We appreciate the colleagues in Taiwan Cetacean Society, Marine Biology and Cetacean Research Center of National Cheng Kung Univerisy, Farglory Ocean Park, and Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universiy for sample collection. This project was funded by grant to WCY from the Council of Agriculture of Taiwan (100AS-02.1-FB99).

Etica Dichiarazione: Lo studio è stato eseguito in conformità con le linee guida internazionali e approvato dal Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso degli animali (IACUC) della Nazionale Chiayi University, ID di approvazione: 99022. L&#39;utilizzo di esempio cetaceo è stato consentito dal Consiglio Agricoltura di Taiwan (Research Permesso 100M-02.1-C-99). 1. muscolare preparazione del campione e SDS-PAGE Nota: I campioni muscolari provenienti da 23 specie, tra cui 16 specie di mammiferi marini, 5 specie di mammiferi terrestri, tonno e pollo sono stati utilizzati in questo studio (Tabella 1). I campioni di muscolo di cetacei sono stati ottenuti da individui bloccati, catture accessorie della pesca, e la confisca. Coniglio, ratto, cane e tessuti muscolari pollo sono stati ottenuti da animali diagnostico Centro Nazionale Chiayi University. I campioni di carne di manzo, maiale, agnello, e il tonno sono stati acquistati da un supermercato locale. Il campione di muscolo di Seal Harbor (Phoca vitulina </em&gt;) è stato fornito da Farglory Ocean Park. Sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) è stato usato per separare le proteine ​​solubili con differenti pesi molecolari in campioni di muscolo. <ol><li> Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Pre-cool malta a -20 ° C. Poi mettere 3 g di campione muscolare congelato in esso. </li><li> Omogeneizzare il campione con 10 ml di freddo fosfato salino (PBS) utilizzando un omogeneizzatore tessuto. </li><li> Centrifugare il campione omogeneizzato a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservarlo a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare 5 ml di 5% stacking gel (3,07 ml di acqua distillata, 1,25 ml di 4x tampone di gel superiore pH 6,8, 625 ml di 40% acrilammide, 50 ml di 10% ammonio persolfato (APS), e 5 ml di tetrametiletilendiammina ( TEMED)) e 10 ml di 15% gel di separazione (3,65 ml di acqua distillata, 2,5 ml di tampone di 4x inferiore gel a pH 8.8, 3.75 ml di 40% acrilammide, 100 ml di 10% APS,e 4 ml di TEMED). <ol><li> Nella cella elettroforesi, versare stacking gel (5% acrilammide) sulla parte superiore del gel di separazione (15% acrilammide) alla quale è solidificato. Inserire un pettine gel nel gel di impilamento. </li></ol></li><li> Eseguire pagina in base alle seguenti condizioni: condizione corsa iniziale: 100 volt, 20 min e condizione finale: 120 volt, 40 min. </li><li> Macchia il gel con Coomassie Brilliant Blue a temperatura ambiente per 30 minuti fino a quando il gel è uniformemente colore blu. Nota: La colorazione è completa quando il gel è più visibile nella soluzione colorante. </li><li> Decolorare con soluzione di acido acetico (10%) a temperatura ambiente per 1 ora. Bande inizieranno ad apparire. Continuare la decolorazione a 4 ° C durante la notte fino a quando lo sfondo è chiaro. </li></ol> 2. Peptide Synthesis e monoclonale di produzione <ol><li> Recuperare le sequenze di amminoacidi di Mb da GenBank tra cui il tonno, pollo, struzzo, mammiferi domestici, di tenuta e di 18 speciedei cetacei (Tabella 2). </li><li> Allineare le sequenze utilizzando una corretta software 16: <ol><li> Lanciare l&#39;allineamento Explorer selezionando l&#39;Align: Modifica / Crea allineamento sulla barra di avvio; selezionare Crea nuovo allineamento e fare clic su OK. Apparirà una finestra di dialogo che chiede &quot;State voi costruendo un allineamento di sequenze di DNA o proteine?&quot; </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Protein&quot;; selezionare Data: Open: Recupero sequenze di selezionare il file di sequenza di file e; selezionare l&#39;Edit: Seleziona tutto il comando di menu per selezionare tutti i siti per ogni sequenza nel set di dati per la creazione di un allineamento di sequenze multiple. </li><li> Selezionare Allineamento: Allinea dal ClustalW dal menu principale per allineare i dati di sequenze selezionate utilizzando l&#39;algoritmo ClustalW; selezionare &quot;BLOSUM&quot; come proteine ​​Peso Matrix quindi fare clic sul pulsante OK. </li></ol></li><li> Analizzare l&#39;allineamento di sequenze: <ol><li> Focus su 5 antigenica si reattivaTES 17: 1 sito (AKVEADVA, 15-22), sito 2 (KASEDLK, 56-62), sito 3 (ATKHKI, 94-99), sito 4 (HVLHSRH, 113-119) e il sito 5 (KYKELGY, 145- 151) e trovare il frammento conservato tra i cetacei. Un * (asterisco, simbolo consenso nella allineamento (protocollo 2.2.3)) indica le posizioni che hanno un singolo residuo, completamente conservato. I seguenti frammenti conservati nei cetacei sono stati trovati: sequenza KASEDLKKHG (che include posto 2) e la sequenza HVLHSRHP (che include posto 4). </li></ol></li><li> Sintetizzare frammenti di sequenze candidate secondo l&#39;analisi di sequenza, e coniugato con una proteina ovalbumina (OVA) come proteina carrier utilizzando servizi commerciali. <ol><li> Aggiungere amminoacidi idrofobici (ad esempio, metionina) al N-terminale di antigenico sito reattivo per impedire il peptide dalla decomposizione (ad esempio, M-KASEDLKKHG). </li><li> Prolungare il C-terminale della antigenico sito reattivo per esporre il sito antigenico nucleo al immunocyte. Inoltre, conjucancello il peptide OVA con l&#39;aggiunta di una cisteina (Cys, C) al C-terminale (ad esempio, M-KASEDLKKHG-NTVL-C). </li></ol></li><li> Emulsionare adiuvante completo di Freund per immunogeno 1 o adiuvante incompleto di Freund per immunogeno 2 con un uguale volume di ciascun peptide sintetico in PBS (3 ml, concentrazione finale 30-50 mg / 100 ml). </li><li> Seminare immunogeno 1 (0,1 mg) per via sottocutanea in ciascuna delle 5 femmine topi BALB / c. </li><li> Eseguire iniezioni di richiamo sottocutanee cinque volte utilizzando immunogeno 2 a intervalli di due settimane e raccogliere i sieri a campione clip di coda dei topi prima di ogni richiamo. </li><li> Determinare titolo sieri per la prima proiezione. <ol><li> Sciogliere 100 mg di peptide libera in 25 ml di tampone di reazione e un&#39;aliquota di 50 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml soluzione di accoppiamento di reagente in ogni pozzetto e mescolare il piatto. Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il contenuto del pozzo,lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata, e bloccare la piastra aggiungendo 200 ml di soluzione bloccante. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il contenuto e lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata. </li><li> Eseguire indiretta ELISA (Protocollo 5,1-5,7) per la determinazione sieri titolo per la prima proiezione. Scegliere il mouse con il più alto titolo (più alta densità ottica) per la raccolta della milza. </li></ol></li><li> Tre giorni prima della raccolta della milza, inoculare 0,1 mg di immunogeno 1 per via sottocutanea nel mouse che presenta il più alto titolo. </li><li> Raccogliere le cellule della milza di topi immunizzati selezionati e si fondono con cellule murine mieloma F0 (SP2 / 0-AG14) per ottenere cellule ibridomi per la generazione di mAb 18. </li><li> 14 giorni dopo la fusione, selezionare i cloni positivi per lo screening della reattività dei surnatanti ibridomi verso peptide sintetico gratuitamente utilizzando ELISA indiretto (Protocollo 5,1-5,7). </li><li> Diluire le cellule di un numero adeguato per bene per maximizzione della percentuale di pozzi che contengono solo un singolo clone (diluizione clonazione). <ol><li> Aggiungere 100 ml di terreno di coltura cellulare a tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti tranne pozzetto A1 che viene lasciato vuoto. </li><li> Aggiungere 200 ml di sospensione cellulare per pozzetto A1. Poi trasferire rapidamente 100 ml da A1 a B1 e mescolare pipettando delicatamente. Ripetere questi 1: 2 diluizioni lungo l&#39;intera colonna, e poi scarta 100 microlitri da H1 modo che finisce con lo stesso volume pozzetti sopra di esso. </li><li> Aggiungere ulteriori 100 ml di medio-colonna 1 con una micropipetta a 8 canali. Poi trasferire rapidamente 100 microlitri da ogni pozzetto della colonna 1 a quelle nella colonna 2 utilizzando la stessa pipetta, e mescolare pipettando delicatamente. </li><li> Utilizzando le stesse punte, ripetere questi 1: 2 diluizioni attraverso l&#39;intero piatto. Scartare 100 ml da ciascuno dei pozzi nell&#39;ultima colonna. </li><li> Portare il volume finale di ciascun pozzetto a 200 microlitri aggiungendo 100 microlitri medio in ciascun pozzetto. incubare plate indisturbato a 37 ° C in un umidificata CO 2 incubatore. </li><li> Controllare ogni bene e segnare tutti i pozzetti che contengono solo una singola colonia. Effettuare due o più clonazioni fino&gt; 90% dei pozzetti contenenti singoli cloni sono positivi per la produzione di anticorpi. </li></ol></li><li> Schermo i cloni di western blot e dot blot (protocollo 3,1-4,6). Poi colonie sottocultura dai pozzetti in vasi più grandi per espandere le cellule per ottenere il mAb. Di solito ogni clone viene trasferito in un unico bene in una piastra a 12 o 24 pozzetti. </li><li> Misurare l&#39;affinità tra i mAbs e gli estratti del muscolo di vacca, capra, maiale, cane, coniglio, tonno, pollo, sigillo, e quattro specie di cetacei rappresentativi di western blot e dot blot (protocollo 3,1-4,6). </li><li> Seminare cellule di ibridoma selezionati (fino a 3 x 10 6) per via intraperitoneale in topi per indurre ascite. gonfiore addominale è in genere manifesta entro 7-10 giorni dopo l&#39;iniezione di ibridomi. Raccogliere fluido usando un ago ipodermico(Meno di 20 gauge). </li><li> asciti Centrifuga (10.000 xg per 10 min) per rimuovere le cellule e detriti. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Aggiungere 1 a 20 ml del campione, 15 ml di tampone di legame, e da 3 a 5 ml di tampone di eluizione in colonna G Sepharose proteina. Raccogliere la frazione di eluizione contenente anticorpo purificato dal liquido ascitico topi. </li><li> Determinare la isotipo anticorpale dal kit isotyping anticorpi utilizzando le istruzioni del produttore. </li></ol> 3. Western Blot <ol><li> Preparare tampone di caricamento 2x contenente β-mercaptoetanolo (BME) mescolando 950 ml di tampone campione 2x Laemmli con 50 ml di BME. Diluire il surnatante muscolari (protocollo 1.1-1.4) in tampone di caricamento con rapporto adeguato per ottenere buoni segnali: 1:50 (cetacei e foche) e 1: 5 (animali domestici e tonno) quando si utilizza l&#39;anticorpo Mb policlonale di coniglio anti-umano, e 1: 1 (maiale, coniglio, pollo e tonno), 1: 5 (di mucca, capra e cane), e 1:25 (cetacei e il sigillo) quando unntibody è da ibridoma surnatante. </li><li> campione di calore a 95 ° C per 5 min. Caricare i campioni nei pozzetti di gel SDS-PAGE (4% acrilammide impilamento e il 12% di acrilammide separazione) insieme con marcatori di peso molecolare. Eseguire il gel per 5 minuti a 50 V quindi aumentare la tensione di 150 V per terminare la corsa in circa 1 ora. </li><li> Porre il gel in tampone di trasferimento 1x per 15 min. Trasferire la proteina separato per nitrocellulosa (NC) membrane dopo che sono separate da PAGE. Il trasferimento può essere fatto a 100 V per 60-90 min. </li><li> Preparare la soluzione bloccante: 1x PBS contenente 0,1% di Tween 20 con 5% latte in polvere senza grassi. Bloccare la membrana NC in 25 ml di soluzione bloccante a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 (PBST). </li><li> Incubare la membrana e anticorpo primario (asciti o ibridoma surnatante) in 10 ml di tampone di diluizione anticorpo diluito con soluzione di saturazione 5% a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare il membrane tre volte ancora con PBST per pulire anticorpi eccessivo. </li><li> Incubare la membrana con fosfatasi alcalina di capra coniugato anti-IgG di topo a 1: 1.250 in soluzione bloccante con agitazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la membrana ancora e incubare in cloruro di fosfato / p-nitroblu tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP / NBT) fosfatasi miscela substrato per 10 a 20 minuti fino a quando lo sviluppo del colore. </li><li> Arrestare la reazione lavando la membrana in numerosi cambi di acqua distillata. </li></ol> 4. Dot Blot <ol><li> Diluire il surnatante muscolari (protocollo 1.1-1.4) in 5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBST con rapporto adeguato per ottenere buoni segnali: 1: 5 per gli animali domestici e tonno, e 1:25 per i cetacei e di tenuta. Spot 5 ml di campioni su una membrana. Minimizzare la zona che la soluzione penetri (solitamente 3-4 mm di diametro) applicando lentamente. </li><li> Essiccare la membrana a temperatura ambiente (ad esempio, &lt;/ Em&gt; in un flusso laminare per 30-60 min), bloccarlo con soluzione bloccante in piastra di Petri per 1 ora a temperatura ambiente, e lavarlo con PBST. </li><li> Incubare la membrana con l&#39;anticorpo primario (mAb da ibridoma supernatante a 1: 10.000 o asciti a 1: 100.000 diluito in soluzione di saturazione 5%) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzare PBST per lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuno per rimuovere l&#39;eccesso di anticorpi, e poi incubare con anticorpo secondario (alcalina capra fosfatasi-coniugato anti-IgG di topo a 1: 1.250 in 5% soluzione di saturazione) per 1 ora a temperatura ambiente . </li><li> Lavare nuovamente la membrana e incubare nella miscela di substrato per la fosfatasi BCIP / NBT entro 10 a 20 minuti fino a quando lo sviluppo del colore. </li><li> Arrestare la reazione lavando la membrana in numerosi cambi di acqua distillata. </li></ol> 5. ELISA indiretto <ol><li> Preparare tampone di lavaggio (0,002 M imidazolo salina tamponata con 0,02% Tween 20). Lavare la piastra 3 volte con il lavaggiocuscinetto tra ogni passo successivo (protocollo 5,2-5,5). </li><li> Preparare 01:25 diluizione supernatanti muscolari (protocollo 1.1-1.4) in tampone di rivestimento. Coat un 96-pozzetti ELISA con 100 microlitri supernatanti diluiti a 4 ° C durante la notte e bloccarlo con tampone di bloccaggio (1% BSA in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 1: 2.000 diluizione del mAb purificata con tampone diluito e aggiungere 100 ml di diluito mAb in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere capra anti-IgG di topo coniugato con perossidasi di rafano (diluizione 1: 200 in tampone diluito) per ulteriore incubazione. </li><li> Aggiungere substrato perossidasi a ciascun pozzetto (100 microlitri / pozzetto) e incubare per 10-15 min. </li><li> Arrestare la reazione enzimatica dalla soluzione di arresto perossidasi (100 l / pozzetto) quando si osserva lo sviluppo del colore. </li><li> Leggere la densità ottica a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. </li></ol> 6. Preparazione di oro colloidale marcato mAb </p&gt; Nota: Il colore della soluzione di oro colloidale, e la miscela deve sempre essere rosso. Regolare il pH, la concentrazione di mAb, velocità di centrifuga quando precipitato nero è notato. I passi 6.1 e 6.2 sono passaggi di ottimizzazione. <ol><li> Aggiungere purificato rilevare mAb (50 ug / ml, 3 ml) a 100 ml di soluzione di oro colloidale con valori di pH variabili da 5-9. Il pH minima che mantiene il colore rosso per due ore è considerato come il pH ottimale. Nota: In questo studio, 0,1 M carbonato di potassio è stato usato per regolare la soluzione a pH 8,0 (pH ottimale) oro colloidale (40 nm). </li><li> Aggiungere varia quantità di purificati rilevare mAb (500 ug / ml, 1-20 microlitri) a 100 ml di soluzione di oro colloidale a pH 8,0. Nota: la concentrazione ottimale in questo studio è di 6 mg / ml (senza precipitato nero). </li><li> Secondo i risultati di cui sopra, aggiungere 60 mg di rilevare purificato mAb goccia a goccia a 10 ml di soluzione di oro colloidale. Emulsionare il composto delicatamente a temperatura ambiente per 10 min. Anno Dominid 2 ml di soluzione al 5% di BSA in PBS (pH 7,4) alla miscela e emulsionare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti per ridurre l&#39;interferenza sfondo. </li><li> Centrifugare la miscela a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante con l&#39;anticorpo coniugato con attenzione e sospendere il pellet risultanti in 4 ml di PBST contenente 1% di BSA e 0,1% Tween 20, e ripetere centrifugazione e sospensioni più volte. </li><li> Sospendere i precipitati finali in 1 ml PBST e conservarlo a 4 ° C fino all&#39;uso. </li></ol> 7. Costruzione di Immune Striscia Nota: la figura 1 mostra la struttura della striscia immunitario. Preparare e assemblare le strisce in un basso di umidità laboratorio condizione ambientale (&lt;20% di umidità relativa) per la durata di conservazione prolungata (&gt; 1 anno). Le dimensioni del pad e membrana sono: coniugato pad 300 mm x 10 mm, tampone assorbente 300 mm x 24 mm, pad campione di 300 mm x 24 mm, NC membrana 300 mm x 25 millimetri, cartone 300mm x 80 mm. <ol><li> Aggiungere la soluzione mAb marcato con oro colloidale dal punto 6.6 con una micropipetta per saturare il pad coniugato e poi asciugare a 37 ° C per 1 ora prima del montaggio. </li><li> Distribuire specifico antigene cattura mAb (500 mcg / ml) sulla zona di test, e coniglio anti-topo IgG (500 mcg / ml) sulla zona di controllo per rilevare mAb sulla membrana NC utilizzando una stampante pipetta o immunostrip. Mantenere la distanza (&gt; 5 mm) tra le due zone per evitare interferenze. </li><li> Incollare il tampone coniugato, tampone assorbente e la membrana NC sul tavolo di montaggio con nastro biadesivo. Nota: Sovrapporre le pastiglie su ciascun lato della membrana NC di circa 2 mm. costruzione striscia inappropriato si tradurrà in una prova incompleta. </li><li> Posizionare il tampone campione sul tampone coniugato (2 mm) e incollarlo sul tavolo di montaggio. </li><li> Creare strisce larghe 6 mm con un taglierino. Imballare le strisce nel sacchetto di alluminio con essiccante, e conservarli a 4 ° C fino all&#39;uso. </li></ol> Prova 8. cross-reattività <ol><li> Omogeneizzare 0,03 g di campione muscolo crudo con 1 ml di PBS (contenente 0,1% BSA) in una provetta da 1,5 ml centrifuga con un bastone di bambù o di rettifica asta. </li><li> Tenere la striscia dalla parte opposta alle aree test e immergere la parte pad campione nel campione per 5-10 min ed osservare direttamente il risultato. <ol><li> Opzionale: Raccogliere 500 microlitri surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga. Nota: questo passaggio è suggerito se il segnale non è evidente quando la striscia viene direttamente impregnato nel supernatante. </li></ol></li><li> Testare vari campioni di muscolo in triplice copia. Nota: Qui abbiamo testato il tonno, pollo, sigillo, 15 specie di cetacei e 5 specie di mammiferi terrestri. </li><li> Hanno cinque ispettori indipendenti ripetono 8.3 per cinque volte, vale a dire, utilizzare 575 strisce in totale. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Utilizzo di un peptide sintetico coniugato alla proteina carrier è notevolmente più efficace rispetto alla sua proteina cognate. Per una tecnica sandwich base, perché il mAb è sviluppato utilizzando epitopi con posizioni relative note, le due mAbs in questo studio non possono interferire con reciproca interazione con l&#39;epitopo antigene bersaglio. Inoltre, la reattività tra proteina nativa e l&#39;anticorpo di topi immunizzati con il peptide sintetico-coniugato potrebbe essere più forte della reattività tra proteina nativa e l&#39;anticorpo prodotto dalla proteina nativa 19. L&#39;uso di coniugati peptide sintetico è quindi consigliato per le procedure di vaccinazione efficaci e la generazione di adeguata mAb anti-peptide. La struttura di una proteina consiste essenzialmente la sequenza di amminoacidi nella catena polipeptidica. Ogni amminoacido ha la sua catena laterale che porta a proprietà specifiche, e cambiando leggermente l&#39;aci amminod sequenza si traduce in cambiamenti della struttura. Poiché peptidi con una lunghezza di 10-20 aminoacidi sono ideali per la preparazione di anticorpi, la lunghezza dei peptidi sintetici (immunogeno) alla regione C-terminale è stato aumentato, per garantire che la regione antigenica nucleo sarebbe riconosciuto. Pertanto, i residui di amminoacidi tra Mbs di vari animali risultanti in diverse strutture epitopi possono essere efficientemente differenziati. Ad esempio, la Figura 3A mostra la struttura peptide menzionato contribuisce a CGF5H9 reagire con forza con i cetacei, ma negativamente con guarnizioni. Un altro esempio è l&#39;affinità distinti verso polli e cani di CGF5H9 sebbene il pollo ha una sequenza identica a quella del cane nel sito antigenico nucleo 2. Ciò indica che la differenza di sequenza nella regione esterna potrebbe portare alla modifica struttura e quindi variabile affinità tra antigene e anticorpo vincolanti. Western Blot, macchia di punti, ed ELISA indiretta sono stati utilizzati inil nostro metodo per lo screening anticorpi monoclonali adatti. Western Blot è ampiamente utilizzato per rilevare proteine ​​specifiche in estratto di tessuti o omogeneizzato. In questa tecnica, gel elettroforesi viene usata per separare le proteine ​​denaturate dalla lunghezza del polipeptide. Pertanto, è possibile confermare se il segnale indica il peso molecolare prevedeva proteina. Tuttavia, il risultato di rilevamento (segnale positivo o negativo, forte o debole), non può aver rappresentato la situazione reale di antigene-anticorpo vincolanti poiché sono stati utilizzati proteine ​​denaturate. Di conseguenza, dot blot può essere utilizzato per lo screening di secondo stadio. Dot blot è una tecnica per rilevare le proteine. Esso rappresenta una semplificazione del metodo di Western Blot. In dot blot, una miscela contenente la molecola da rilevare è applicato direttamente su una membrana con un punto. Questo differisce da una macchia occidentale perché campioni di proteine ​​non sono denaturate. Si noti che questa tecnica offre alcuna informazione sulle dimensioni della biomolecola bersaglio, e un singolo punto comparirà se due movengono rilevati lecules di diverse dimensioni. Infine, ELISA indiretto viene utilizzato per un saggio di legame ligando-per generare un segnale che può essere adeguatamente quantificata. Esso fornisce ulteriori informazioni su caratteristiche mAb e facilita in tal modo la costruzione di striscia. Le concentrazioni di Mb nel muscolo sono variabili a seconda della posizione di raccolta. Ad esempio, i muscoli di nuoto (muscoli assiali) in cetacei hanno un contenuto significativamente maggiore di Mb rispetto ai muscoli non nuoto, e campioni provenienti da giovani cetacei avrebbero più bassa concentrazione Mb perché all&#39;aumentare della concentrazione di Mb per tutta la vita di un animale 20. Inizialmente, CSF1H13, che cattura solo il Mb di cetacei e foche, era destinato ad essere oro colloidale marcato ed essere il rilevamento degli anticorpi, e CGF5H9, che riconosce il Mb di molte specie, sarebbe anticorpo di cattura sulla linea di prova. Abbiamo ipotizzato che l&#39;anticorpo di rilevamento dovrebbe essere più specifico e l&#39;anticorpo di cattura dovrà seguireessere più generale. Tuttavia, un segnale positivo debole, è stato trovato sulla linea del test, quando sono stati utilizzati campioni di cetacei con basse concentrazioni di Mb (dati non riportati). Il problema è stato risolto quando sono state invertite le posizioni dei due mAbs come descritto nei risultati rappresentativi. Un buon segnale è stato anche mostrato per un cetaceo neonato (un filamento balena di Omura) (Figura 4). Non è chiaro se le caratteristiche e la concentrazione di anticorpi monoclonali contribuiscono a questo fenomeno. In questo studio, i campioni di muscolo congelati-scongelati omogeneizzati con PBS sono stati utilizzati nel test strip. Altre condizioni di campionamento e metodi di preparazione possono influenzare il risultato. Ad esempio, il sale solubile proteine ​​come Mb dovrebbe essere estratto usando PBS piuttosto che l&#39;acqua pura. Altrimenti, l&#39;estrazione può essere insufficiente, che potrebbe portare ad un risultato aberrante. Il tampone di estrazione appropriata: il rapporto campione di carne è in parte responsabile per l&#39;interpretazione di successo del risultato striscia. Grande amount (0,3 g in 1 ml di tampone) dei campioni di controllo (ad esempio, gli animali domestici) potrebbe causare risultato positivo e sfondo sfocato. Tuttavia, il rapporto utilizzato in questo studio (1: 0,03) ha prodotto risultati corretti. Solo campioni di muscolo fresche possono essere utilizzati per questo test strip. Proteina potrebbe essere idrolizzato o denaturare dopo alcuni trattamenti (come indurimento da salsa di soia e di ebollizione), che potrebbero causare risultati positivi non solo per campioni muscolari cetacei ma anche campioni provenienti da altri animali (dati non mostrati). Pertanto, si suggerisce che le fonti di campioni variabili e diversi piani di progettazione di costruzione devono essere utilizzati durante lo sviluppo della striscia. In conclusione, questo protocollo descrive lo sviluppo di due anticorpi monoclonali fortemente reattivi al Mb di cetacei, e questi anticorpi monoclonali vengono applicati su una striscia rapido test per differenziare il Mb di cetacei di tenuta e di altri animali. Sebbene affidabile analisi del DNA basato sulla PCR per l&#39;identificazione di carne cetacei è disponibile 12 ma is laborioso e richiede tempo. La striscia di prova pratica è una tecnica affidabile e rapido che può essere utilizzato nel campo per identificare carni cetacei, che è altamente desiderabile per agenzie di regolazione 21. E &#39;probabile che la striscia può essere sviluppato per rilevare Mbs specifici da animali come cavalli o suini.

Historically, cetacean meat has been consumed in many parts of the world and this consumption continues today1. Due to the trophic level of cetaceans, high levels of mercury and other toxins are known to be present in their meat2. Therefore, the consumption of cetacean meat could lead to a health problem not only for high-risk groups such as pregnant women but also for the general population3. Furthermore, the contamination of cetacean meat with zoonotic or potentially zoonotic pathogens can also occur during its processing and storage4. It is difficult even for experienced agents to identify cetacean meats by their appearance alone. Therefore, a reliable scientific method of identification is required to differentiate cetacean meat from other meats. This would help to limit the consumption of cetacean meat.
Current methods of species identification include molecular techniques and immunological methods. Molecular techniques, such as polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, can be used to identify samples not only from raw meat5 and decomposed samples6 but also from processed foods such as cooked sausage and feedstuffs7,8. Immunological methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), are commonly applied in food production to detect the meat content of, for example, pork9, beef10 and catfish11. PCR-based DNA analysis for the identification of cetacean meat is available12, and has helped prevent the illegal international trade of cetacean meat in Japan, South Korea, the Philippines, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norway, and the United States1. These methods are effective and reliable, but they can take hours or days to complete and involve laborious steps. The identification of cetacean meats is usually based on molecular techniques and there is currently no immunological method available. For regulatory agencies, it is highly desirable to develop a dependable and rapid technique that can be used in the field to identify cetacean meats. 
Immunochromatographic strips are used as detection tools with the advantage of producing rapid result via a simple protocol that is suitable for use in the field. The principles of the immunochromatographic strip and ELISA are very similar, and includes antibodies, antigens and labels. Many different labels such as colloidal gold, carbon and latex have been used in the development of immunochromatographic strips. At present, this method is commonly used for detecting antibiotics, toxin, bacteria and viruses13, but it is rarely used for identifying proteins in meat14,15. Here we propose a lateral-flow chromatographic enzyme immunoassay for rapid detection of cetacean myoglobin (Mb).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1007">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:148px;">J373</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">Protein G HP SpinTrap&#160;</td>
			<td>GE&#160;Healthcare</td>
			<td>28-9031-34</td>
			<td>spin column containing Protein G Sepharose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11493027001</td>
			<td>Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Trans-Blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z613630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody blocker solution&#160;</td>
			<td>LTK BioLaboratories</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:512px;">BCIP/NBT phosphatase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-81-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse</td>
			<td style="width:183px;">KPL</td>
			<td>54-62-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate</td>
			<td>Thermo&#160;Fisher Scientific</td>
			<td>EW-01928-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiskan&#160;EX ELISA reader&#160;</td>
			<td>Thermo&#160;Electron&#160;Corporation</td>
			<td>51118170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloid gold (40 nm) solution&#160;</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>40-50 nm is appropriate for immunostrip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15561-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rapid test immno-strip printer</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td>AGISMART RP-1000&#160;</td>
			<td>Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:512px;">Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&#38;S), conjugate pads (#16S, S&#38;S) and absorbent pads (CF6, Whatman))</td>
			<td>REGA biotechnology Inc.</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freund&#8217;s adjuvant and incomplete Freund&#8217;s adjuvant&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:148px;">F5881, F5506</td>
			<td>Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:512px;">Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Protech</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td>Gel preparation for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:148px;">1610436</td>
			<td>Protein staining in SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laemmli sample buffer and &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:148px;">1610737, 1610710</td>
			<td>Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a colloidal gold-based immunochromatographic test strip for detection of cetacean myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

Caratteristiche anticorpo monoclonale Abbiamo sviluppato due IgG 1 anticorpi monoclonali (CGF5H9 e CSF1H13) riconoscere due peptidi sintetici (MKASEDLKKHGNTVLC e AIIHVLHSRHPAEFGC), rispettivamente, di cetacei Mb, e questi sono stati utilizzati per la costruzione di un panino di tipo striscia reattiva immunocromatografico oro colloidale per la rapida individuazione di Mb di cetacei. la Figura 2 mostra che CGF5H9 rileva cetacei e altri mammiferi come una singola banda macchiato con un peso molecolare previsto di approssimativa 17 kDa. La balena minke comune (Balaenoptera acutorostrata) mostra una banda relativamente più debole rispetto alle bande di altri cetacei. Bande sono assenti per tonno, polli e foche, mentre una banda di circa 50 kDa si osserva per i suini. Anche se ci sono più bande non specifici per i suini e il tonno, CSF1H13 è altamente specifico perché reagisce solo con i cetacei e foche come una band con un peso molecolare previsto di approssimativa 17 kDa. Balenottera minore solo mostra un forte segnale a 1:10 (dati non mostrati) in assenza di segnale osservato alle 1:25. La figura 2 mostra risultati identici a Dot Blot. La figura 3A mostra che CGF5H9 dimostra segnale positivo per i cetacei, conigli, cani, capre e mucche (valore OD&gt; 3.0); segnale debole positivo per i suini (valore OD = 1.5); segnale negativo per le foche, polli e tonni. La figura 3B mostra che CSF1H13 esprime ad alta affinità verso i cetacei e foche (valore di OD&gt; 3.0). Sia CSF1H13 e CGF5H9 possono reagire fortemente con tutte e quattro le specie di cetacei. Questi quattro specie sono da diverse famiglie (Balenottera minore: Balenotteridi; tursiope: Delphinidae; nano capodoglio: Kogiidae; focena senza derive: Phocoenidae), che indica l&#39;ampia reattività di diverse specie di cetacei. Per la costruzione della striscia, CGF5H9, che riconosce tegli Mbs di cetacei e di altri mammiferi, è oro colloidale-etichettati e usato come anticorpo di rilevazione di legare mioglobina, e CSF1H13 è rivestito sulla linea di prova solo per catturare le Mbs dei cetacei e foche. Pertanto la linea di test è stato progettato per mostrare un segnale positivo quando entrambi anticorpi monoclonali rilevano Mb di cetacei. Poiché il Mb da animali non cetacei può essere rilevata solo da uno di questi due anticorpi monoclonali, la linea di test mostra un risultato negativo quando i campioni di muscolo provenienti da altri animali sono stati testati. La linea di controllo mostra sempre un risultato positivo, perché coniglio anti-IgG di topo lega oro colloidale marcato CGF5H9. Un risultato fallito nella linea di controllo indica che la qualità dei materiali sulla striscia è scarsa. Test Strip La figura 4 mostra le bande di segnale sia a linea di test e la linea di controllo quando sono utilizzati campioni di muscolo di cetacei. Se il campione non è da cetacei, c&#39;è solo una singola banda alla condotta di comando with l&#39;assenza di banda sulla linea di prova. Un risultato positivo può essere osservato direttamente in 5-10 minuti dopo omogeneizzazione 0,03 g di muscolo con 10 ml di PBS contenente 0,1% BSA utilizzando un bastoncino di plastica o bambù e ammollo la striscia nella miscela. Dopo aver testato 15 specie di cetacei e otto specie non cetacei, in triplice copia, la specificità (la percentuale di campioni non cetacei correttamente identificato) e sensibilità (la percentuale di campioni di cetacei correttamente identificati) sono entrambi al 100%. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig1.jpg" /> Figura 1. Progettazione della striscia immunitario. Tutti i componenti sono accuratamente stratificato al carta di supporto di plastica in modo che si sovrappongano. Questo permette ai reagenti e campioni fluiscono attraverso la membrana e il tampone assorbente. T: zona di test. C: zona di controllo. Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al. Rapid striscia oro colloidale immunitarioper la carne dei cetacei restrittivo commercio illegale e il consumo:. implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig2.jpg" /> Figura 2. Western Blot e l&#39;analisi dot blot utilizzando il surnatante ibridoma. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Entrambi i sovranatanti di ibridoma possono rilevare cetacei come una singola banda macchiato con un peso molecolare previsto di approssimativa 17 kDa. MW: balenottera minore, BND: tursiope, DSW: nano capodoglio, FP: focena senza derive, PKW: feresa attenuata, N: PBS (controllo negativo). Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al. Rapid striscia oro colloidale immunitario per ccarne etacean restrittivo commercio illegale e il consumo:. implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig3.jpg" /> Figura 3. ELISA indiretto di estratti muscolari di specie diverse utilizzando anticorpi monoclonali purificati. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Solo i cetacei possono produrre forti segnali positivi in ​​entrambi anticorpi monoclonali. Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al Rapid immunitario striscia di oro colloidale per la carne dei cetacei restrittivo commercio e il consumo illegale:.. Implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53433/53433fig4.jpg" /> Figura 4. Specificità della striscia di oro colloidale immunitario T:. Linea di test. C: linea di controllo. Solo quando sono utilizzati campioni di muscolo di cetacei, i risultati di successo (bande di segnale sia a linea di test e la linea di controllo) possono essere osservati. (A) i campioni non cetacei: 1: Cow. 2: Capra. 3: Pig. 4: Dog. 5: Coniglio. 6: Tuna. 7: pollo. 8: Guarnizione di porto (Phoca vitulina). (B) i campioni Cetacei: 1: Balenottera minore comune (Balaenoptera acutorostrata). 2: di Omura balena (Balaenoptera omurai). 3: Tursiope (Tursiops aduncus). 4: Tursiope (T. truncatus). 5: delfino di Fraser (Lagenodelphis Hosei &lt;/ Em&gt;). 6: Indo-Pacifico delfino megattere (Sousa chinensis). 7: Grampo (Grampus griseus). 8: Pantropical Delfino (Stenella attenuata). 9: Steno Bredanensis (bredanensis Steno). 10: feresa attenuata (Feresa attenuata). 11: pilota a pinne corte balena (Globicephala macrorhynchus). 12: Peponocephala Electra (Peponocephala electra). 13: Nano capodoglio (Kogia sima). 14: pigmeo capodoglio (breviceps K.). 15: neophocaena phocaenoides (phocaenoides Neophocaena). Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al Rapid immunitario striscia di oro colloidale per la carne dei cetacei restrittivo commercio e il consumo illegale:.. Implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53433/53433fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura</a>. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> specie di cetacei </td><td> Le specie non cetacei </td></tr><tr><td> Pigmeo capodoglio (breviceps Kogia) </td><td> Harbor Seal (Phoca vitulina) </td></tr><tr><td> Nano capodoglio (Kogia sima) </td><td> Dog (Canis lupus familiaris) </td></tr><tr><td> Pinne corte Balena pilota (Globicephala macrorhynchus) </td><td> Coniglio (Oryctolagus cuniculus) </td></tr><tr><td> Peponocephala Electra (Peponocephala electra) </td><td> Pig (Sus scrofa) </td></tr><tr><td> Feresa attenuata (Feresa attenuata) </td><td> Capra (Capra hircus) </td></tr><tr><td> Pantropical Delfino (Stenella attenuata) </td><td> Bovini (Bos taurus) </td></tr><tr><td> Tursiope (Tursiops truncatus) </td><td> Di pollo (Gallus gallus) </td></tr><tr><td> Tursiope (Tursiops aduncus) </td><td> Tonno pinna gialla (Thunnus albacares) </td></tr><tr><td> Delfino di Fraser (Lagenodelphis Hosei) </td><td></td></tr><tr><td> Indo-Pacifico delfino megattere (Sousa chinensis) </td><td></td></tr><tr><td> Steno Bredanensis (bredanensis Steno) </td><td></td></tr><tr><td> Grampo (Grampus griseus) </td><td></td></tr><tr><td> Focena senza derive (phocaenoides Neophocaena) </td><td></td></tr><tr><td> Balenottera minore comune (Balaenoptera acutorostrata) </td><td></td></tr><tr><td> Balena di Omura (Balaenoptera Omura i) </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Le specie da cui il muscolo era ColleCTED e testato in questo studio. Specie includono il tonno, pollo, sigillo, 5 specie di mammiferi terrestri e 15 specie di cetacei (4 famiglie). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Specie </td><td> Adesione no. </td></tr><tr><td> Balenottera minore comune (Balaenoptera acutorostrata) </td><td> P02179 </td></tr><tr><td> Balena di pigmeo Bryde (Balaenoptera Edeni) </td><td> Q0KIY2 </td></tr><tr><td> Megattera (Megaptera novaeangliae) </td><td> P02178 </td></tr><tr><td> Balena grigia (Eschrichtius robustus) </td><td> P02177 </td></tr><tr><td> Capodoglio (Physeter macrocephalus) </td><td> P02185 </td></tr><tr><td> Pigmeo capodoglio (breviceps Kogia) </td><td> Q0KIY5 </td></tr><tr><td> Nano capodoglio (Kogia sima) </td><td> P02184 </td></tr><tr><td> Short-beaked delfino comune (Delphinus delphis) </td><td> P68276 </td></tr><tr><td> Pilota con pinne lunghe balena (Globicephala melas) </td><td> P02174 </td></tr><tr><td> Killer whale (Orcinus orca) </td><td> P02173 </td></tr><tr><td> Peponocephala Electra (Peponocephala electra) </td><td> Q0KIY3 </td></tr><tr><td> Pantropical Delfino (Stenella attenuata) </td><td> Q0KIY6 </td></tr><tr><td> Tursiope (Tursiops truncatus) </td><td> P68279 </td></tr><tr><td> Focene (Phocoena phocoena) </td><td> P68278 </td></tr><tr><td> Amazon delfino di fiume (Inia geoffrensis) </td><td> P02181 </td></tr><tr><td> Ziphiidae di Longman (Indopacetus pacificus) </td><td> Q0KIY9 </td></tr><tr><td> Hubbs &#39;ziphiidae (Mesoplodon carlhubbsi) </td><td> P02183 </td></tr><tr><td> Zifio (Ziphius cavirostris) </td><td> P02182 </td></tr><tr><td> Harbor Seal (Phoca vitulina) </td><td> P68080 </td></tr><tr><td> Bovini (Bos taurus) </td><td> P02192 </td></tr><tr><td> Capra (Capra hircus) </td><td> B7U9B5.3 </td></tr><tr><td> Cavallo (Equus caballus) </td><td> P68082 </td></tr><tr><td> Pig (Sus scrofa) </td><td> P02189 </td></tr><tr><td> Dog (Canis lupus familiaris) </td><td> P63113 </td></tr><tr><td> Di pollo (Gallus gallus) </td><td> P02197 </td></tr><tr><td> Struzzo (Struthio camelus) </td><td> P85077 </td></tr><tr><td> Tonno pinna gialla (Thunnus albacares) </td><td> P02205 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. sequenze mioglobina utilizzati in questo studio con i relativi numeri di accesso GenBank. Specie includono il tonno,pollo, struzzo, mammiferi domestici, di tenuta e 18 specie di cetacei (7 famiglie). Questa tabella è stata riprodotta da Lo, C. et al Rapid immunitario striscia di oro colloidale per la carne dei cetacei restrittivo commercio e il consumo illegale:. Implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.

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Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

Sviluppo di una striscia reattiva Immunocromatografico oro colloidale-based per il rilevamento di Cetacei mioglobina

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

development-colloidal-gold-based-immunochromatographic-test-strip-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  National Chiayi University. This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Biologia

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Flusso tangenziale Ultrafiltrazione: un metodo &quot;verde&quot; per la selezione del formato e la concentrazione di nanoparticelle di argento colloidale

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...