The research was supported by the National Research Council (CNR) of Italy. The authors thank GIRE members for collecting seed samples and are grateful to Alison Garside for revising the English.

1. Seed Campionamento e conservazione <ol><li> Monitorare campi coltivati ​​per ingiustificato scarse prestazioni erbicida, cioè non a causa delle condizioni climatiche avverse o per trattamenti erbicidi di bassa qualità. </li><li> Raccogliere un campione di seme da una specie alla volta e assegnare un codice univoco. Semi maturi sono di solito raccolti prima coltivazione raccolta da piante che erano sopravvissute al trattamento erbicida (s). Monitor tempestiva per osservare se i semi sono capannone da pianta madre a maturità. </li><li> Compilare un modulo per ogni campione che indica il codice univoco assegnato, il nome della specie, la data di raccolta, coordinate GPS, comune, il nome del contadino, dimensioni del campo, il livello di infestazione, ritagliare, erbicidi (s), utilizzati durante la stagione e documenti storici del settore . </li><li> Raccogliere semi da almeno 30 piante selezionate casualmente rappresentativi di infestazione campo. Assicurarsi che il campione seme contiene almeno 5.000 semi maturi. Per un obbligati out-cross specie infestanti(Ad esempio, Lolium spp. O Amaranthus spp.), Ridurre il numero di piante per 10-15, mantenendo il numero totale di semi circa 5.000 11. </li><li> Sottocampione il campo se le patch di erbacce sono sparsi su aree di grandi dimensioni (più di un ettaro) sono selezionati come diversi biotipi resistenti agli erbicidi. </li><li> Conservare i semi in sacchetti di carta non sigillati etichettati con il codice univoco assegnato. </li><li> Lasciar evaporare l&#39;umidità, ma non esporre i semi ad alte temperature (ad esempio, evitare di lasciare in una macchina sotto il sole) o alle fluttuazioni di temperatura estreme per evitare l&#39;induzione di dormienza secondaria. </li><li> Clean (rimuovere chaff, semi de-scafo, etc.) e conservarli a temperatura ambiente in un luogo asciutto. Dopo aver condotto il primo test di resistenza, memorizzare i semi per lunghi periodi di tempo in una stanza buia a 4 ° C, preferibilmente in sacchetti di plastica sottovuoto. In questo modo i semi di preservare la loro vitalità per un tempo significativamente più lungo. </li></ol> NOTA: Seed dormienza fornisce un meccanismo flessibile ed efficiente che permette di adattare le erbacce e persistere in ecosistemi agricoli. Per rompere dormienza e consentire la germinazione dei semi, differenti protocolli devono essere utilizzati a seconda delle specie infestanti, cioè il tipo di dormienza 16. Ci sono tre modi principali per rimuovere dormienza: <ol><li> Vernalizzazione NOTA: Per ottenere la germinazione simultanea e l&#39;emergenza delle piantine, un periodo di vernalizzazione seme che vanno da pochi giorni a una settimana è necessario rimuovere la dormienza fisiologica di molte specie: ad esempio., Amaranthus retroflexus, Chenopodium album, Lolium spp, Avena fatua, persicaria Polygonum , Falaride paradoxa 17-19. È richiesto un periodo fino a 15 giorni in più per rhoeas, difformis Cyperus e Ammania coccinea e fino a 30 giorni per Schoenoplectus mucronatus <sup&gt; 20. <ol><li> Metti un po &#39;di acqua deionizzata in piatti di plastica. Tagliate due strati di carta da filtro e ammollo in acqua, rimuovere l&#39;eccesso. Mettere i semi essiccati sulla carta. Trasferire le piastre di plastica per un frigorifero a 4 ° C per il periodo di tempo richiesto. </li></ol></li><li> Scarificazione NOTA: Alcune specie infestanti sono più recalcitranti alla germinazione di altri a causa di dormienza meccaniche, vale a dire le caratteristiche tegumento, e richiedono l&#39;uso di una scarificazione chimica con acido solforico al 21 germinare. <ol><li> Preparare un bicchiere con acido solforico concentrato (95-98%). Preparare un bicchiere pieno d&#39;acqua. Mettete i semi in una busta di tessuto non tessuto. </li><li> Immergere esempio, Echinochloa spp. O sorgo semi halepense per 20 min o 5 min, rispettivamente in acido solforico concentrato. </li><li> Prendere la busta fuori del bicchiere con un paio di pinzette e metterlo nel bicchiere pieno d&#39;acqua. Apri ilbusta, mettere i semi in un piccolo colino e sciacquare abbondantemente con acqua corrente. </li></ol> Variante: A. plantago-aquatica ha bisogno di un diverso protocollo 22, 23 <ol><li> Mettere a bagno i semi per 2 minuti in cloroformio. Risciacquare con acqua deionizzata i semi e asciugarle con carta assorbente. Dunk la semi in 80% di acido solforico per 5 min. </li><li> Mettete i semi in un piccolo colino e sciacquare accuratamente sotto acqua corrente. </li></ol></li><li> Post-raccolta maturazione del seme NOTA: I semi di altre specie infestanti non germinano affatto per alcuni mesi dopo la maturità, a prescindere dal metodo utilizzato per rompere dormienza. <ol><li> Conservare i semi per un periodo di almeno 3-4 mesi a temperatura ambiente e bassa umidità e quindi seguire i protocolli di cui sopra per dormienza rottura (ad esempio, Oryza sativa var. Sylvatica o P. rhoeas). </li></ol></li></ol> 3. Seed Germinazione <ol><li> Semi posto per essere germinated in plaspiatti tic contenenti 0,6% (m / v) di agar con nitrato di potassio 0,1% (KNO 3) ha aggiunto: <ol><li> Preparare una soluzione di agar allo 0,6% + 0.1% KNO 3 con acqua deionizzata. Sciogliere l&#39;agar in un forno a microonde. </li><li> Versare la soluzione di agar in piatti di plastica. Raffreddare il substrato e poi mettere nei semi. </li></ol> Variante: suolo può anche essere usato come substrato in piatti di plastica. Questa pratica è particolarmente efficace per Echinochloa spp., S. halepense e Lolium spp. </li><li> Inserire piatti di plastica in un armadio di germinazione per circa una settimana con condizioni di luce e temperatura a seconda delle condizioni ottimali per ogni specie infestanti. Per la maggior parte delle specie d&#39;inverno, l&#39;escursione termica è 15/25 ° C la notte / giorno e 12 ore fotoperiodo con tubi al neon che forniscono una densità fotosintetica Photon Flux (PPFD) del 15-30 mmol m-2 sec -1. Per molte specie estive, l&#39;intervallo di temperatura è 15/30 ° C notte / giorno. Variante: Some specie, come S. halepense, hanno bisogno di un trattamento termico. Pertanto dopo la scarificazione, semi di S. halepense sono sottoposti alle seguenti condizioni: cicli di 4 ore a 45 ° C e 20 ore a 24 ° C per tre giorni nell&#39;armadietto germinazione, e successivamente tre giorni in condizioni normali. </li></ol> 4. piantina trapianto e crescita <ol><li> Trapianto quindici-venti piantine in vassoi di plastica (325 x 265 x 95 mm) riempito con una miscela standard di invasatura (60% del suolo argilloso limosa, il 15% di sabbia, il 15% e il 10% agriperlite di torba - in volume). NOTA: Trapianto, invece di semina diretta, permette un supporto uniforme piante nella stessa fase di crescita da ottenere, che è un importante prerequisito per ottimizzare le prestazioni del trattamento erbicida. </li><li> Identificare ogni vassoio con un codice a barre comprese tutte le informazioni per l&#39;identificazione univoca: codice popolazione, diserbanti in fase di test, replicare il numero e il numero progressivo del vassoio &lt;./ Li&gt; <li> Luogo vassoi in una serra e piante acquatiche riscaldate come necessario per mantenere il substrato in prossimità o capacità di campo. NOTA: la temperatura di crescita varia a seconda delle specie infestanti. Spesso i test vengono effettuati durante l&#39;autunno / inverno / primavera, quindi la luce è integrata con 400 W lampade a ioduri metallici, che forniscono una PPFD di circa 150 mmol m-2 sec -1 ed un fotoperiodo 12 ore 24, specie 19. Erbaccia estate con C 4 ciclo fotosintetico di solito richiedono maggiore intensità luminosa e, pertanto, le prove sono fatte in primavera-estate in ritardo o l&#39;intensità della luce integrata è di circa 400 mmol m-2 sec -1 con un fotoperiodo 14 hr. </li><li> Utilizzare un protocollo diverso per alcune specie infestanti infestanti risone, ad esempio, A. plantago-aquatica, S. mucronatus e C. difformis come descritto in 22. <ol><li> Trapianti le piantine in vassoi di polistirolo con 24 cellule rotonde (55 mm di diametro, 64 mm di profondità) Filled con 60% terreno argilloso limoso, 30% sabbia e 10% di torba (in volume). </li><li> Impostare i vassoi nei formati 12 cm contenitori di plastica profonde riempite con acqua e battened giù da tondini in acciaio inox avvitate per impedire loro galleggiante (Figura 1). </li><li> Mantenere il livello dell&#39;acqua in contenitori a 1-2 cm sotto il livello della superficie del suolo e aggiungere 1,5 g di solfato di rame per ogni contenitore (che contiene 10-12 L di acqua) per evitare il proliferare di alghe. </li></ol></li></ol> 5. trattamenti erbicidi <ol><li> I trattamenti con erbicidi pre-emergenza: <ol><li> Dopo circa tre giorni nel gabinetto di germinazione, come descritto nella sezione 3, trapiantare i semi germinano in vassoi di plastica contenenti il ​​substrato sopra descritto e coprire con uno strato di terreno (circa 1 cm). Questa è una fase critica per garantire che le piantine non emergeranno per effetto erbicida piuttosto che una profondità di seppellimento eccessivo. </li><li> Prendete il substrato campo capacittà collocando i vassoi, che hanno alcuni fori sul fondo, su piattini pieni d&#39;acqua. </li><li> Un giorno dopo il trapianto, trattare i vassoi con l&#39;erbicida di pre-emergenza 25. </li><li> Mantenere il substrato o la capacità campo vicino aggiungendo acqua se necessario sia dall&#39;alto e dal basso per capillarità dal piattino. Questa procedura favorisce la permanenza dell&#39;erbicida alla profondità corretta (cioè dove i semi germinano sono) per una buona efficacia del trattamento. </li></ol></li><li> I trattamenti con erbicidi post-emergenza: <ol><li> Spruzzi le piante quando raggiungono lo stadio di 2-3 foglie (cioè, la fase di crescita del 12-13 Extended scala crescita BBCH 26). </li><li> A partire dal giorno dopo il trattamento, impostare il sistema di irrigazione secondo le esigenze idriche di specie infestanti e la stagione (ad esempio, per Echinochloa spp. Eroga acqua per 3 min 4 volte al giorno, ad intervalli regolari dalle 9 alle 9 pm). L&#39;acqua è discontribuito con un sistema automatico di irrigazione a pioggia. Variante: glifosato è applicato nello stabilimento fase BBCH 14-21. </li></ol></li><li> Preparazione erbicidi e la distribuzione. NOTA: Tutte le erbicidi (pre e post-emergenza) sono quelle in vigore formulazioni commerciali con tensioattivi raccomandate a due dosi, la dose raccomandata di campo (1x) e tre volte quella (3x). <ol><li> Se necessario, preparare la soluzione tensioattivo di rinfuse secondo le istruzioni riportate sull&#39;etichetta; la concentrazione finale è generalmente espresso come percentuale del volume finale (ad esempio, 0,3%) o il volume da distribuire per unità di superficie (ad esempio, 1 L ha -1). </li><li> Utilizzare la soluzione tensioattivo come solvente per la soluzione erbicidi (soluto) al fine di mantenere la corretta concentrazione del principio attivo. Preparare la soluzione erbicida più concentrata prima (3x). Calcolare la quantità di prodotto commerciale da disciogliere nella soluzione tensioattivo (o in acqua deionizzata se untensioattivo non è necessario) mediante la seguente equazione: Dose erba = [(Dose campo x Dose max) x V def] / V del Dove: Dose erba = dose di erbicida (ml), Dose Dose campo = campo erbicida (ml ha -1), Dose max = massima dose erogata, V fin = volume finale della soluzione (L), V = del volume erogato dalla panchina spruzzatore (L ha -1). </li><li> Diluire (2: 1, v / v) l&#39;erbicida soluzione 3x preparare quella meno concentrata (1x). Questa procedura riduce la possibilità di commettere errori nel valutare o pipettaggio erbicidi. Concentrazione della soluzione Erbicida è espressa come il volume da distribuire per unità di superficie (L ha -1). </li><li> Avviare la sequenza di trattamento con la dose più bassa erbicidi (1x). In questo modo non è necessario lavare l&#39;armadietto di spruzzatura tra due trattamenti con lo stesso erbicida. </li><li> Distribuire il solutio erbicidin utilizzando uno spruzzatore panchina precisione erogare 300 L ha -1 (± 1%), ad una pressione di 215 kPa, e una velocità di 0,75 m sec -1, con un braccio dotato di tre piatti-ventilatore (range esteso) ugelli idraulici . </li><li> Lavare due volte il mobile a spruzzo quando l&#39;erbicida viene modificato con candeggina 1% (v / v) e poi risciacquare. Variante: glifosato è applicata con un volume di spruzzo di 200 L ha -1 27. NOTA: Una particolare attenzione deve essere pagato quando diserbanti altamente biologico, tale il sulfometuron sulfaniluree o flazasulfuron, vengono utilizzati. In quest&#39;ultimo caso effettuare una lavaggio con una soluzione di candeggina e un altro con ammoniaca (2,5% v / v), seguita da un risciacquo accurato con acqua. </li></ol></li></ol> 6. Raccolta e analisi dei dati <ol><li> Attraverso un lettore di codice a barre, che identifica automaticamente ogni vassoio, registrare il numero di piante che sono sopravvissuti al trattamento, nonché la biomassa stimato Visuale (VEB). Le piante sono culonon elaborato come essere morto se non mostrano crescita attiva a prescindere dal colore o l&#39;altro aspetto. <ol><li> Effettuare la valutazione di tre o quattro settimane dopo il trattamento (WAT) a seconda delle erbicidi provati (per es, tre WAT inibitori ACCase e quattro WAT per SLA inibitori o glifosato). </li><li> Valutare l&#39;efficacia generale trattamento includendo una popolazione suscettibile (check S) in tutti gli esperimenti, cioè, una popolazione raccolti in un sito che è stato mai o raramente trattati con erbicidi. </li><li> La sopravvivenza delle piante espresso come percentuale del numero di piante trattate, contato poco prima del trattamento erbicida, e calcolare l&#39;errore standard (SE) per il valore medio (valore delle due repliche media). </li><li> Il VEB è ottenuta attraverso un confronto visivo di biomassa vegetale tra trattato e controllo della stessa popolazione 25, 28 non trattati. Un punteggio, che vanno da 10 a piante non interessati dalla erbicidi (rispetto al controllo non trattato) a 0 quandole piante sono chiaramente morti, è dato a ciascun vassoio trattata. </li></ol></li><li> Popolazioni attribuiscono a quattro categorie sulla base dei risultati ottenuti dai trattamenti con due dosi di erbicidi: S quando meno del 5% delle piante sono sopravvissuti i 1x dosi di erbicidi, SR quando i sopravvissuti variava dal 5% al ​​20% a 1x dosi di erbicidi, R quando più di il 20% delle piante è sopravvissuto alle 1x dosi di erbicidi e RR quando i sopravvissuti sono più del 20% alla dose di erbicida 1x e oltre il 10% alla dose di erbicida 3x 17. </li></ol>

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L., var. sylvatica.) in Clearfield&#174; Italian paddy rice.</a> Agronomy. 2 (4), 371-383 (2012).</li><li>Zelaya, I. A., Anderson, J. A. H., Owen, M. D. K., Landes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+spectrophotometric+and+HPLC+methods+for+shikimic+acid+determination+in+plants:+Models+in+glyphosate-resistant+and-susceptible+crops.">Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: Models in glyphosate-resistant and-susceptible crops.</a> J. Agric. Food Chem. 59 (6), 2202-2212 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Diversi passaggi all&#39;interno dei protocolli sono critici per una valutazione di successo di resistenza agli erbicidi in una popolazione: 1) semi devono essere raccolti quando sono maturi da piante sopravvissute trattamento erbicida (s). Maturazione dei semi sulla pianta madre è fondamentale per evitare difficoltà nella germinazione del seme più tardi; 2) la corretta conservazione dei semi si consiglia di evitare la proliferazione di muffe che potrebbero impedire la germinazione; 3) piantine devono essere trattati allo stadio di crescita destra, come riportato sull&#39;etichetta del pacchetto erbicidi. Bisogna fare attenzione in modo che le piante da trattare hanno raggiunto circa la stessa fase di crescita; 4) le soluzioni erbicidi dovrebbero essere preparate e gestite con accuratezza in modo che le piante sono spruzzate con la corretta concentrazione di principio attivo, pertanto evitando errori non verificabili; 5) dopo ogni trattamento erbicida, si raccomanda di pulire a fondo il mobile a spruzzo e bicchieri utilizzati per preparare le soluzioni per evitarecontaminazione nel successivo trattamento erbicidi, soprattutto quando sono coinvolti erbicidi biologicamente attivi. I protocolli qui presentati possono essere facilmente adattati a una vasta gamma di specie infestanti con le necessarie modifiche a seconda delle specie e diserbanti di interesse. In particolare, i metodi per rompere dormienza dei semi e per la germinazione sono passi che dovrebbe essere riconsiderata per ogni nuova specie infestanti (vedere paragrafi 2 e 3). Nebulizzatori a volte ha bisogno di regolazioni quando si utilizzano diversi erbicidi, per esempio, il glifosato richiede diverse impostazioni del mobile a spruzzo (vedere paragrafo 5.3) e le piante sono trattati in una fase di crescita più tardi con la maggior parte degli erbicidi. Il tempo e lo spazio necessario per eseguire protocolli può essere un fattore limitante e può non essere adatto per i test di routine. Tuttavia, per limitare i costi, può essere utilizzata una sola dose erbicida. In questo modo le informazioni può ancora essere ottenuta se tegli popolazione è resistente. Un potenziale limite dell&#39;approccio è legata al fatto che nessun controllo resistenti sono inclusi negli esperimenti. Infatti, a causa del gran numero di biotipi valutati (cioè, diverse specie e erbicidi coinvolti), molti controlli dovrebbero essere inclusi in ogni esperimento, aumentando così i costi. Tuttavia, i vantaggi rispetto alle tecniche / protocolli alternativi basate su biosaggi vegetali integrali utilizzando una sola dose erbicida 15 sono legati alla maggiore affidabilità e la possibilità di ricavare il livello di resistenza. Più rapide e meno costose test di screening diagnostici sono state anche ideato, in vivo o in vitro (ad esempio, Petri biosaggi piatto 8, prove spettrofotometriche su erbicida enzima bersaglio 29). Tuttavia, essi forniscono solo informazioni qualitative e richiedono un po &#39;di lavoro preliminare, a volte faticoso, per identificare la dose erbicida per discriminare tra respiante Istant e sensibili. I saggi in vitro anche devono essere adattati in base al principio attivo utilizzato.

<html> Gli erbicidi sono la misura diserbo più ampiamente utilizzato, che rappresentano fino al 50% del mercato globale fitosanitari 1. Si tratta di strumenti relativamente a buon mercato, di evitare di suolo pratiche di coltivazione e di tempo ad alta intensità di manodopera, e concludersi con la produzione di costo-efficace, sicuro e redditizio cibo 2. Tuttavia, la grande variabilità genetica fenologica e presente in molte specie infestanti, insieme con un eccessivo affidamento sulla erbicidi, spesso si traduce nella selezione delle popolazioni infestanti resistenti agli erbicidi. L&#39;introduzione di erbicidi selettivi con una specifica destinazione metabolica 3-5 è notevolmente aumentato il numero di casi di resistenza nel tempo. Ad oggi, 240 specie di piante infestanti dicotiledoni (140 e 100) in tutto il mondo monocotiledoni sono evoluti resistenza a diversi siti erbicidi di Azione (SOA) 4. Questa è una grande preoccupazione per la gestione delle infestanti e più in generale per la produzione agricola sostenibile. e_content &quot;&gt; La diagnosi precoce della resistenza, basata su prove attendibili, spesso eseguiti in una serra, è un passo fondamentale per gestire le erbe infestanti resistenti agli erbicidi. Diversi approcci sono stati sviluppati secondo le finalità, richiesto livello di precisione, il tempo e le risorse disponibili, come nonché le specie infestanti considerate 6-12. Tuttavia, quando è richiesta la conferma dello stato di resistenza di un nuovo biotipo infestanti (cioè, un gruppo di individui che condividono alcune caratteristiche fisiologiche, inclusa la capacità di sopravvivere uno o più erbicidi appartenenti ad un particolare gruppo utilizzato in una dose che normalmente li controllo), un robusto tutta saggio biologico impianto deve essere eseguita in un ambiente controllato 4, 11. Un biotipo è raramente resistente a un solo erbicida. Ogni biotipo è quindi caratterizzato da un certo profilo di resistenza, cioè, il numero e il tipo di SoA degli erbicidi è resistente, e da una determinata resistenzalivello per ogni erbicidi 13. La determinazione precoce e affidabile del modello di croce o resistenza multipla 5, 14 è importante per la gestione della resistenza di campo. Vale la pena ricordare che la resistenza agli erbicidi non ha nulla a che fare con la tolleranza naturale che alcuni presentano erbaccia specie nei confronti di alcuni erbicidi, per esempio, dicot specie contro erbicidi ACCase-inibitori, specie monocot vs 2,4-D, equiseto arvense vs. glifosato. Questo articolo presenta un approccio robusto per testare biotipi resistenti agli erbicidi putativo campionati in campi in cui era stato segnalato uno scarso controllo da erbicidi (s). Varianti rilevanti ai protocolli standard in relazione alle specie infestanti coinvolti sono presentati. I vantaggi rispetto alternativi tecniche / protocolli basati su entrambi interi biosaggi vegetali utilizzando soltanto una dose erbicida 15, o semi trattamento in piastre Petri 8 sono legati alla maggiore reliability e la possibilità di ricavare il livello di resistenza a causa dell&#39;inclusione di due dosi erbicidi negli esperimenti. Tuttavia, per la prova di resistenza di routine, gli stessi metodi possono essere applicati a una sola dose erbicida, così riducendo i costi. Oltre a permettere conferma dello status di resistenza, le informazioni ottenute possono essere utilizzate sia per ottimizzare le seguenti operazioni di ricerca e / o elaborare strategie di gestione della resistenza sonori.

<table><tbody><tr><td>Paper bags</td><td>Celcar SAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic dishes</td><td>ISI plast S.p.A.</td><td>SO600</td><td>Transparent plastic</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 95-98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven fabric</td><td>Carretta Tessitura</td><td>Art.TNT17</td><td>Weight 17 g m&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Chloroform &gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Potassium nitrate &gt;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8394</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td>Giganplast</td><td>1875/M</td><td>600 x 400 x 110 mm</td></tr><tr><td>Plastic trays</td><td>Piber plast</td><td>G1210A</td><td>325 x 265 x 95 mm</td></tr><tr><td>Polystyrene trays</td><td>Plastisavio</td><td>S24</td><td>537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)</td></tr><tr><td>Copper sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>Agriperlite</td><td>Blu Agroingross sas</td><td>AGRI100</td><td></td></tr><tr><td>Peat</td><td>Blu Agroingross sas</td><td>TORBA250</td><td></td></tr><tr><td>Germination cabinet</td><td>KW</td><td>W87R</td><td></td></tr><tr><td>Nozzles</td><td>Teejet</td><td>XR11002-VK, TP11001-VH</td><td>The second type of nozzles are used only for glyphosate</td></tr><tr><td>Barcode generator</td><td>Toshiba TEC</td><td>SX4</td><td></td></tr><tr><td>Labels with barcode</td><td>Felga</td><td>TT20200</td><td>Stick-in labels with rounded corners</td></tr><tr><td>Barcode reader</td><td>Cipherlab</td><td>8300-L</td><td>Portable data terminal</td></tr><tr><td>Bench sprayer</td><td></td><td></td><td>Built in house</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Herbicides included in the results:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial product&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Active ingredient&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Altorex</td><td>imazamox</td><td>BASF</td><td></td></tr><tr><td>Azimut</td><td>florasulam</td><td>Dow AgroSciences</td><td></td></tr><tr><td>Biopower</td><td></td><td>Bayer Crop Science</td><td>Surfact to be used with Hussar WG</td></tr><tr><td>Dash</td><td></td><td>BASF</td><td>Surfact to be used with Altorex</td></tr><tr><td>Granstar</td><td>tribenuron-methyl</td><td>Dupont</td><td></td></tr><tr><td>Gulliver</td><td>azimsulfuron</td><td>Dupont</td><td></td></tr><tr><td>Hussar WG</td><td>iodosulfuron</td><td>Bayer Crop Science</td><td></td></tr><tr><td>Nominee</td><td>bispyribac-Na</td><td>Bayer Crop Science</td><td></td></tr><tr><td>Roundup</td><td>glyphosate</td><td>Monsanto</td><td></td></tr><tr><td>Trend</td><td></td><td>Dupont</td><td>Surfact to be used with Granstar and Gulliver</td></tr><tr><td>Viper</td><td>penoxsulam</td><td>Dow AgroSciences</td><td></td></tr><tr><td>Weedone LV4</td><td>2,4-D</td><td>Isagro</td><td></td></tr></tbody></table>

protocols for robust herbicide resistance testing in different weed species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

Per valutare lo stato di resistenza di una popolazione resistente putativo, è fondamentale comprendere un controllo suscettibile nel test per verificare l&#39;efficacia erbicida. I risultati di un test di screening condotto su P. popolazioni rhoeas, un&#39;erba infestante campi di grano, sono riportati in Figura 2, in cui l&#39;efficacia di quattro erbicidi post-emergenza su un assegno suscettibile (09-36) e sul sospetta una resistenza (10-91) sono rappresentati. Popolazione 09-36 è stato completamente controllato dalle ALS inibitore iodosulfuron mentre solo una pianta sopravvissuta dose di 1x delle altre due erbicidi ALS testati, florasulam e tribenuron-metile (Figura 2). Invece, circa il 60% delle piante di popolazione 10-91 sopravvissuto entrambe le dosi di erbicidi iodosulfuron e tribenuron-metile e circa il 50% è sopravvissuto alla dose di 1x florasulam. Questi risultati confermano che la popolazione 10-91 è altamente resistente (RR) per iodosulfuron e tribenuron-metile e resistenti(R) per florasulam. Una risposta diversa è stata osservata con 2,4-D, un erbicida con una dichiarazione di affidabilità diverso (ad esempio, imita auxina endogena), ampiamente usato per controllare le erbe infestanti dicotiledoni nel grano. Solo il 33% delle piante del controllo S sono stati uccisi con questo erbicida a dosi 1x e il valore VEB era&gt; 20% (Figura 2). La mancanza di efficacia sulla popolazione di controllo non conferma se la popolazione 10-91 è resistente a questo erbicida o no. In questo caso è consigliabile eseguire nuovamente l&#39;esperimento e se i risultati sono confermati, per cambiare la popolazione S. Un esempio di un buon controllo del controllo suscettibile è riportato in Figura 3. La Echinochloa spp. popolazione 07-16L è stato completamente controllato da tutti gli erbicidi alla dose raccomandata campo (1x). In questo caso, è possibile affermare che la popolazione 08-42 è altamente cross-resistenti a tutti gli inibitori ALS testati, cioè, azimsulfuron, bispyribac-Na, imazamox e penoxsulam. Il ch non trattatieck di entrambe le popolazioni è riportato a sinistra. Queste piante vengono utilizzati per calcolare la VEB; la quantità di biomassa è stimata visivamente vassoio Vassoio dando un punteggio di 10 per il controllo non trattati e assegnando un punteggio da 0, per la replica senza tessuto vegetale verde, a 10 quando la biomassa è paragonabile al non-trattata controllare (Figura 3). Un altro esempio di output è riportato in Figura 4, dove pianta sopravvivenza Lolium spp. al glifosato è mostrato. Le popolazioni esaminate sono state raccolte in sistemi colturali a base di frumento, dove glifosato sta esercitando pressione selettiva diverso (ad esempio, di tanto in tanto o 1-2 trattamenti all&#39;anno o 3-più volte l&#39;anno). Le piante sono state spruzzate in fase precoce di accestimento (BBCH 14-21) con due dosi di glifosato: 480 e 1440 g ae ha -1, che rappresentano la minima e massima dose raccomandata di campo per infestanti annuali (cioè terofite) a che la crescita stetà. I dati sono stati raccolti quattro settimane dopo il trattamento. Sulla base di entrambi gli esperimenti, sette delle popolazioni esaminate avevano un tasso di sopravvivenza del 80% o più (popolazioni 343, 383, 384, 403, 509, 512 e 537) alla dose più bassa applicata ma solo il 50% delle piante di popolazioni e 403 509 sopravvissero alla dose più alta glifosato. Una popolazione aveva un tasso di sopravvivenza di circa il 40% a 1x dosi, mentre a poche piante della popolazione 509 sopravvissuti alla dose più bassa e la popolazione 508 è stato completamente controllato a qualsiasi dose. In sintesi, questi esperimenti mostrano diversi livelli di resistenza al glifosato che riflettono spesso la storia dei campi di utilizzo erbicidi. Il livello di resistenza glifosato era maggiore per le popolazioni che erano stati trattati con maggiore intensità: cioè, il numero di applicazioni sul campo per anno e numero di anni di pressione selettiva era maggiore. Il protocollo descritto per un erbicida (figura 4) può essere applicato a molti altri aventi diffeaffitto SoA; in questo modo il modello di resistenza di una o più popolazioni può essere determinato. Un esempio di resistenza modello variabilità Echinochloa spp. popolazioni è riportata nella tabella 1. I documenti storici d&#39;uso di erbicidi e di gestione delle colture ottenuto dal contadino indicato che erbicidi ALS-inibitori sono stati l&#39;agente di selezione (ad esempio, penoxsulam o imazamox). La prova di resistenza è stata quindi eseguita con tre ALS-inibitori erbicidi (azimsulfuron, penoxsulam e imazamox) appartenenti a diverse famiglie chimiche, e un erbicida avere un altro dichiarazione di affidabilità, la ACCase-inibizione erbicidi profoxydim. Il controllo sensibili (07-16L) è stato completamente controllato da tutti gli erbicidi testati (Tabella 1). Sono stati individuati tre modelli di resistenza: tredici popolazioni hanno portato ad essere resistente solo agli inibitori SLA, quattro popolazioni hanno portato ad essere resistente solo al profoxydim inibitore ACCase, e tre popolazioni hanno mostrato un multiplo<html> modello di resistenza sia alla profoxydim inibitore ACCase e inibitori SLA. All&#39;interno di ogni modello di resistenza è possibile distinguere diversi biotipi, per esempio, quattro popolazioni resistenti agli inibitori ALS sopravvissuti solo trattamenti con l&#39;azimsulfuron sulfonilurea mentre due popolazioni multiresistenti sopravvissuto trattamento solo con l&#39;azimsulfuron inibitore ALS ma erano piuttosto controllati da penoxsulam e imazamox. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig1.jpg"/> Figura 1. Esempio di C. vassoi di polistirolo difformis, una specie infestanti infestanti risone, esperimento di set-up. sono messi in contenitori di plastica e bloccati da tondini in acciaio inox avvitate per impedire loro di galleggiamento. L&#39;acqua viene mantenuta a 1-2 cm sotto il livello della superficie del suolo per simulare condizioni di risone. Fotografia è stata presa quattro settimane dopo il trattamento.p_upload / 52923 / 52923fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig2.jpg"/> Figura 2. Risposta di due P. popolazioni Papaver di post-emergenza erbicidi. Effetto di iodosulfuron, tribenuron, florasulam e 2,4-D testati alla dose raccomandata campo (1x) e in tre volte che (3x) sulla sopravvivenza delle piante (barre blu) e stima visiva della biomassa ( VEB; barre rosse) del controllo sensibili (09-36) e di una popolazione resistente (10-91). La valutazione è stata fatta quattro settimane dopo il trattamento diserbante. La sopravvivenza delle piante e VEB sono espressi come percentuale del numero di piante trattate e la VEB dei controlli non trattati (%). La linea orizzontale al 20% di sopravvivenza delle piante rappresenta la soglia di discriminazione tra le popolazioni resistenti e suscettibili quando le piante vengono trattate a dosi 1x. Le barre verticalirappresentare errori standard calcolati sulla media dei due repliche. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52923/52923fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig3.jpg"/> Figura 3. I risultati visivi di uno screening su due Echinochloa spp. popolazioni. Il controllo sensibili, 07-16L (S), e la popolazione resistente, 08-42, sono stati testati con quattro SLA inibitori (segnalati sulla destra) in due dosi, 1x e 3x, (riportato in fondo). Per il controllo S solo i risultati di 1x dosi sono riportati, in quanto tutti gli impianti sono stati già controllati a quella dose. Tre esempi di punteggio VEB sono riportati in rosso: 0 = tutte le piante morte, 10 = tutte le piante sopravvissute e la biomassa è paragonabile alla (NT) di controllo non trattati (riportato a sinistra), 5 = biomasse è circa la metà di quello un vassoio di non-trattatacontrollare. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52923/52923fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52923/52923fig4.jpg"/> Figura 4. Percentuale di sopravvivenza delle piante per dieci Lolium spp. popolazioni provate con la sopravvivenza glifosato. Impianto registrata in due esperimenti (blu e bar arancioni per exp. I e II, rispettivamente). I dati sono espressi come percentuale (%) del numero di piante trattate. Due controlli sensibili erano pienamente controllati a dosi 1x e quindi non sono riportati nel grafico. Due dosi sono stati testati, il minimo (1x = 480 g ae ha -1) e massimo (3x = 1.440 g ae ha -1) dosi riportate sull&#39;etichetta del prodotto. La linea orizzontale al 20% di sopravvivenza delle piante rappresenta la soglia discriminante tra le popolazioni resistenti e suscettibili quando le piante erano deliziaed a dosi 1x. Le barre verticali rappresentano gli errori standard calcolati sulla media dei due repliche. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52923/52923fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52923/52923table1.jpg"/> Tabella 1. Stato Resistenza ventuno popolazioni di Echinochloa spp. Controllo Sensibile (07-16L) è riportato in grassetto. I livelli di resistenza sono riportati per ciascuno dei quattro erbicidi testati (un inibitore ACCase, profoxydim, e tre inibitori ALS, azimsulfuron, penoxsulam e imazamox) in base a quattro categorie: S = meno del 5% delle piante sopravvissuto alla 1x dose di erbicida, SR = la sopravvivenza delle piante variava dal 5% al ​​20% a 1x dosi erbicidi, R = oltre il 20% delle piante sopravvissuto alle 1x dosi erbicidi, RR = pianta sopravvivenza era superiore al 20% alla dose di erbicida1x e oltre il 10% alla dose di 3x. Differenti modelli di resistenza sono evidenziati: rosso = resistenza solo inibitore ACCase, giallo = resistenza solo inibitore ALS (s), arancione = resistenza agli inibitori ACCase e almeno un inibitore ALS.

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Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Protocolli per Robust erbicidi Test della resistenza in diversi Weed Specie

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

14.5K Views.  National Research Council (CNR), Italy. A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Ricerca

Genetica

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and &#8211;sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Misurare Tassi di erbicida Metabolismo in Dicot Erbacce con un saggio asportati Foglia

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Ambiente

Protocols for Quantifying Transferable Pesticide Residues in Turfgrass Systems

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes onto humans. For this reason, transferable pesticide residue experiments are required for registration and re-registration by the United States Environmental Protection Agency (USEPA). Although such experiments are required, limited specificity is required pertaining to experimental approach. Experimental approaches used to assess pesticide transfer to humans including hand wiping with cotton gloves, modified California roller (moving a roller of known mass over cotton cloth) and soccer ball roll (ball wrapped with sorbent strip) over three treated turfgrass species (creeping bentgrass, hybrid bermudagrass and tall fescue maintained at 0.4, 5 and 9 cm, respectively) are presented. The modified California roller is the most extensively utilized approach to date, and is best suited for use at low mowing heights due to its reproducibility and large sampling area. The soccer ball roll is a less aggressive transfer approach; however, it mimics a very common occurrence in the most popular international sport, and has many implications for nondietary pesticide exposure from hand-to-mouth contact. Additionally, this approach may be adjusted for other athletic activities with limited modification. Hand wiping is the best approach to transfer pesticides at higher mowing heights, as roller-based approaches can lay blades over; however, it is more subjective due to more variable sampling pressure. Utility of these methods across turfgrass species is presented, and additional considerations to conduct transferable pesticide residue research in turfgrass systems are discussed.

Transferable pesticide residue experiments in turfgrass systems are integral components of human risk exposure assessments. Experimental approaches to measure transferable residues should be adjusted to the human interaction of interest and turfgrass system dynamics. Three transferable pesticide residue protocols are presented and the suitability across three turfgrass systems is discussed.

Protocolli per la quantificazione residui di antiparassitari Valori in Turfgrass Sistemi

Plant canopies in established turfgrass systems can intercept an appreciable amount of sprayed pesticides, which can be transferred through various routes ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium hirsutum) varieties to improve nematode management. Most protocols involve extracting vermiform nematodes or eggs from the cotton root system or potting soil to determine population density or reproduction rate. These approaches are generally time-consuming with a small number of genotypes evaluated. An alternative approach is described here in which the root system is visually examined for nematode infection. The protocol involves inoculating cotton seedling 7 days after planting with vermiform nematodes and determining the number of females attached to the root system 28 days after inoculation. Data are expressed as the number of females per gram of fresh root weight to adjust for variation in root growth. The protocol provides an excellent method for evaluating host-plant resistance associated with the ability of the nematode to establish an infection site; however, resistance that hinders nematode reproduction is not assessed. As with other screening protocols, variation is commonly observed in nematode infection among individual genotypes within and between experiments. Data are presented to illustrate the range of variation observed using the protocol. To adjust for this variation, control genotypes are included in experiments. Nonetheless, the protocol provides a simple and rapid method to evaluate host-plant resistance. The protocol has been successfully used to identify resistant accessions from the G. arboreum germplasm collection and evaluate segregating populations of more than 300 individuals to determine the genetics of resistance. A vegetative propagation method for recovering plants for resistance breeding was also developed. After removal of the root system for nematode evaluation, the vegetative shoot is replanted to allow the development of a new root system. More than 95% of the shoots typically develop a new root system with plants reaching maturity.

Here, a protocol is presented for the rapid non-destructive screening of cotton genotypes for reniform nematode resistance. The protocol involves visually examining the roots of nematode-infected cotton seedlings to determine infection response. The vegetative shoot from each plant is then propagated to recover plants for seed production.

Screening dei genotipi del cotone per la Resistenza ai Nematode Reniforme

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

Quantificazione del potenziale impatto dei prodotti a base di glifosato sui microbiomi

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products are labeled for an individual pest within a particular crop system, chemical control options are limited. Therefore, the same product(s) are used repeatedly and continual selection pressure is placed on the target pest. There are both financial and environmental costs associated with the development of resistant populations. The cost of pesticide resistance has been estimated at approximately $ 1.5 billion annually in the United States. This paper will describe protocols, currently used to monitor arthropod (specifically insects) populations for the development of resistance. The adult vial test is used to measure the toxicity to contact insecticides and a modification of this test is used for plant-systemic insecticides. In these bioassays, insects are exposed to technical grade insecticide and responses (mortality) recorded at a specific post-exposure interval. The mortality data are subjected to Log Dose probit analysis to generate estimates of a lethal concentration that provides mortality to 50% (LC50) of the target populations and a series of confidence limits (CL's) as estimates of data variability. When these data are collected for a range of insecticide-susceptible populations, the LC50 can be used as baseline data for future monitoring purposes. After populations have been exposed to products, the results can be compared to a previously determined LC50 using the same methodology.

This manuscript demonstrates and discusses techniques used to survey pesticide susceptibility and detect resistance to contact and systemic pesticides in arthropod pests.

Saggi biologici per la resistenza di monitoraggio Insetticida

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Biologia

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Medicina

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Caratterizzano Erbivoro meccanismi di resistenza: Spittlebugs su Brachiaria Spp. come esempio

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously applied herbicides has presented the need for additional management methods. Allelopathy is a physiological process that some plant species possess that provide the plant with an advantage over its neighbors. Allelopathic crop varieties would be equipped with the ability to suppress the growth of surrounding competitors, thus reducing potential yield loss due to weed interference. This paper focuses on the construction and operation of a stair-step assay used for the screening of the allelopathic potential of a donor species (Oryza sativa) against a receiver weed species (Echinochloa crus-galli) in a greenhouse setting. The structure described in this paper serves as a stand for the plant samples and incorporates a timed watering system for the accumulation and distribution of allelochemicals. Allelochemicals produced by the plant roots are allowed to flow downward through a series of four pots separately into a collection tank and recycled back to the top plant through electric pumps. This method of screening provides an avenue for the allelochemicals from the donor plant to reach receiver plants without any resource competition, thus allowing quantitative measurement of the allelopathic potential of the selected donor plant. The allelopathic potential is measurable through the height reduction of the receiver plants. Preliminary screening data for the effectiveness of this method demonstrated height reduction in the receiver species, barnyardgrass (E. crus-galli), and thus the presence of allelopathic residues from the donor plant, weedy rice (Oryza sativa).

Repeatable Stair-step Assay to Access the Allelopathic Potential of Weedy Rice Oryza sativa ssp.

Allelopathy has shown promise as a useful supplemental weed control strategy in cropping systems. To determine the allelopathic potential of a desired plant specimen, a stair-step screening method is provided.

Analisi in fase di stadi ripetibile per accedere al potenziale allelopatico del riso erbaceo (Oryza sativa ssp.)

Weed competition contributes significantly to yield losses in cropping systems worldwide. The evolution of resistance in many weed species to continuously ...

Protocolli per Robust erbicidi Test della resistenza in diversi Weed Specie

Riepilogo

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La manipolazione genetica del patogeno per le piante