Questo lavoro è stato sostenuto da un Centro di Ricerca Nazionale Salute e medicina (NHMRC) progetto di sovvenzione a RM

Tutte le procedure sperimentali qui descritte conformi alla Cura e Comitato Etico degli animali di UNSW Australia e sono stati eseguiti in conformità con il Servizio Sanitario Nazionale e il Medical Research Council of Australia regolamenti per la sperimentazione animale. Tutte le procedure di questo protocollo devono essere effettuate in conformità ai requisiti del proprio comitato Animal Care and Ethics. 1. Acetilcolinesterasi istochimica colorazione <ol><li> Preparare la miscela di reazione Acetilcolinesterasi <ol><li> Aggiungere 290 mg di acetiltiocolina ioduro a 200 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB). Mescolare con un agitatore magnetico a 900 rpm. </li><li> Aggiungere 600 mg di glicina sotto continua agitazione. </li><li> Aggiungere lentamente 420 mg di solfato di rame alla miscela di reazione sotto agitazione continua fino a quando il prodotto è completamente sciolto. </li></ol></li><li> Togliere la pelle sulla carcassa animale (ottenuto attraverso la condivisione dei tessuti) facendo incisioninella pelle di un ratto o topo perfuso, afferrando la pelle dalla zona del collo e tirandolo oltre i suoi piedi. Assicurarsi che la fascia che copre ogni muscolo o è rimosso o significativamente forato per garantire un&#39;ampia esposizione delle fibre muscolari alla soluzione di reazione. </li><li> Immergere l&#39;intero corpo o di un arto di interesse nella miscela di reazione e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Lavare la carcassa per 2 minuti in acqua distillata. Nota: In questa fase, i muscoli mostrano una colorazione blu e le piastre terminali del motore (MEP) possono essere visti come punti bianchi. </li><li> Esporre la carcassa ad una soluzione di solfuro di ammonio 10% per 3-5 sec. Nota: Le fibre muscolari saranno ben presto diventano marroni e gli eurodeputati saranno osservabili come punti neri macchiati. Se la reazione avviene troppo rapidamente, e le fibre muscolari sono macchiati troppo buio per distinguere tra i deputati e le fibre muscolari provare utilizzando basse concentrazioni di soluzione di solfuro di ammonio (per esempio, 5%). Il tempo di reazione per ottenere laottimale contrasto tra i deputati e le fibre muscolari varia da un campione all&#39;altro. Pertanto è difficile definire il tempo di esposizione esatta al reagente. La reazione deve essere attentamente monitorata e si fermò quando il contrasto è ritenuto adeguato. </li><li> Lavare la carcassa per due volte, con l&#39;agitazione in acqua distillata e tamponare delicatamente la carcassa secca. </li><li> Fotografia sia gli aspetti laterale e mediale degli arti, assicurando che i deputati europei per tutti i muscoli di interesse vengono catturati. </li></ol> 2. intramuscolare iniezioni alle piastre Motor End <ol><li> Tirare micropipette di vetro con un estrattore micropipetta (l&#39;uso di micropipette graduate con pistoni è consigliato). Con l&#39;aiuto di un microscopio da dissezione, rompere le punte delle micropipette con un paio di pinze in modo tale che il diametro interno del lume della micropipetta è circa 0,5 mm. </li><li> Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici utilizzati sono appena sterilizzati in autoclave e thnella zona chirurgica è sterile. </li><li> Riempire le micropipette con Fluoro-oro (5% in acqua distillata). </li><li> Induce anestetizzare l&#39;animale in una camera di induzione con isofluorano (4% in O 2). Verificare la presenza di riflesso di raddrizzamento e di garantire la sua assenza prima di rimuoverlo dalla camera di induzione. Fissare un cono sul muso del topo e fornire isofluorano (2% in O 2) per il mantenimento dell&#39;anestesia. Pinch dita dei piedi degli animali e toccare delicatamente gli occhi dell&#39;animale per garantire che sia il ritiro del pedale e i riflessi corneali sono assenti. Nota: Una miscela di ketamina e xylazil può essere utilizzato anche (80 e 10 mg / kg, rispettivamente, trasportato via intraperitoneale). La ketamina è un allegato 8 (&quot;Controllo&quot;), di droga e protocolli necessari connessi con l&#39;acquisto, l&#39;uso, lo stoccaggio e lo smaltimento del farmaco dovrà essere rispettato. </li><li> Applicare lubrificante occhio per evitare l&#39;essiccazione degli occhi nel corso del procedimento. </li><li> Shave il tarto argeted e uso garza per pulire la zona rasata con tre scrub alternati di clorexidina e il 70% di alcol. Trasferire l&#39;animale per l&#39;area chirurgica. </li><li> Posto l&#39;animale su un underpad pulito e posizionarla in modo appropriato per garantire un buon accesso al muscolo (s) mirato. </li><li> Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle sopra il muscolo mirato dalla muscolatura sottostante e fare un&#39;incisione nella pelle con le forbici chirurgiche. Assicurarsi che l&#39;incisione è abbastanza grande per esporre completamente i muscoli (s) di interesse. Assicurarsi che vi sia il minimo disturbo per la fascia. </li><li> Utilizzare le fotografie MEP per trasporre mentalmente la posizione e la forma della regione MEP sul muscolo (s). Nota: un pennarello multa potrebbe aiutare a riprodurre la regione eurodeputato dalla fotografia sul muscolo (s) di interesse. </li><li> Eseguire iniezioni multiple lungo la lunghezza della regione MEP (per Fluoro-Gold, 3 o 4 iniezioni di 1-2 ml ogni should essere sufficiente). Pulire delicatamente il muscolo (s) per rimuovere eventuali infiltrazioni. </li><li> Portare le due estremità della pelle incisa ravvicinati con una pinza smussato e chiudere la ferita con clips chirurgiche. Infiltrarsi 0,1 ml Bupivacaine (0,5% in acqua) (o altri anestetici locali) lungo l&#39;intero arco della ferita. </li><li> Spegnere la macchina anestetico fuori e monitorare l&#39;animale fino a quando non è completamente ripreso dall&#39;anestesia. </li><li> Attendere per 14 giorni tra la somministrazione delle iniezioni intra-muscolare e la perfusione degli animali. </li></ol> 3. perfusione <ol><li> Somministrare una dose letale di soluzione di sodio pentobarbitone (es Lethabarb; 150 mg / kg) per l&#39;animale mediante iniezione intraperitoneale. <ol><li> Strettamente monitorare l&#39;animale fino a raggiungere un livello profondo di anestesia, come confermato dall&#39;assenza di ritiro pedale e riflessi corneali. </li></ol></li><li> Posizionare l&#39;animale sulla sua schiena su una tavola di dissezione posto sopra un perfusion lavandino. </li><li> Utilizzare un paio di pinze con le prese dente per sollevare la pelle che ricopre la base dello sterno. Fai una piccola incisione cutanea con un paio di forbici chirurgiche forti immediatamente sotto lo sterno e poi usare il forcipe per afferrare la cartilagine xifoideo dello sterno. Tenendo la cartilagine xifoide, allargare l&#39;incisione su entrambi i lati della cavità toracica, dallo sterno alle ascelle. </li><li> Tagliare il diaframma per esporre il cuore. <ol><li> Iniettare 0.ml di eparina direttamente nella punta del cuore per evitare la coagulazione del sangue. </li><li> Tagliare il vertice per consentire l&#39;inserimento di una cannula nel ventricolo sinistro, e quindi serrare rapidamente la cannula in posizione con l&#39;ausilio di un emostatico. </li><li> Fare un&#39;incisione nell&#39;atrio destro con un paio di forbici fini e iniziare immediatamente la pompa peristaltica. Profumato con 0,1 M PB finché il liquido in uscita dell&#39;atrio è quasi privo di sangue e il colore del fegato diventa marrone chiaro. Poi, profumato con una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) finché l&#39;intero corpo dell&#39;animale diventa rigida. </li></ol></li></ol> 4. cervicale midollo spinale Dissection e preparazione per Istologia <ol><li> Posare la carcassa animale sul suo addome. </li><li> Tagliare la pelle in linea mediana del corpo con un bisturi e rifletterla dalla base del cranio al livello dell&#39;osso iliaco. </li><li> Tagliare e riflettere i muscoli paravertebrali per esporre la parte dorsale della colonna vertebrale. </li><li> Identificare il processo spinoso ossea di Atlante, il secondo segmento cervicale (cioè, C2), e rimuoverlo con un paio di pinze chirurgiche o rongeurs per individuare la radice dorsale sottostante corrispondente. <ol><li> Identificare il diritto radice C2 e colorare con un pennarello permanente. </li><li> Rimuovere il prossimo vertebre uno per uno e contrassegnare le radici dorsali destra con colori alternati (cioè, C2, C4, C6, C8 e può essere colorato in verde e C3, C5, C7, T1 può essere colORed in blu). </li></ol></li><li> Usare un piccolo ago chirurgico (ad es, 30 G ago calibro) per forare delicatamente attraverso la dura copre l&#39;estremità inferiore del midollo spinale. Con la smussatura dell&#39;ago rivolto verso l&#39;alto, sollevare la dura madre dal cavo mentre si muove l&#39;ago rostrally per fare una fessura longitudinale. <ol><li> Riflettere la dura. </li></ol></li><li> Tagliare il trasversalmente midollo spinale in blocchi uno o due segmenti con una nuova lama di bisturi. <ol><li> Lasciare i segmenti del midollo spinale in situ e, per ciascun blocco, fare attenzione un piccolo segno fiducial sul lato sinistro di ciascun blocco con metà strada tra due bisturi radici adiacenti. Assicurarsi che il marchio fiducial è abbastanza profonda attraverso il tessuto da essere visibili dalla faccia ventrale dei blocchi. Trasformare il marchio fiducial con un angolo di circa 45 °, indicando sia anteriormente o posteriormente rispetto alla anatomia animale, per facilitare l&#39;orientamento del segmento tissutale conseguente dissezione. </li></ol></li><li> Raccogliere i singoli blocchi in piccoli flaconi chiaramente etichettate contenenti una soluzione di paraformaldeide (4% in 0.1 M PB) e lasciare a RT O / N. </li><li> Trasferire i blocchi in puliti, bottiglie etichettate chiaramente contenenti una soluzione di saccarosio (30% in 0.1 M PB) e conservare a 4 ° C per almeno due giorni. </li><li> Posizionare i segmenti in crio-stampi e ricoperto con terreno di congelamento dei tessuti. Per la preparazione longitudinale istologica, orientare i blocchi con la parte dorsale rivolto verso l&#39;alto e utilizzare il marchio fiduciale per orientare il blocco nella crio-stampi. </li><li> Congelare le crio-stampi a -20 ° C e tagliare con un criostato in 50 sezioni micron di spessore. Nota: Le sezioni possono essere montati direttamente su vetrini da microscopio adesione e lasciati asciugare O / N. In alternativa, le sezioni possono essere galleggiare in piastre 48 pozzetti riempiti con 0.1 M PB e successivamente montati usando il marchio fiduciale di orientare le sezioni di tessuto nelle diapositive. </li></ol> 5. vertebrale lombare Cord dissezione e preparazione per Istologia <ol><li> Posare la carcassa animale sulla sua schiena. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana lungo l&#39;addome dell&#39;animale e rimuovere le viscere. Sezionare i muscoli della parete addominale posteriore per esporre la parte ventrale della colonna vertebrale. </li><li> Individuare il breve costola caudale-più e la sua adiacente T13 vertebra dove la T13 radice ventrale esce l&#39;osso. <ol><li> Consecutivamente rimuovere uno per uno rostrale due o tre vertebre a T13 (cioè, T12, T11 e, se necessario, T10) con sottili Rongeurs chirurgici per seguire il T13 radice ventrale fino al suo punto di entrata nella parte ventrale del cavo ventrale segnare con un pennarello permanente. </li><li> Da questo punto in poi, ripetere la stessa procedura per identificare la posizione dei punti di ingresso della radice ventrale per L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, li colorazione con colori alternati. </li></ol></li><li> Seguire la stessa procedura descritta nella sezione 4,5-4,10 per lumbar dissezione del midollo spinale. </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il targeting intramuscolare e successivo trasferimento retrograda di transgeni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α per il trattamento sperimentale condizione neuromuscolare non è una nuova strategia. Per esempio, questo metodo di consegna è stato utilizzato per ritardare la degenerazione neuromuscolare in diverse fasi della progressione ALS in topi e ratti 1,9-12 SOD1 nonché nei topi con SMA 13. Mentre promettente, l&#39;efficacia di questi scenari di terapia genica è stata limitata. A questo proposito, si propone che l&#39;assorbimento dei transgeni da spinale neuroni motori cavo potrebbe essere migliorata targeting selettivo delle piastre terminali del motore sulle fibre muscolari. È importante notare che, negli studi sopra menzionati, le iniezioni intramuscolari di vettori virali sono stati eseguiti senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati. Durante le nostre analisi della distribuzione delle piastre terminali del motore(MEP) di arti posteriori e la zampa anteriore, sono emersi alcuni principi. Innanzitutto, la regione MEP estende attraverso l&#39;intera larghezza di un muscolo. Inoltre, i deputati sono costantemente allineati ortogonalmente rispetto alla direzione delle miofibre. In particolare, la regione MEP non è sempre situato nella porzione più spessa del muscolo, un&#39;area spesso denominato &#39;ventre&#39; e che è spesso oggetto di iniezioni intramuscolari bolo. Vale la pena notare che le attuali analisi sono state condotte su C57Bl6 topo 22-23 e il Long Evans ratto 21 e si è riscontrato che la distribuzione dei deputati è conservato all&#39;interno di ciascuno di questi due ceppi di animali. Tuttavia, anche se non la distribuzione MEP è conservata tra i diversi ceppi di animali all&#39;interno della stessa specie ancora da documentare. Originariamente, abbiamo documentato la posizione della regione MEP per diversi muscoli dell&#39;arto anteriore e arti posteriori per guidare piccolo, multiple iniezioni intramuscolari di retrogrado tracciante neuronale Fluoro-Gold. Queste mappe MEP possono essere utilizzati per i transgeni navetta in neuroni motori. In tal caso, tuttavia, è importante regolare il volume di iniezione in funzione del tipo di virus usato (ad es., Adenovirus, lentivirus, etc.) la sua sierotipo così come il suo titolo. Mantenere la fascia intatti è un buon modo per mantenere il virus confinata entro i limiti del muscolo (s) di interesse. Un altro modo per evitare trasfezione spurie dei motoneuroni che innervano i muscoli vicini è quello di pulire la superficie del muscolo dolcemente dopo le iniezioni. Queste precauzioni potrebbero essere irrilevanti in alcuni progetti sperimentali in cui raggiungere elevati livelli di trasduzione potrebbe essere più rilevante che contiene all&#39;interno del pool di motoneuroni che alimentano il muscolo mirato. Tuttavia, essi sono una buona pratica per ovvi motivi di sicurezza. Se hanno bisogno di essere iniettato più di muscoli isolati, potrebbe essere saggio, se possibile, di scegliereun gruppo di muscoli che sono vicini l&#39;uno all&#39;altro per minimizzare la dimensione della incisione cutanea. Ratti e topi hanno la pelle molto allentata (es., Non collegato ai muscoli), quindi è relativamente facile da indirizzare diversi muscoli senza dover eseguire enormi incisioni cutanee. Terapia genica efficace per la SLA e le altre malattie neuromuscolari che utilizzano il meccanismo retrogrado dei neuroni rimane una sfida come, idealmente, tale terapia sarebbe trasferire geni benefici su tutta la popolazione di neuroni motori spinali spinale. Tuttavia, non è necessario per indirizzare tutti i neuroni motori per raggiungere livelli sostenibili di trasduzione se il gene terapeutico di interesse viene codifica una proteina secretoria come un neurotrofine. Motoneuroni Infatti, non trasdotte in prossimità di quelli che sono stati trasdotti sono stati indicati per internalizzare molecole esogene di neurotrofine attraverso un meccanismo paracrino 24. Questo &#39;effetto astante&#39; migliora notevolmente le efficacia di intramuscolare targeting secretoria navetta geni codificanti proteine ​​in corrispondenti motoneuroni. D&#39;altra parte, dato il fatto che la perdita di controllo respiratorio è la causa ultima della morte nella SLA, iniezioni intramuscolari di costrutti virali terapeutici possono essere effettuate in muscoli intercostali 1 o intrapleurally 25 per proteggere i motoneuroni coinvolti nella respirazione. Descrivendo un metodo per evidenziare facilmente la posizione e l&#39;organizzazione dei deputati sui muscoli scheletrici, il presente protocollo si rivelerà uno strumento prezioso per esplorare nuove strategie di terapia genica per disfunzioni neuromuscolari. Questo protocollo fornisce anche un modo minimamente invasivo per preservare l&#39;integrità della giunzione neuromuscolare in queste malattie motoneurone.

La perdita di controllo del movimento volontario che deriva da condizioni neurologiche come la malattia del motoneurone e spinal- nonché Duchenne atrofia muscolare è una condizione debilitante che ha un impatto elevato e duraturo sulla vita quotidiana di individui affetti. Negli ultimi dieci anni, gli sforzi di ricerca volti a fermare o almeno ritardare gli effetti deleteri di queste malattie neuromuscolari è stata una priorità per molti medici e scienziati di tutto il mondo. A questo proposito, la recente generazione di modelli animali che imitano queste malattie neuromuscolari è stato determinante per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi fisiologici alla base dello sviluppo e la progressione di queste condizioni 1-13. Il trattamento di queste malattie neuromuscolari richiede l&#39;accesso diretto al midollo spinale e può essere ottenuto mediante iniezioni spinali 14,15. I recenti progressi nella terapia genica hanno mirato i muscoli striati del superiore earti inferiori a navetta geni terapeutici ai corrispondenti motoneuroni α che si trovano all&#39;interno del corno ventrale del midollo spinale 1,9-13. Tuttavia, questa strategia una volta promettente non è riuscita a migliorare il risultato di queste condizioni neurologiche. Mentre è giusto concludere che questi poveri risultati potrebbero essere, almeno in parte, essere attribuibile alla bassa efficacia di questi geni protettivi, non si può escludere la scarsa efficacia di questi metodi di trasferimento genico. Piastre laterali del motore (deputati) sono regioni specializzate delle miofibre scheletriche che sono rientrati dai terminali degli assoni di fibre motorie periferiche di grandi dimensioni provenienti da α motoneuroni. Insieme, le terminazioni delle fibre nervose periferiche e gli eurodeputati formano la giunzione neuromuscolare, cioè il luogo in cui gli impulsi sinaptici sono attivati ​​dal rilascio anterograda del neurotrasmettitore, l&#39;acetilcolina. È importante sottolineare che il rapporto tra le fibre nervose periferiche e gli eurodeputati è bi-tivazionale, anche se diversi motori sono responsabili per il trasporto di molecole e organelli verso e via dal neurone somata 16-18. Alla luce di queste considerazioni anatomiche, i deputati sembrano essere gli obiettivi di scelta per la consegna e il successivo trasporto retrogrado di materiale genetico alle corrispondenti motoneuroni. In questo contesto, non è sorprendente che il successo del motoneurone trasduzione dipende molto dalla distanza tra l&#39;iniezione intramuscolare di vettori virali e europei del muscolo 19-20. Sorprendentemente, tuttavia, la posizione esatta delle zone MEP sulle miofibre di ratto e topo di laboratorio, le due specie di scelta per modellare malattie neuromuscolari, non erano disponibili fino a poco tempo. Abbiamo prodotto le mappe complete della regione MEP per diversi muscoli degli arti anteriori nel ratto e nel topo 21-22. Più di recente, abbiamo mostrato i dettagli dell&#39;organizzazione del deputato rEgion per diversi muscoli della arti posteriori del mouse 23 e stiamo attualmente analizzando le caratteristiche dei deputati sulla arti posteriori del ratto. Nelle nostre mani, iniezioni intramuscolari di traccianti retrogradi diretti alle intere zone MEP in questi muscoli hanno dato luogo a neuroni motori più marcati che si abbracciano segmenti del midollo spinale di più di quanto precedentemente riportato. Presentiamo qui il protocollo che è stato sviluppato negli ultimi anni per rivelare la posizione dei deputati sulla superficie esterna e per tutto lo spessore e hindlimb forelimb muscoli sia nel topo e nel ratto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Malattie che colpiscono l&#39;integrità dei neuroni motori del midollo spinale sono tra le condizioni neurologiche più debilitanti. Durante gli ultimi decenni, lo sviluppo di diversi modelli animali di questi disturbi neuromuscolari ha fornito alla comunità scientifica con differenti scenari terapeutiche volte a ritardare o invertire la progressione di queste condizioni. Sfruttando la macchina retrograda dei neuroni, uno di questi approcci è stata quella di indirizzare i muscoli scheletrici, al fine di navetta geni terapeutici in corrispondenti motoneuroni del midollo spinale. Anche se una volta promettente, il successo dell&#39;approccio consegna tale gene è stata ostacolata dal numero non ottimale dei motoneuroni trasdotte che finora ha dimostrato di cedere. Piastre terminali Motor (MEP) sono regioni altamente specializzati sulla muscolatura scheletrica che sono in contatto sinaptico diretto al midollo spinale α motoneuroni. A questo proposito, è importante notare che, finora, gli sforzi per retrogradotrasferimento di geni in neuroni motori sono stati effettuati senza riferimento alla posizione della regione MEP nei muscoli mirati. Qui, descriviamo un semplice protocollo 1) per rivelare la posizione esatta dei deputati sulla superficie dei muscoli scheletrici e 2) di utilizzare queste informazioni per guidare la consegna intramuscolare e successivo trasporto retrogrado ottimale di traccianti retrogradi in neuroni motori. Ci auguriamo di poter utilizzare i risultati di questi esperimenti che tracciano in ulteriori studi in indagando trasporto retrogrado di geni terapeutici per spinale neuroni motori cavo attraverso la destinazione dei deputati.

Acetilcolinesterasi colorazione istochimica rivela la posizione delle piastre terminali del motore attraverso l&#39;ampiezza dei muscoli. La Figura 1 illustra i risultati di tale colorazione eseguita su un intero zampa anteriore di ratto. Si suggerisce di ottimizzare la concentrazione della soluzione di solfuro di ammonio (ad es., 5-7% invece del 10%) e il momento in cui il campione viene immerso nella soluzione se lo sfondo non specifico macchie sulle fibre muscolari è troppo eccessiva. figura 2 illustra una colonna di motoneuroni marcate nel midollo spinale cervicale dopo un&#39;iniezione retrograda tracciante neuronale lungo la lunghezza della regione terminale del motore piatto di un mouse tricipite brachiale. I neuroni motori retrogrado etichettati tipicamente formano una colonna longitudinale che si estende su più segmenti del midollo spinale. Figura 3 illustra il diverso numero di etichettate spinale neuroni motori cavo che è stato ottenuto tramite selcace Fluoro-Gold mira della regione placca motrice in tricipiti brachiale. Assorbimento massimo è stato osservato dopo l&#39;erogazione nell&#39;intero arco di regione MEP, al contrario di mira compartimenti specifici della regione MEP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52846/52846fig1.jpg" /> Figura 1: Vista laterale zampa anteriore del ratto dopo Acetilcolinesterasi istochimica colorazione per le piastre Motor End prima (A) e dopo (B) L&#39;esposizione al solfuro di ammonio soluzione. In (A), le piastre terminali del motore sono evidenti come punti punteggiati bianchi che formano una linea continua che attraversa l&#39;intera larghezza del muscolo mentre le fibre muscolari adottano un colore verde-blu. In (B), la stessa forelimb è presentato dopo immersione nella soluzione di solfuro di ammonio. Dopo lo sviluppo della soluzione di solfuro di ammonio, le piastre terminali del motore tunero rn sopra le fibre muscolari marroni. Le frecce in entrambe le parti delle figure indicano la posizione delle piastre di estremità del motore per (1) Acromiotrapezius, (2) Spinodeltoideus e (3) tricipite brachiale. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52846/52846fig2.jpg" /> Figura 2:. Microfotografie di 50 micron sezione longitudinale del ventrale Corno del midollo spinale a livelli cervicali Rivelando Fluoro-oro-marcato Motor Neurons WM rappresenta la sostanza bianca e GM rappresenta la materia grigia del midollo spinale. La linea tratteggiata indica il limite tra la materia grigia e bianca nella sezione del midollo spinale osservato in figura. La microfotografia è stata scattata con un obiettivo 10X sotto il filtro DAPI mentre l&#39;inserto è stata presa con l&#39;obiettivo 20X sotto lo stesso filtro. In entrambi i pannelli, etichettatura Fluoro-oro può essere osservato nel neurone citoplasma motore così come assone prossimale / dendritiprocessi c. Dato relativo originariamente pubblicato nel Tosolini et al. (2013) Targeting la Figura intera delle regioni di targa del motore End nella zampa anteriore del mouse Aumenta l&#39;assorbimento di fluoro-oro in corrispondente Spinal Cord Motor Neurons anteriore. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058 <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52846/52846fig3.jpg" /> Figura 3:. Selective fluoro-Gold Targeting della piastra Regione Motor End nel tricipite brachiale e l&#39;etichettatura conseguente il midollo spinale motore Neuroni (A) è una rappresentazione schematica della posizione dei fondelli motore sulle fibre tricipiti brachiale. Le tre diverse sezioni della regione MEP cui era prevista singolarmente sono rappresentati dai punti verdi, rossi e blu. I puntini verdi e rossi rappresentano anteriore e posteriore metà di tutta la regione eurodeputato, rispettivamente, mentre i punti blu RAPPRESEnt la posizione del bolo di FG nel ventre del muscolo. La freccia a due punte orienta il muscolo in un asse anteriore-posteriore. (B) è un diagramma che illustra l&#39;etichettatura composito ottenuto seguente selettiva il targeting delle diverse sezioni della regione MEP del tricipite brachiale, come indicato in (A). Ogni punto in (B) rappresenta un singolo neurone motore etichettati. La colonna nera rappresentativa etichettatura tipico osservato dopo l&#39;iniezione di FG in tutto l&#39;arco della regione MEP del muscolo. La colonna motoneuroni rosso è ottenuto dopo iniezioni FG nella metà posteriore del muscolo, mentre si ottiene colonna motoneurone verde dopo iniezioni FG nella metà anteriore del muscolo. Iniezioni limitate al &quot;pancia&quot; del muscolo ceduti motoneuroni solo in un piccolo numero di segmenti del midollo spinale, come dimostrato dalla colonna blu. Dato relativo originariamente pubblicareed in Tosolini et al. (2013) Targeting la Figura intera delle regioni di targa del motore End nella zampa anteriore del mouse Aumenta l&#39;assorbimento di fluoro-oro in corrispondente Spinal Cord Motor Neurons anteriore. Neurol. 04:58. doi: 10,3389 / fneur.2013.00058

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

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Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

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Neuroscienze

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Tecnica mini-invasiva per iniezione in Rat nervo ottico

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Funzionale e morfologica Valutazione della membrana innervazione da Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Approccio endoscopico endonasale transfenoidale: Chirurgia mini-invasiva per gli adenomi pituitari

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Analisi Neuroanatomical retrogrado dei motoneuroni frenico in topi

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Modulazione non invasiva e mappatura robotica della Corteccia motoria nel cervello in via di sviluppo

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica

Aplysia californica is a model system for studying the neural control of learning and behavior. This animal has a semi-open circulatory system, making it possible to access many of its internal structures without causing any significant damage. Many manipulations can be easily performed both in vivo and in vitro, making it a highly tractable model for the analysis of behavior and neural circuitry. To better understand the functions of muscles within the feeding grasper, we have developed a technique for lesioning them without opening the main body cavity of the animal or damaging the outer layers of the feeding organ (i.e., the buccal mass). In this technique, the grasper is partially everted, allowing direct access to the musculature. This procedure allows animals to recover quickly and reliably. This has made it possible to lesion the I7 muscles and sub-radular fibers, allowing us to show that both muscles significantly contribute to the opening in vivo.

A Minimally Invasive Lesion Technique for Muscles Intrinsic to the Odontophore of Aplysia californica

Here we present a protocol for minimally invasive surgical lesioning of muscles intrinsic to the feeding apparatus of the marine mollusk Aplysia californica to understand the roles of these muscles during feeding behavior.

Una tecnica di lesione mini-invasiva per i muscoli intrinseca all'odontoia di Aplysia californica

Aplysia californica is a model system for studying the neural control of learning and behavior. This animal has a semi-open circulatory system, making it ...