide non coniugata e DSPE-PEG(2000) dovrebbe eluire tra 15-30% di concentrazione organica (% vol), mentre DSPE-PEG (2000)-MCP-1 coniugato dovrebbe eluire tra 40-50% di concentrazione organica.</li>
		<li>Analizzare ogni frazione utilizzando la spettrometria di massa MALDI per corrispondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 dovrebbe avere un picco di ampia m/z a 5.760. Nota: l'acido 2,5-dihydroxybenzoic è meglio utilizzato come la matrice per DSPE-PEG (2000)-MCP-1 con MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assemblea di MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Sciogliere 1,75 mg PAs di MCP-1 con 3 mL di metanolo in un flaconcino 1-dram. Sonicare fino alla completa dissoluzione della PA di MCP-1. Nota: Cy5 anfifili possono essere incorporato con un rapporto molare di 10:90 MCP-1 PA per applicazioni di imaging.</li>
		<li>Far evaporare il metanolo sotto azoto in un movimento circolare durante il risciacquo il metanolo restante fuori il lato del flaconcino fino a formare una pellicola uniforme nella parte inferiore della fiala. Vuoto-il film durante la notte a secco.</li>
		<li>Idratare il film con 3 mL di tampone fosfato o acqua salino (PBS) per ottenere una soluzione di 100 µM di MCP-1 PAMs. Delicatamente il vortice e Sonicare la soluzione fino a clear. Incubare a 80 ° C per 30 min. Nota: La temperatura elevata è stata indicata per accelerare il processo auto-assemblaggio e consente al componente di peptide formare la struttura secondaria più stabile, riducendo il micellare critica (CMC) concentrazione42,43.</li>
		<li>Raffreddare la conseguente dispersione a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caratterizzazione di MCP-1 PAMs
<ol><li>
Diffusione dinamica della luce (DLS) e potenziale zeta
	<ol>
<li>Posto 100 µM di MCP-1 PAM o strapazzate PAM in una cuvetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta. Nota: DLS e zeta cuvette potenziali possono essere diversi in base alle istruzioni dello strumento.</li>
		<li>Equilibrare lo strumento a temperatura ambiente. Misurare le dimensioni e la carica superficiale di PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
	<ol>
<li>Aggiungere 7 µ l di 50 µM MCP-1 PAM o PAM uova strapazzate su una griglia TEM sospeso all'interno di una pinzetta autochiusura per 5 min stoppino via la goccia con un panno delicato compito.</li>
		<li>7 µ l di acqua per lavare la griglia. Stoppino via la goccia.</li>
		<li>Aggiungere 7 µ l di acido fosfotungstico di % wt 1 per 2 min. stoppino via la goccia. Ripetere il punto 2.2.2.</li>
		<li>Asciugare la griglia TEM prima dell'analisi TEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
	<ol>
<li>Accendere l'azoto per 5-10 minuti prima dell'uso dello strumento.</li>
		<li>Mettere 300 µ l di vuoto (acqua o PBS) nella provetta.</li>
		<li>Misurare gli spettri a 190-265 nm, 0.2 mm-lunghezza del percorso con un tempo di integrazione 1 s e una larghezza di 1 banda nm a temperatura ambiente. Raccogliere 3 replicati.</li>
		<li>Misura 100 µM peptide di MCP-1, MCP-1 PAM, uova strapazzate peptide e strapazzate PAM sotto la stessa condizione descritta al punto 2.3.3. Sottrarre dallo spazio vuoto.</li>
		<li>Adattare i dati utilizzando un'interpolazione lineare di polilisina spettri di base.</li>
		<li>Spegnere lo strumento. Attendere 10 minuti prima di spegnere l'azoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. analisi in Vitro di MCP-1 PAMs
<ol><li>
Biocompatibilità in vitro
	<ol>
<li>Cultura ed espandere WEHI 274.1 monociti murini in per volta Eagle supplementato di Dulbecco con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 al passaggio 5. Nota: WEHI 274.1 sono cellule in sospensione. Quando la coltura, i mezzi di comunicazione dovrebbe essere rifornito ogni 2-3 giorni.</li>
		<li>Monociti di dispensare in media in una provetta sterile da 50 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirare i vecchi media e risospendere in media fresco 10ml nella provetta da centrifuga. Mescolare lentamente fino a quando le cellule sono distribuite uniformemente nei media. Contare le celle usando la macchiatura blu di trypan e un emocitometro.</li>
		<li>Diluire le cellule tale che ci sono 4.000 monociti a 90 µ l di media per pozzetto. Aggiungere 90 µ l di cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per 24 h. Nota: Non utilizzare i pozzi sul bordo esterno della piastra per evitare differenze di evaporazione e sbalzi termici nella piastra. Riempire i pozzetti esterni con 100 µ l PBS.</li>
		<li>Sciogliere 0,15 µmol di peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide strapazzato o uova strapazzate-PAM in 150 µ l PBS in microcentrifuga separata, sterilizzato. Effettuare diluizioni seriali per rendere 65 µ l di 1, 10 e 100 µM di ciascun campione.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l PBS di ciascuna concentrazione in pozzetti contenenti WEHI 274.1 (volume totale: 100 µ l per bene, 6 linee, totale 96 pozzetti). Incubare per 72 h.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in ciascun pozzetto. Incubare per 1 h.</li>
		<li>Analizzare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastra a 490 nm o in base alle istruzioni del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In vitro associazione micella
	<ol>
<li>Monociti seme 500.000 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL di supporto contenente 100 µM Cy5-labeled PAM di MCP-1 (rapporto molare di 10:90 di DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incubare per 1 h.</li>
		<li>Raccogliere WEHI 274.1 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare i media.</li>
		<li>Risospendere e lavare le cellule in 2 mL di PBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il PBS. Ripetere il processo di lavaggio con 2 mL di PBS. Aspirare il PBS.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di freddo paraformaldeide al 4% per fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Dispensare le cellule fissate su un vetrino coprioggetti di vetro sterile all'interno dei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Centrifugare a 400 x g per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il paraformaldeide. Lavare e sciacquare una volta con 2 mL di PBS. Risospendere con 1 mL di PB Nota: Durante il risciacquo, evitare di perturbare le cellule sul vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Mettere 10 µ l di glicerolo 90% in PBS in una diapositiva. Utilizzare un ago e una pinzetta per ritirare il vetrino coprioggetti. Asciugare il bordo del coverslip. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti in una diapositiva rivolto verso il basso.</li>
		<li>Delicatamente e sigillate il bordo del coprivetrino con smalto trasparente. Mettere in frigorifero fino al momento per l'imaging.</li>
		<li>Utilizzare un laser confocale scansione microscopio (CLSM) installato con laser per Cy5 a λeccitazione = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

MCP-1 PAMs sono una promettente piattaforma di imaging molecolare, costituito da un peptide di targeting idrofilo e coda idrofobica che spinge la natura auto-assemblata di nanoparticella. Questa micella monocito-targeting può essere preparato da semplice sintesi e fasi di purificazione del peptide di MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs hanno molte caratteristiche benefiche per in vivo imaging molecolare come loro self-assembly sotto condizioni blande, biodegradabilità intrinseca e diversità strutturali e chim...

Le malattie cardiovascolari rimangono per essere le principali cause di morte a livello mondiale con circa 17,3 milioni di morti in tutto il mondo1. Le malattie cardiovascolari sono fornite da aterosclerosi, una condizione in cui si accumulano le placche nelle arterie, quindi inibente sangue e flusso di ossigeno alle cellule del corpo2,3. La progressione di aterosclerosi coinvolge l'ispessimento e l'indurimento delle arterie da una risposta infiammatoria, metabolismo dei lipidi irregolare e l'accumulazione della placca, che conduce a placca la rottura e l'infarto miocardico4,5. Le cellule endoteliali esprimono molecole di adesione e citochine, che comprendono MCP-1, che si lega al recettore di chemochine C-C (CCR2) presente sulla superficie dei monociti6,7,8. Il colesterolo ossidato converte i monociti macrofagi durante la fase iniziale della formazione di placche, che amplifica la risposta infiammatoria nella regione e porta alla lesione del tessuto e la formazione di placche instabili o vulnerabili9, 10.
Tradizionalmente, l'aterosclerosi viene valutata valutando stenosi luminal da imaging anatomico mediante angiografia o ultrasuono11,12. Tuttavia, questi metodi possono determinare solo lo stringimento severo della parete arteriosa e non lo stadio precoce di aterosclerosi, come crescita iniziale della placca causa rimodellamento arterioso mantenere le dimensioni dell'arteria e sangue flusso tasso12,13, 14. Di conseguenza, gli angiogrammi underrepresent prevalenza di aterosclerosi. Inoltre, tecniche di imaging non invasive come singola emissione del fotone computato tomografia, tomografia a emissione di positroni e la risonanza magnetica recentemente sono state usate per caratterizzare la morfologia della placca come possono fornire informazioni iniziali e caratterizzazione delle placche. Tuttavia, queste modalità sono spesso limitate dalla mancanza di sensibilità, risoluzione spaziale, o richiedono l'uso di radiazioni ionizzanti, rendendo imaging progressione della placca nelle diverse fasi molto più impegnativo15,16, 17. Un sistema di consegna imaging che identificherebbe specificamente placche nelle diverse fasi di aterosclerosi rimane ad essere sviluppato.
Le nanoparticelle hanno dimostrato di essere una piattaforma emergente per in vivo della placca di targeting e diagnostica18,19,20,21. In particolare, PAMs sono vantaggiose grazie alla loro diversità chimica e la possibilità di ospitare una varietà di moiety, composizioni, dimensioni, forme e funzionalizzazione superficiale22. Peptide anfifili (PAs) sono costituiti da un peptide "capigruppo idrofilo," attaccato a una coda idrofobica, che in genere sono i lipidi; Questa struttura anfifilica conferisce la capacità di auto-assemblaggio e consente una visualizzazione multivalente di peptidi sulla superficie delle particelle22,23,24. Il peptide headgroups possono influenzare la forma delle particelle attraverso pieghevoli e legame tra peptidi25dell'idrogeno. Peptidi che piega attraverso l'interazione di β-foglio sono stati indicati per formare micelle allungate, mentre α-elica conferma può formare entrambe micelle sferiche e allungata22,23,24, 25,26,27. Linker di polietilenglicole (PEG) che lo scudo la carica superficiale del peptide può essere collocato tra il peptide idrofilo e la coda idrofobica di PAMs, migliorare la disponibilità della nanoparticella in circolazione sistemica28, 29 , 30 , 31. PAMs sono vantaggiose anche perché sono biocompatibili e hanno dimostrati di avere una vasta gamma di applicazioni32,33. La solubilità in acqua delle micelle offre un vantaggio sopra altri sistemi basati su nanoparticelle come certe nanoparticelle polimeriche che non sono solubili in acqua e devono essere sospese in res per iniezioni34. Inoltre, la possibilità di creare PAMs smontare in risposta a un stimoli specifici rende PAMs un attraente candidato per controllato di farmaci intracellulari di consegna35.
Legandosi al recettore CCR2 e accumulando nell'arco aortico, PAMs precedentemente sono state sviluppate per monocito targeting per monitorare le diverse fasi delle lesioni aterosclerotiche dell'aorta9. In topi ApoE- / - monocito accumulo aumenta proporzionalmente a placca progressione36. Inoltre, è emerso che i pazienti con placche rottura-incline, fase avanzata contengono una maggiore quantità di monociti37. Pertanto, la modifica di PAMs incorporare MCP-1 è utile perché permette una maggiore specificità targeting e differenziazione tra lesioni aterosclerotiche e tardo-fase iniziale. Questi studi di proof-of-concept anche verificato che PAMs sono abbastanza sicura di essere utilizzato preclinicamente e vengono eliminate per via renale38. Poiché i monociti e infiammazione sono caratteristici di altre malattie, MCP-1 PAMs hanno il potenziale per essere utilizzato per applicazioni terapeutiche e diagnostiche in altre malattie oltre l'aterosclerosi8,39,40 , 41.
Qui, segnaliamo la realizzazione di auto-assemblati e scalabile PAMs di MCP-1 che ha dimostrato la dimensione ottimale della particella, carica superficiale e targeting selettivo di monociti per applicazioni avanzate di imaging nell'aterosclerosi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">1,2-ethanedithiol</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">E0032</td>
			<td style="width:259px;">for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mL disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-898</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89401-566</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC165200050</td>
			<td>for MALDI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25 mL disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-900</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">2-Mercaptoethanol, 50 mM</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31350010</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable serological pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-896</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">75 cm2 culture flask</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-680-65</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">75 mL reaction vessel</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>3000005</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-wells cell culture plate</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>40101-346</td>
			<td>for MTS assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A998SK-4</td>
			<td>for HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass, 1 dram</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>for PAM synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosillicate glass pipet, Long tips</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542B</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Cy5 amine</td>
			<td style="width:147px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab146463</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Diethyl ether, ACS grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E138-1</td>
			<td>for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable syringes, 20 mL</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-54</td>
			<td>for HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Double neubauer ruled hemocytometer</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>63510-13</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">DSPE-PEG(2000) amine</td>
			<td>Avanti</td>
			<td style="width:119px;">880128P</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">DSPE-PEG(2000) maleimide</td>
			<td>Avanti</td>
			<td style="width:119px;">880126P</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DSPE-PEG(2000)-NHS ester&#160;</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-DSNS-10K</td>
			<td>for conjugation to Cy5</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium-high glucose</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796-500ML</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438026</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-A</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-RBF</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-NT</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-CT</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-QT</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-I</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-L</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-KBC</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-F</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PS3-H5-SB</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-TB</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-YB</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>PS3-H5-V</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td style="width:119px;">856013</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid, optima LC/MS grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>for HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Glycerol</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">M152-1L</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hand tally counter</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S90189</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stir bars, egg-shaped</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>58949-006</td>
			<td>for peptide conjugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol, ACS certified</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>for PAM synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTS cell proliferation colorimetric assay kit</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10191-104</td>
			<td>for MTS assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N,N-Dimethylformamide, sequencing grade</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1160-4</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Methylmorpholine</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td>S-1L-NMM</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC416780250</td>
			<td>for fixing cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for various applications</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Peptide synthesis vessel, 25 mL&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CG186011</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Phosphotungstic acid&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A248-25</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piperidine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>P1146-2.5LTGL</td>
			<td>for peptide synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plain glass microscope slide 75 x 25 mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent reservoirs, sterile&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95128093</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Self-closing tweezer</td>
			<td style="width:147px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">515</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEM support film</td>
			<td style="width:147px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">01814F</td>
			<td>for TEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP618-500</td>
			<td>for peptide cleavage and HPLC purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>TCT1533-5ml</td>
			<td>for peptide cleavage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tweezer, general purpose-serrated</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td>231-SA-SE</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WEHI-274.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:119px;">ATCC&#160;CRL-1679</td>
			<td>murine monocyte</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">automated benchtop peptide synthesizer</td>
			<td>Protein Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:259px;">PS3 Benchtop Peptide Synthesizer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#945;- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>476870-2G</td>
			<td>for MALDI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis

L'aterosclerosi è un contributore importante alla malattia cardiovascolare, la principale causa di morte nel mondo, che sostiene 17,3 milioni di vite ogni anno. L'aterosclerosi è anche la principale causa di morte improvvisa e l'infarto miocardico, istigato da placche instabili che si rompono e occludono il vaso sanguigno senza avviso. Modalità di formazione immagine corrente non può distinguere tra placche stabili e instabili che rottura. Micelle di peptide anfifili (PAMs) possono ovviare a questo inconveniente come possono essere modificati con una varietà di molecole che si legano specificamente a tessuto malato di targeting. I monociti sono stati indicati per essere marker precoce di aterosclerosi, mentre il grande accumulo di monociti è associato con le piastre alla rottura incline. Quindi, nanoparticelle che possono mirare monociti possono essere utilizzate per discriminare le diverse fasi di aterosclerosi. A tal fine, qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di monocito-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sono auto-assemblate attraverso sintesi in condizioni blande di forma nanoparticelle di 15 nm di diametro con vicino neutro carica superficiale. In vitro, PAMs sono state trovate per essere biocompatibile e aveva una legame ad alta affinità per i monociti. I metodi descritti nel presente documento mostrano la promessa per una vasta gamma di applicazioni nell'aterosclerosi, nonché altre malattie infiammatorie.

Preparazione di MCP-1 PAM Il motivo di CCR2-legante (residui, 13-35) della proteina di MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] o strapazzato peptide [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] è stato modificato mediante l'aggiunta di un residuo di cisteina su N-terminale. Il peptide di MCP-1 è stato sintetizzato da un metodo di fase solida Fmoc-mediata utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato. Il peptide grezzo è stato purificato mediante HPLC in fase inversa su una colonna C8 ...

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Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Questo articolo presenta un metodo che coinvolge la sintesi e la caratterizzazione delle micelle di amphiphile peptide monocito-targeting e le corrispondenti saggi per verificare la biocompatibilità e capacità la micella di associare ai monociti.

Sintesi del monocito-targeting Peptide Amphiphile micelle per l'Imaging di aterosclerosi

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Views.  University of Southern California. Questo articolo presenta un metodo che coinvolge la sintesi e la caratterizzazione delle micelle di amphiphile peptide monocito-targeting e le corrispondenti saggi per verificare la biocompatibilità e capacità la micella di associare ai monociti.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Ricerca

Bioingegneria

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband rivelatore ottico di ultrasuono per applicazioni Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

A protocol for the preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug loaded 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) micelles is described.

Preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina micelle pro-farmaco

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Sintesi di idrogel con proprietà antivegetative come membrane per la purificazione dell&#39;acqua

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Progettazione e sintesi di un Rack di fisarmonica di DNA riconfigurabile

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Sintesi di nanocluster d'oro a emissione di infrarossi nel vicino infrarosso per applicazioni biologiche

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...