Gli autori desiderano ringraziare il GWU Harlan Fellowship per il supporto di Paaqua Grant e il GWU Luther Rice Fellowship per il supporto di Mona Herold. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione MCB-1121711.

1. Preparazione di terreni di coltura, strumenti e piatti <ol><li> Contrasta con quattro pinze Alumina pellicola abrasiva. Fate questo sotto un microscopio da dissezione per monitorare la grandezza della punta. Una coppia di pinze serve come back-up in caso di una punta è danneggiata durante la procedura. Autoclavare tutte e quattro le pinze e conservare in un contenitore sterile. </li><li> Fai 500 ml ciascuna di terreno di coltura e di 0,1 X. 1.0X (sia di Marc Ringers Modified [MMR] o modifica di Barth Saline [MBS], ricette in 15) e filtro sterilizzare. Noi abitualmente uso MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2.5 mM NaHCO 3). Conservare a 14-18 ° C per mesi. </li><li> Fare una soluzione al 2% di agarosio in mezzo di coltura (2 g elettroforesi agarosio in 100 ml 1X mezzo di coltura in una bottiglia di vetro con tappo a vite). Autoclave per sciogliere agarosio. Questo può essere conservato a 4 ° C per mesi, e scaldati per liquefare il agarosio quando è necessario successivo. </li><li> Mentre l&#39;agarosio è liquido, versare circa 0,5 ml sul fondo di ciascun pozzetto di una sterile 24-pozzetti cultura. Questo impedisce l&#39;espianti di attaccarsi alla plastica. </li><li> Mentre l&#39;agarosio è liquido, versare circa 2-3 ml sul fondo di due o tre piatti di 60 millimetri Petri, e agitare delicatamente per assicurarsi che il fondo è coperto. Questi risultati serviranno come piatti dissezione e l&#39;agarosio embrioni impedisce di attaccarsi alla plastica una volta che le loro membrane vengono rimossi. </li><li> Quando l&#39;agarosio si è raffreddato e indurito, fiamma la punta di un 6 &quot;pipetta Pasteur finché non si scioglie in un pallone, e leggermente toccare la superficie del agarosio in ciascun pozzetto della piastra di coltura. Ciò creerà una depressione poco profonda in cui l&#39;espianto sarà posto. </li><li> Riempire ogni pozzetto della piastra di coltura con terreno di coltura 1X sterile. </li><li> Quando l&#39;agarosio si è raffreddato e indurito, riempire il piatto dissezione con terreno di coltura diluita (0,1 X. MMR o 0.1X MBS) per facilitare la separazione blastomeri. </li&gt; </ol> 2. Selezione degli embrioni <ol><li> Ottenere uova fecondate e rimuovere la gelatina cappotti secondo protocolli standard 15. Trasferirli 0.5X mezzo di coltura in una capsula di Petri 100 millimetri. </li><li> Quando raggiungono embrioni di 2 cellule stadio, ordinare quelli in cui il solco prima segmentazione biseca l&#39;area leggermente pigmentata nell&#39;emisfero animale (Figura 1) in una piastra separata. Questi saranno i donatori per gli espianti. Tenere le restanti 2-cellule di embrioni in un piatto a parte accanto agli embrioni donatori durante l&#39;intera procedura di servire come controlli di pari livello per mettere in scena gli espianti. </li></ol> 3. Preparazione di espianti <ol><li> Posizionare embrioni 5-10 in un piatto dissezione, ma solo lavorare su un embrione alla volta. </li><li> Posizionare il primo embrione così la membrana vitellina trasparente può essere visto, è separato da uno spazio libero (spazio perivitellino) sopra la superficie del polo animale dell&#39;embrione. Utilizzando una forza affilataps in mano sottodominante (mano sinistra se si è di mano destra), afferrare la membrana vitellina sopra lo spazio perivitellino. Utilizzando una pinza affilate con l&#39;altra mano, afferrare la membrana vicino alla prima punta pinze, e tirare delicatamente in direzioni opposte a sbucciare la membrana di distanza. Effettuare la presa iniziale ad una distanza dalla cella che deve essere sezionato, in modo che la cellula bersaglio non sia danneggiata durante la rimozione della membrana. Si può dire che la membrana è stato rimosso perché l&#39;embrione si appiattisce. </li><li> Afferrare una cella confinante con la pinza in mano sottodominante e utilizzare questa cella come &quot;maniglia&quot; così la cella da dissezionare non è direttamente toccata. Con la pinza in altra parte, tirare delicatamente le cellule rimanenti vicine dal blastomero desiderato. Se le cellule della linea mediana, che condividono lo stesso destino, sono mirati, possono essere rimossi insieme come una coppia. Infine, sezionare via la cella &quot;maniglia&quot;. </li><li> Sollevare il blastomero (o coppia di blastomeri), con una sterile, Vetro pipetta Pasteur, evitando bolle d&#39;aria e di aspirazione eccessiva. La pipetta può essere il fuoco lucidato per eliminare spigoli vivi che possono danneggiare la cellula, ma non di routine farlo. Posizionare la punta della pipetta Pasteur sotto la superficie del terreno di coltura in un pozzetto della piastra di coltura espianto, e delicatamente espellere il blastomero. Dovrebbe scivolare nella depressione poco profonda per gravità. Blastomero stesso da più di un embrione possono essere combinati in un unico espianto. </li><li> Ripetere questa procedura con embrioni rimanenti nel piatto dissezione, uno per uno. Dopo circa 10 embrioni, il piatto dissezione sarà riempita di detriti cellulari. In questo caso, passare a un piatto dissezione fresco. </li><li> Dopo che tutte le dissezioni sono fatti, verificare se gli espianti sono nelle depressioni poco profonde. Se non, possono essere delicatamente spinto nella depressione con un&#39;ansa capelli che è stato sterilizzato in etanolo 70% ed essiccato all&#39;aria. </li><li> Circa un&#39;ora dopo l&#39;ultima dissezione, rimuovere i detriti surrounding espianti guarite con una sterile, vetro pipetta Pasteur. </li><li> Cultura il piatto di espianti a 14-20 ° C vicino alla piastra Petri contenente il fratello, gli embrioni di controllo. Embrioni Sibling indica lo stadio di sviluppo degli espianti blastomeri. </li></ol> 4. Espianti raccolta per l&#39;analisi <ol><li> Raccogliere gli espianti quando i fratelli raggiungono la fase di sviluppo desiderato. Questi espianti sopravvivere abbastanza bene anche se alcune delle cellule disintegrarsi. Pertanto, se vi è una massa nuvoloso cultura bene, esplorare con un&#39;ansa capelli o pinze per determinare se un espianto sano è sepolto all&#39;interno. </li><li> Raccogliere espianti in un piccolo volume di soluzione di coltura con una pipetta Pasteur di vetro, e delicatamente espellerli in un tampone di lisi o fissativo appropriato per il saggio sia condotto. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le fasi più critiche per la coltivazione di successo di singoli blastomeri sono: 1) identificare correttamente il blastomero di interesse; 2) il mantenimento di una sterile, sana cultura; 3) le cellule dissezione presso la parte corretta del ciclo cellulare e 4) a sviluppare la manualità necessaria destrezza per evitare danni durante la dissezione e trasferire alla cultura bene. Per manipolare blastomeri specifici, è essenziale essere in grado di identificare gli assi cardinali. In embrioni di Xenopus, il lato dorsale può essere identificato da tre metodi: (1) che segna il punto di entrata degli spermatozoi con un colorante vitale 18, 19, (2) ribaltamento in vitro uova fecondate e marcatura di un lato 18, 19, o (3) selezione degli embrioni durante la 2-cella stadio in cui il solco prima segmentazione biseca la regione leggermente pigmentata nell&#39;emisfero animale 20, 21. Usiamo il terzo metodo, che identifica con precisione da blastomeri naturalmente fertilizED 16-cellule embrioni in circa il 90% dei casi 20, 21. Alla fecondazione, la pigmentazione emisfero animale comincia a contrarsi verso il punto di entrata sperma sul lato ventrale, causando la regione dorsale animale a diventare meno pigmentata in una maggioranza di embrioni (Figura 1). Si registrano differenze notevoli nella misura di questa regione leggermente pigmentata in frizioni e anche all&#39;interno di frizioni di uova di Xenopus. Se il solco prima segmentazione biseca questa zona chiara equamente tra le due cellule figlie, allora accendino area può essere utilizzata come indicatore del lato dorsale, e il solco prima segmentazione indica il piano sagittale. Se il solco prima segmentazione separa le figlie in una cella buia e una cella luce, non utilizzarlo per l&#39;espianto, perché la pigmentazione in fasi successive non identificare esattamente il lato dorsale. Studi precedenti hanno mostrato che in questi tipi di embrioni solco prima segmentazione rimasto un marcatore per tegli piano sagittale mediano considerando che la regione leggermente pigmentata non è più indicato il lato dorsale 20, 21. Embrioni possono anche essere selezionati prima parte del 4-celle clivaggio (embrione sinistra in Figura 2B), quando il primo e il secondo solchi al polo vegetale può ancora essere distinta, il primo solco dovrebbe essere completa e non secondo il solco ancora completo. Se, tuttavia, si attende la fine del 4 cellule per selezionare embrioni (embrione destra in Figura 2B), la prima e la seconda scissione solchi possono più essere distinti, e le cellule possono essere leggermente pigmentate quelli dorsali in solo 70% di embrioni 20, 21. Questo renderà il targeting blastomeri specifici meno accurato. Va notato che la percentuale di embrioni in cui il solco prima segmentazione biseca la regione leggermente pigmentata varia molto attraverso frizioni. Nella nostra esperienza si può spiegare &lt;50% delle uova in una frizione a&gt; 80% Delle uova in una frizione. Indipendentemente da ciò, ci sono quasi sempre abbastanza uova all&#39;interno di una frizione di uova sane che soddisfano questo criterio di sostenere un esperimento espianto. I due terreni di coltura raccomandati (MMR, MBS) sono praticamente intercambiabili, le preferenze dei diversi laboratori sono per lo più storico. MMR può essere memorizzato come una soluzione 10 volte per un anno o più. MBS ha una durata più breve, perché è tamponato con bicarbonato. Poiché gli embrioni e espianti può soccombere alle infezioni batteriche senza protezione gelatina e membrane vitellina, pinze e terreni di coltura devono essere sterili. Se espianti non sopravvivono bene, antibiotico può essere aggiunto al mezzo di coltura (per esempio, gentamicina 0,1%). Soluzioni contenenti gentamicina hanno una vita breve conservazione, e quindi deve essere fatta fresca nel giorno in cui devono essere utilizzati. Detriti cellulari contiene proteasi che danneggiano gli espianti non protetti, e favorisce la crescita batterica. Pertanto, dovrebbe essere remoestratti dalle pozzetti di coltura, dopo gli espianti hanno avuto la possibilità di guarire. Dissezioni blastomeri sono eseguite in terreno di coltura diluito (0.1X MBS o MMR 0,1 X.) al fine di ridurre la resistenza della cellula-cellula aderenze. Durante le fasi di scissione di Xenopus, l&#39;adesione cellulare è in gran parte compiuta da caderine calcium-/magnesium-dependent. Pertanto, non è necessario utilizzare dissociazione enzimatica: infatti questo dovrebbe essere evitato perché rimuove proteine ​​di superficie che possono essere importanti nella determinazione destino eventi. Poiché le cellule embrionali da diversi lotti di uova aderire con diversi punti di forza, la diluizione del mezzo di dissezione può essere necessario modificare su una base ad hoc. Se le cellule sono troppo aderente a sezionare senza strappare loro, abbassare la concentrazione del mezzo di dissezione gradi da 0,1 X.. Al contrario, se le cellule in pezzi quando la membrana vitellina viene rimosso e sono molto permeabile, aumentare la concentrazione del dissection media graduale. Tuttavia, non utilizzare supporti calcium-/magnesium-free perché le cellule diventano troppo fragili per trasferire ai pozzetti di coltura. Separazione di blastomeri successo dipende anche quando durante il ciclo cellulare uno esegue la dissezione. Come mostrato in figura 2, all&#39;inizio del ciclo cellulare il clivaggio solchi sono bassi e le blastomeri sono appiattite. Successivamente nel ciclo del clivaggio solchi sono più profonde e le cellule sono più arrotondate. All&#39;inizio del ciclo cellulare, ci sono ponti citoplasmatici che causano perdite citoplasmatica in caso di rottura. Pertanto, le cellule sono più facilmente sezionato ritardo nel ciclo cellulare. 4 cellule, embrioni di 8 cellule, embrioni e cellule vegetali in tutte le fasi sono più difficili da analizzare, perché i ponti citoplasmatici persistere più a lungo. Si può prevedere un alto tasso di morte per questi espianti, cioè si ha la necessità di eseguire più dissezioni per recuperare una dimensione ragionevole del campione. Si può attendere l&#39;inizio del solco scissione successiva per iniziare la diffuction di queste cellule per garantire che i ponti citoplasmatici sono chiusi. Mentre blastomeri singolo tratto dal 8 - e 16-cellule embrioni sopravvivono bene nella cultura, nella nostra esperienza più anziani blastomeri meno bene come singole cellule. Anche se non si conosce la causa di questo, la sopravvivenza degli anziani espianti blastomeri possono essere migliorate dissezione più (2-6) del blastomero stesso da embrioni diversi e coltura insieme in una sola cultura ben 10, 13, 14. Questa procedura richiede un po &#39;di pratica e destrezza manuale. Poiché il tempo tra spaccature dipende dalla temperatura, è conveniente immagazzinare embrioni a 14-16 ° C per rallentare scissione e più tempo per eseguire la dissezione. Tuttavia, gli embrioni non tollera temperature inferiori a 14 ° C. La prima sfida in questa procedura è la rimozione della membrana vitellina. Non è meglio passare alla dissezione blastomeri fino a questo primo passo è padroneggiata. Quando dissezioneil blastomero, la cella &quot;manico&quot; rischia di perdere e cadere a pezzi. Questo non è un problema in quanto una volta che tutte le altre celle sono staccato dalla cella desiderata, la cella &quot;maniglia&quot; può essere rimosso con una pinza. I resti maniglia cellule così come altri detriti solito cadere quando il blastomero viene trasferito alla cultura pozzo (Figura 3B). Blastomeri bastone avidamente alla plastica, in modo da utilizzare solo le pipette di vetro per trasferirli. Utilizzare pressione minima succhiare sulla cella perché può disintegrare dalle forze di taglio nella pipetta. Inoltre, evitare bolle d&#39;aria nella pipetta e assicurarsi che la punta della pipetta è sotto la superficie del terreno di coltura quando l&#39;espianto viene espulso perché cellule esploderanno se toccano una interfaccia aria-acqua. Il protocollo descritto nel presente documento utilizza embrioni non manipolata come donatori per gli espianti e media sale semplici per la coltura. Questi permettono di verificare la capacità intrinseca di espianto di exprEss destini particolari. Questo metodo può essere esteso sperimentalmente in due modi. Primo, i mezzi di coltura possono essere integrati con segnalazione / fattori di crescita per verificare se queste molecole possono causare l&#39;espianto di esprimere destini alternativi. Secondo, l&#39;espressione genica degli embrioni donatori possono essere cambiati o iniettando mRNA (guadagno di funzione) o oligonucleotidi antisenso morfolino (perdita di funzione) in precursori specifici prima dissezione blastomero. Questo può essere fatto a 1-cella stadio, o in modo più mirato a 1-2 divisioni cellulari prima dissezione. Con questi metodi, si può verificare se un particolare gene esogeno fornito provoca un blastomero per acquisire un destino alternativo, o se un particolare gene endogeno è necessario per il blastomero di esprimere il proprio destino autonoma (ad esempio, la Figura 4B). Questi sono potenti approcci sperimentali perché eliminano l&#39;influenza confondente delle altre cellule e segnalazione centers presenti nell&#39;embrione intatta.

Xenopus laevis embrioni sono stati utilizzati ampiamente per identificare i meccanismi con cui le cellule embrionali acquisiscono i loro destini, poichè le loro uova sono grandi abbastanza da permettere approcci microchirurgiche. Inoltre, si sviluppano esternamente senza la necessità di integrazione nutrizionale del terreno di coltura in quanto ogni cella contiene una ricca intracellulare di piastrine tuorlo che forniscono un negozio intrinseca energia. Un elemento importante per lo studio dei meccanismi attraverso i quali si determina il destino della cellula è la serie completa di mappe destino dei blastomeri fase a scissione (da 2 - a 32 celle stadi) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Queste mappe sono state costruite da una molecola microinjecting rilevabile in un unico, blastomero identificabile e il monitoraggio in seguito allo sviluppo che i tessuti sono popolate dalla progenie etichetta. Mappe destino consistenti sono possibili perché gli assi cardinali degli embrioni possono essere identificati in molti Embryos. In primo luogo, tutti gli embrioni wild type l&#39;emisfero animale è pigmentata, mentre l&#39;emisfero vegetale non lo è. Secondo, l&#39;ingresso dello spermatozoo nella fecondazione provoca una contrazione della pigmentazione animale emisfero verso il lato ventrale futuro, in molti embrioni una differenza pigmentazione pertanto possono essere utilizzati per discriminare i lati dorsale e ventrale. Terzo, il solco prima segmentazione approssima il piano sagittale nella maggior embrioni, e quindi può essere utilizzato per identificare i lati destro e sinistro del embrione. Le mappe destino si basano anche sul fatto che naturalmente fecondato le uova frequentemente aderire nella schemi regolari che rendono ogni blastomero identificabile attraverso una vasta popolazione di embrioni. Mentre non vi è variabilità all&#39;interno e tra le grinfie di uova in materia di modelli di pigmentazione e scissione, con procedure di selezione descritte nel presente documento consente di cellule con destini prescritti da identificare con circa il 90% di accuratezza. Destini cellulari possono essere dissuadereestratto durante l&#39;embriogenesi da diversi meccanismi. I fattori intrinseci, come differenzialmente ereditati mRNA citoplasmatici o proteine, contribuiscono a diversi aspetti di patterning precoce. Ad esempio, specifici mRNA materni determinare le celle contribuirà alla linea germinale, diventare il endoderma, o contribuire all&#39;asse dorsale del corpo (recensione in 7). I fattori estrinseci forniti a livello locale da parte delle cellule vicine o più distanti da un centro embrionale di segnalazione, sono responsabili di indurre specifici tipi di tessuto ed il modello quasi ogni organo del sistema. Esempi di centri di segnalazione comprendono l&#39;organizzatore / nodo nella gastrula che induce ectoderma neurale e il mesoderma modelli, e la zona di attività polarizzante che il pattern asse anteriore-posteriore del germoglio dell&#39;arto. Sebbene le mappe destino identificare i precursori dei diversi organi e rivelano il percorso di sviluppo adottate dai propri discendenti in embrione normale, non in grado di distinguere tra intrinsecae le influenze estrinseche su tali cellule. Inoltre, non rivelano il potenziale di sviluppo di una cella, i cui discendenti differenziare in un ambiente complesso di segnalazione dell&#39;embrione. Due approcci sperimentali può verificare se il destino di una cellula è determinata da fattori intrinseci o successivamente viene influenzata da fattori esterni: 1) trapianto di cellule in una posizione romanzo nell&#39;embrione, o 2) la rimozione della cellula dall&#39;embrione seguita da coltura in assenza di segnali esogeni. Entrambi gli approcci sperimentali sono realizzabili in Xenopus perché le cellule sono abbastanza grandi da essere separati manualmente. Per esempio, numerosi studi hanno cancellato singole cellule da embrioni (per cambiare interazioni cellula-cellula) o le cellule trapiantate a posizioni nuove in embrioni di accoglienza per verificare i cambiamenti destino (recensione in 7, 8, 9). Inoltre, il secondo approccio di espianto piccolo numero di cellule provenienti da diverse regioni dell&#39;embrione icultura nto di chiarire le interazioni tissutali induttivi in assenza di fattori esogeni è possibile perché le cellule dell&#39;embrione Xenopus sono riempiti con un archivio intracellulare dei nutrienti, le piastrine tuorlo. Pertanto, essi possono essere coltivate per alcuni giorni in un mezzo definito sale senza integrazione nutrizionale o fattore di crescita del mezzo di coltura. Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che blastomeri animali dorsali hanno una capacità autonoma di produrre tessuti mesodermiche neurali e dorsale a causa di ereditarietà materna mRNA 10, 11, e altri hanno dimostrato che le specifiche mesoderma di 32 cellule blastomeri si basa su informazioni sia intrinseco ed estrinseco 12 . Un vantaggio di coltura di cellule come espianti è che il mezzo può anche essere integrato con segnalazione definiti fattori per determinare quale cellula-cellula percorso di comunicazione potrebbe influenzare il destino della cellula espiantato 12, 13, 14. Inoltre, si può iniettare la pr blastomeroior alla cultura con mRNA a un eccesso di esprimere un gene, o con oligonucleotidi anti-senso per evitare la traduzione di mRNA endogeni. Questi, guadagno e perdita di funzione di analisi in grado di identificare le molecole che sono necessarie per un destino autonomamente espressa. Per analizzare il destino della espianto, identificazione di specifici tipi cellulari possono essere eseguite da espressione genica standard (ad esempio, ibridazione in situ, RT-PCR) e saggi di immunocitochimica. Questo protocollo fornisce un semplice, ma potente, modo di distinguere tra i meccanismi intrinseci ed estrinseci che regolano una cellula embrionale si sviluppa nei tessuti specifici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Alumina pellicola abrasiva </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-38 </td><td> Corso (12 micron), per riparazioni importanti consigli di forcipe </td></tr><tr><td> Alumina pellicola abrasiva </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-46 </td><td> Medio (3 micron), per fini affilatura di punte Pinza </td></tr><tr><td> Alumina pellicola abrasiva </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fine (0,3 micron), per la lucidatura di punte Pinza </td></tr><tr><td> Pinza: Dumont, Dumoxel Biologie # 5 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> # 11252-30 </td><td> Questi hanno le punte sottili che non hanno bisogno di affilatura al primo acquisto. Resistente alla corrosione in modo che possanoessere sterilizzati in autoclave. </td></tr><tr><td> Gentamicina soluzione </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Aggiungi ai media il giorno stesso in cui l&#39;uso </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Mappe destino, costruiti lineage tracing tutte le cellule di un embrione, rivelano che i tessuti discendere da ciascuna cellula dell&#39;embrione. Sebbene le mappe destino sono molto utili per identificare i precursori di un organo e per chiarire il percorso di sviluppo da cui le cellule discendenti popolano quell&#39;organo nell&#39;embrione normale, non illustrano il potenziale di sviluppo di una cellula precursore o identificare i meccanismi con cui il suo destino è determinato. Per eseguire il test per l&#39;impegno il destino delle cellule, si confrontano normale repertorio di una cellula di discendenti nell&#39;embrione intatto (la mappa destino) con quelli espressi dopo una manipolazione sperimentale. E &#39;il destino della cellula fissa (impegnato) indipendentemente dall&#39;ambiente circostante cellulare, o è influenzato da fattori esterni, forniti dai suoi vicini? Utilizzando le mappe complete destino dell&#39;embrione Xenopus, si descrive come identificare, isolare e cultura singoli precursori stadio scissione, chiamato blastomeres. Questo approccio permette di valutare se queste cellule precoci sono impegnati nel fato che acquistano nel loro ambiente normale nell&#39;embrione intatta, richiedono interazioni con le loro cellule vicine, o possono essere influenzate esprimere sorti alterne se esposto ad altri tipi di segnali.

La capacità di questo test per valutare con precisione il potenziale di sviluppo della cellula si basa su sezionando il blastomero corretta in base al destino mappe 1, 2, 3, 4, 5, 6. Pertanto, è fondamentale scegliere embrioni con il pattern pigmentazione corrette al 2-cellula fase, come illustrato nella figura 1, che successivamente sono conformi ai modelli di scissione regolari, come illustrato nella figura 2. Se si osservano gli embrioni classificate come non giungono alla fase necessaria scissione e separa gli embrioni che presentano fratture irregolari, la precisione è notevolmente migliorata. Come illustrato in figura 2, fenditure regolari spesso si verificano solo su un lato dell&#39;embrione. Questi embrioni possono essere usati come donatori se la cellula donatrice origina dal lato &quot;normale&quot;. Poiché i modelli scissione regolari si trovano in minor numero di embrioni come procede la divisione cellulare, ordinare circa cinque volte più embrioni di cui hai intenzione di sezionare. Naturalmente fuova ertilized tendono ad avere fratture più regolare nelle uova fecondate in vitro. Anche se i modelli scissione variare molto all&#39;interno di una singola frizione di uova, ci si può aspettare almeno il 10-20% per essere utili per questo tipo di manipolazione. Blastomeri possono essere coltivate da soli o in piccoli gruppi. Quando blastomeri sono sezionati prima (Figura 3A), e trasferiti alla cultura pozzo (Figura 3B, C), sono morbidi e fragili. Nella nostra esperienza, blastomeri animali ed equatoriali sono molto più facili da analizzare e la cultura di blastomeri vegetali (Figura 3C). Forse perché sono più piccoli, sono più facili da trasferire. Sembrano anche guarire più rapidamente quando scalfito con le pinze. Cellule vegetali spesso sembrano completare citochinesi più lentamente e quindi mantenere ponti citoplasmatici con celle gemelle, rendendoli più &quot;leaky&quot; quando sezionato, e la loro membrana cellulare è più fragile e più facile da danni.Dopo circa 1-2 ore di cultura, il blastomero espiantato (s) si sono divisi circa 4 volte e sloughed via la maggior parte dei detriti rimanenti dal danneggiato le cellule vicine (Figura 3D). Dopo 20 ore, formano piccole palline robusti delle cellule (Figura 3E). Mentre alcuni possono essere sepolti in macerie, spesso una massa sano può essere trovato (Figura 3E, a sinistra). Sebbene gli espianti sono piccole, sopravvivono elaborazione per l&#39;ibridazione in situ come pure i più comunemente utilizzati espianti cap animali, che permette di monitorare successivamente l&#39;espressione genica. Nell&#39;esperimento mostrato in Figura 4A, due blastomeri dorsali (D1.1) o due blastomeri ventrale (V1.1) sono stati sezionati a 16-cella stadio e coltivate in 1X MBS a 14 ° C fino embrioni pari livello raggiunto stadi piastra precoce neurali (ST12-13, circa il 20-22 ore dopo dissezione). Ogni campione è stato analizzato per l&#39;espressione di un gene zygotic piastra neurale (Sox2 &lt;/ Em&gt;) con l&#39;ibridazione in situ (il prodotto di reazione blu). Questo test dimostra che la maggioranza dei blastomeri animali dorsali, che sono precursori della piastra neurale, possono esprimere Sox2 autonomamente, cioè senza segnalazione supplementari da altre regioni dell&#39;embrione. Tali espianti che non esprimono Sox2 potrebbe essere stato identificato erroneamente al momento della dissezione. Al contrario, nessuno dei blastomeri animali ventrali, che sono precursori dell&#39;epidermide ventrale, espressa Sox2. Quindi, possiamo concludere che blastomero dorsale animale hanno una capacità intrinseca di formare tessuto neurale, mentre le ventrali blastomeri animali non lo fanno. Si noti che alcuni dei D1.1 espianti hanno eIongated, una morfologia indicativo di formazione mesoderma dorsale; questi blastomeri inoltre sono destinati a formare la notocorda nell&#39;embrione intatta 3, e nella cultura esprimono una proteina marker espianto notocorda 10. Blastomero destini intrinseche può essere altere<html> d da microiniezione prima di mRNA (guadagno di funzione) o oligonucleotidi anti-senso morpholino (MOS, perdita-di-funzione). In Figura 4B, l&#39;effetto di modificare i livelli endogeni di un gene espresso maternamente neurale, foxD5 16, 17, viene testato. Quando il livello endogeno di FoxD5 è stato aumentato iniettando foxD5 mRNA nelle 8 celle blastomeri precursori di V1.1 (riga in basso), la maggior parte degli espianti V1.1 (in coltura per st 12-13) espressa Sox2. Al contrario, quando il livello endogeno di FoxD5 è stato ridotto di iniezione di MO nelle 8 celle blastomeri precursori di D1.1 (riga in alto), solo pochi D1.1 (espianti coltivati ​​a st 12-13) espressa Sox2 (confronta riga superiore della Figura 4A). Questi esperimenti indicano che l&#39;espressione di materna foxD5 gioca un ruolo nella capacità intrinseca di blastomeri dorsali di acquisire un destino neurale. ftp_upload/4458/4458fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Modelli di pigmentazione in 2 cellule di embrioni di uova fecondate naturalmente. Il solco prima segmentazione è indicata da una freccia. A) Un esempio di un embrione che non deve essere usato per identificare blastomeri in fasi successive perché la regione leggermente pigmentata dell&#39;emisfero animale dell&#39;embrione è contenuto principalmente in una cella (a sinistra). Dal momento che il solco prima segmentazione prevede il piano sagittale mediano dell&#39;embrione, la regione leggermente pigmentata di questo embrione non identificherà dorsale. B) Due esempi di embrioni che devono essere ordinati per culture espianto. In entrambi i casi, la regione leggermente pigmentata dell&#39;emisfero animale (*) è diviso in due dal solco prima segmentazione. L&#39;embrione a sinistra è all&#39;inizio del ciclo cellulare prima, e la regione leggermente pigmentata è visibile solo in circa il 25% della superficie cellulare. L&#39;embrione a destra si avvicina alla fine del ciclo cellulare prima, e il pigmento è spostato ventrally così le metà dorsale delle due celle sono più leggeri. Come risultato, in fasi successive le cellule animali leggermente pigmentate predire dorsale (d) e cellule animali cupamente pigmentate predire ventrale (v). <img src="/files/ftp_upload/4458/4458fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esempi di embrioni allo stadio di dissociazione rispetto alle uova fecondate naturalmente. Tutti gli embrioni sono orientate con il polo animale di fronte al lettore, dorsale alla cima. A) 4 cellule embrioni. L&#39;embrione a sinistra è appena entrato nel secondo ciclo cellulare in modo che il taglio solchi sono poco profonde. L&#39;embrione di destra ha quasi completato il secondo ciclo cellulare in modo che il taglio solchi sono più profonde e le cellule appaiono più arrotondati. Frecce nere indicano il solco prima segmentazione, e le frecce rosse indicano il solco scissione secondo. B) 8-cellule embrioni. L&#39;embrione di sinistra è precoce è il ciclo cellulare e l&#39;embrione terzo sulla destra è vicinoalla fine del ciclo cellulare terza. C) 16-cellule embrioni. C &#39;è un esempio di fratture irregolari da evitare. C &quot;è un esempio di fratture regolari sul lato ventrale, ma irregolare sul lato dorsale. C&#39;&#39; &#39;è un altro esempio di fratture regolari sul lato dorsale, ma non sul lato ventrale. C&#39;&#39;&#39;&#39; è un esempio di divisioni regolari sulla linea mediana, ma non lateralmente. D) a 32 celle. embrioni D &#39;è un esempio di divisioni regolari sul lato ventrale, ma irregolari sul lato dorsale. D&#39;&#39; è un esempio di divisioni regolari sulla dorsale lato, ma non sul lato ventrale. D&#39;&#39; &#39;è un esempio di fratture regolari sul lato destro, ma più irregolari fenditure sul lato sinistro. E) 64 unicellulare. Per una rappresentazione schematica di questi stadi, consultare la messa in scena Nieuwkoop e Faber serie, che si trova on-line ( <a href="http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do" target="_blank">http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do</a> ). Espianti Figura 3. Dal 16 cellule di embrioni di uova fecondate naturalmente. A) Un blastomero animale ventrale poco dopo la dissezione. Freccia indica i resti della cellula &quot;manico&quot;. B) Un blastomero animale ventrale trasferiti a un pozzo cultura che ha diviso una volta. C) Un blastomero ventrale vegetale poco dopo la dissezione. Rispetto al blastomeri animali, questi sono più grandi e più difficile da manipolare. D) Due ventrali espianti blastomeri animali, 2 ore dopo la dissezione, hanno diviso circa quattro volte. L&#39;espianto è stato visto da sinistra l&#39;originale, superficie pigmentata esterna del blastomero, l&#39;espianto diritto è visto da quello originale, non pigmentato superficie interna del blastomero. E) Due ventrali espianti blastomeri animali in coltura per 24 ore. L&#39;espianto sinistra è seduto in un letto di detriti cellulari (frecce), mentre l&#39;espianto destra è priva di qualsiasi detrito. Tutte le immagini sono in 50X magnificatione. <img src="/files/ftp_upload/4458/4458fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/4458/4458fig4highres.jpg"/> Figura 4. In situ ibridizzazione analisi di espressione genica in espianti derivati ​​da 16-celle blastomeri dissezionati da uova fecondate naturalmente. A. Il 16 unicellulare sulla sinistra illustra la coppia dorsale blastomero (D1.1) che è stato espiantato per i risultati in nella riga superiore, e la coppia blastomero ventrale (V1.1) che è stato espiantato per i risultati nella riga in basso. Sezionato coppie blastomero da embrioni uninjected stati collocati in MBS 0.1X in pozzetti di coltura e incubate a 14 ° C per circa 20 ore. Sono stati raccolti in provette di fissativo e trattati mediante ibridazione in situ per l&#39;espressione di un gene zygotic neurale, Sox2. Blastomeri B. 8-cellule embrioni allo stadio sono stati iniettati bilateralmente siacon foxD5 MOS, per ridurre l&#39;espressione endogena in blastomeri dorsali, o con foxD5 mRNA per aumentare l&#39;espressione endogena in blastomeri ventrali. Quando gli embrioni iniettati raggiunto il 16-cellula fase (20-30 min più tardi), coppie blastomeri sono stati sezionati, coltura e analizzati mediante ibridazione in situ come in A. Il numero di espianti che esprimono Sox2 è significativamente ridotta in D1.1 espianti che sono stati iniettati con foxD5 MOS (confrontare riga superiore in A). Il numero di espianti che esprimono Sox2 è significativamente aumentata negli espianti V1.1 che sono stati iniettati con foxD5 mRNA (confronta con fila inferiore in A). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4458/4458fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell&#39;embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

Espianti blastomero al test per l&#39;Impegno cellulare Fate durante lo sviluppo embrionale

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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15.2K Views.  The George Washington University. Il destino di una singola cellula embrionale può essere influenzata da molecole ereditarie e / o da segnali provenienti da cellule vicine. Utilizzando mappe destino dell'embrione stadio di segmentazione del Xenopus, singoli blastomeri possono essere identificati per la cultura in isolamento per valutare i contributi di molecole ereditarie rispetto interazioni cellula-cellula.

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Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologia

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Generazione di espianti di blastoderma naïve da embrioni di zebrafish

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparazione di espianti di somite singolo da embrioni di zebrafish

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

Preparazione di espianti di somite singolo da embrioni di zebrafish

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

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Riepilogo

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