Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke concedere NS081333 (CMT), Alzheimer sovvenzione dell&#39;Associazione NIRG-10-171.721 e Istituto Nazionale di Salute Mentale concessione MH096702 (UH), e National Institute on Aging, finanziato la ricerca sulle malattie di Alzheimer Center presso la Columbia University di sovvenzione pilota AG008702 (a YYJ e JB).

Nota: Per tutti sperimentazione animale, istituzionale e le linee guida nazionali per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio sono stati seguiti. 1. Preparare Strumenti chirurgici e soluzioni per la chirurgia <ol><li> Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox. </li><li> Preparare 70% di etanolo diluendo 200 prova etanolo assoluto con grado molecolare acqua distillata deionizzata sterile. </li><li> Attaccare l&#39;ago G 29 alla siringa Hamilton. Pulire l&#39;interno della siringa Hamilton e l&#39;ago attraverso l&#39;elaborazione e l&#39;acqua espulsione Nanopure ripetutamente per 1 min. Ripetere questa procedura con il 70% di etanolo. <ol><li> Rimuovere il pistone e l&#39;ago dalla siringa Hamilton. Asciugare le parti in una cappa O / N a flusso laminare. </li><li> Irradiare l&#39;ago e la siringa con la luce ultravioletta per 30 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione salina sciogliendo NaCl in acqua grado molecolare ad un peso finale di concentrazione in volume del 0,9%. SteriliZE la soluzione filtrandola attraverso 0,2 micron filtro pori. </li></ol> 2. Preparare oligomerica Ap 1-42 <ol><li> Monomerize e risospendere ricombinante umana Ap 1-42 in DMSO a 5 mM esattamente come descritto nella pubblicazione di Fa &#39;altri 13. </li><li> Diluire 5mM Ap 1-42 con sterile (1x) PBS a 100 micron per il giorno prima dell&#39;intervento. </li><li> Mescolare bene la soluzione per triturazione. </li><li> Incubare Ap soluzione 1-42 per 12 ore a 4 ° C. Nota: Le soluzioni di controllo come la diluizione DMSO in PBS o strapazzate / retromarcia Ap 1-42 peptide dovrebbe essere preparato allo stesso modo di Ap 1-42. </li></ol> 3. Determinare coordinate iniezione <ol><li> Utilizzare i adulto atlante del cervello mouse per determinare l&#39;esatta antero-posteriore (AP), medio-laterale (ML), e dorso-ventrale (DV) coordina per la regione del cervello di interessi 14. Note: per illustrare la tecnica abbiamo scelto il giro dentato dell&#39;ippocampo, come l&#39;obiettivo con le seguenti coordinate dal bregma: AP, -2.00 mm; ML, ± 1,3 millimetri; DV, -2.2 mm. Il segno negativo che precede il valore AP indica che 2,00 mm posteriormente del bregma. Il segno che precede il valore ± ML indica la direzione a destra ea sinistra dal centro. Infine, il segno negativo che precede la DV indica si sta muovendo ventralmente dalla superficie del cervello. </li></ol> 4. stereotassico Impostazione cornice <ol><li> Indossare una maschera chirurgica faccia, camice da laboratorio pulito, e guanti chirurgici sterili. </li><li> Pulire strumento stereotassico e l&#39;adattatore di mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Adagiare sterile telo chirurgico sul bancone. </li><li> Posizionare lo strumento stereotassico con adattatore mouse sulla parte superiore del telo chirurgico sterile. </li><li> Pulire il rilievo di riscaldamento di mouse con il 70% di etanolo. Posizionare il pad riscaldamento sopra il letto telaio stereotassico. Utilizzare labora general purposetory nastro con etichette su nastro lungo la piastra elettrica sul letto adattatore del mouse. <ol><li> Fissare la piastra elettrica alla pompa ricircolatore acqua calda secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Accendere la pompa ricircolatore acqua calda e impostare la temperatura a 37 ° C, e poi attendere fino a raggiungere la temperatura. </li></ol></li><li> Fissare la siringa da 50 microlitri Hamilton con un ago G 29 sul telaio stereotassico avvitandolo sull&#39;albero iniezione verticale motorizzato secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Accendere lo sterilizzatore tallone e attendere fino a raggiungere la temperatura preimpostata del produttore. Nota: Questo è usato per la sterilizzazione degli strumenti in acciaio inossidabile tra animali. Prende strumenti 20 sec di contatto con i granuli di sterilizzazione. </li><li> Accendere piastra calda e impostarlo a 42 ° C e posizionare una gabbia vuota pulito in cima. </li><li> Mentre la siringa Hamilton è fissato sul telaio stereotassico utilizzare il stereotassica i motorizzatonjector di elaborare la soluzione Ap 1-42. Nota: Elaborare più di 4 ml di soluzione nella siringa e quindi utilizzare l&#39;iniettore stereotassica per impostare il volume d&#39;iniezione. Azionare l&#39;iniettore secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Preparazione degli animali <ol><li> Determinare il peso del mouse usando la scala pesare. </li><li> Anestetizzare mouse con ketamina / xilazina cocktail a 100 mg / kg ketamina e 10 mg / kg xilazina iniettando per via intraperitoneale (IP). Monitorare la profondità dell&#39;anestesia dalla perdita di pinch toe reflex. </li><li> Dopo che il mouse è sedato prendere il tagliatore di capelli e radersi la testa per esporre la pelle sopra il cranio. </li><li> Posizionare il mouse sulla parte superiore del pad riscaldamento sulla cima del letto stereotassico. </li><li> Utilizzare la spatola per aprire la bocca e posizionare i denti incisivi dentro la guardia denti. Fissare il revolver sulla faccia del mouse. Fissare con delicatezza e non troppo stretto. </li><li> PosiTion traverse orecchio bilaterali in meato uditivo per fissare la testa. Spostare ogni traversina fino a raggiungere il cranio, e poi girare la vite per bloccarlo. <ol><li> Per assicurarsi che la testa è assicurato usa il dito indice per spingere delicatamente sulla testa. Se la testa è correttamente protetto, non darà fuori o muoversi quando viene premuto. </li></ol></li><li> Applicare una goccia di crema per gli occhi o collirio per gli occhi per mantenerli umidi. Assicurarsi che gli occhi sono umidi durante tutta la procedura chirurgica. </li><li> Per disinfettare il sito chirurgico utilizzare tamponi di cotone sterili per applicare la soluzione betadine per la pelle sopra il cranio, seguito dal 70% di etanolo. Eseguire la betadine alternata e il 70% di pulizia 2 volte etanolo. </li></ol> 6. Chirurgia e Infusion <ol><li> Utilizzare un bisturi per fare un&#39;incisione 2-3 mm sulla linea mediana del cuoio capelluto, e quindi utilizzare un dritto forbici multa di estendere la linea di incisione di 1,0-1,5 cm per esporre la sutura sagittale, bregma e lambda del cranio, punto di riferimentos che le coordinate stereotassica si basano su. Utilizzare micro pinze per mantenere la pelle a parte. Nota: Le posizioni bregma e lambda sono spiegati nel topo cervello atlante &quot;Il cervello di topo in stereotassico coordinate&quot; 14. </li><li> Prendete un batuffolo di cotone, immergerlo in soluzione salina sterile, e usarlo per pulire il cranio. Quindi, utilizzare un tampone di cotone pulito e asciutto per asciugare il cranio. </li><li> Utilizzare una penna a punta fine sterile per segnare un punto sulla bregma. Utilizzare il micromanipolatore stereotassica per posizionare la siringa Hamilton modo che la punta dell&#39;ago tocca appena il punto sulla bregma. <ol><li> Registra la coordinata DV. </li><li> Per verificare se l&#39;asse AP del cranio è livello di spostare la siringa Hamilton posteriormente in modo che la punta dell&#39;ago tocca il punto lambda. </li><li> Registrare la posizione di DV. Assicurarsi che coordina il DV per bregma e lambda sono entro 0,5 mm. Nota: L&#39;obiettivo è di ridurre al minimo la differenza tra il DV bregma e lambda. </li></ol></li><li> Usaliicromanipulator per tornare alla punta siringa Hamilton torna al punto bregma. </li><li> Registrare la posizione di partenza di AP. </li><li> Calcolare la posizione di AP fine sottraendo 2,00 millimetri dalla AP partire coordinate. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per riposizionare l&#39;ago della siringa Hamilton alla finale AP coordinate. </li><li> Registra la coordinata corrente ML. </li><li> Calcolare sinistra e destra termina ML coordinate aggiungendo o sottraendo 1,3 millimetri dalla partire ML coordinate. </li><li> Utilizzare il micromanipolatore per spostare l&#39;ago della siringa Hamilton sia coordinata ML finale. <ol><li> Toccare la punta dell&#39;ago sulla superficie del cranio su entrambi terminano coordinate ML e registrare le coordinate DV e assicurarsi che i valori sono entro 0,5 mm. Nota: L&#39;obiettivo è di ridurre al minimo la differenza DV tra i due termina coordinate ML. </li><li> Mentre a un finale coordinata tirare l&#39;ago su 0,5-1 cm sopra il cranio. Prendete una penna a punta fine sterile per segnare un punto su the superficie del cranio. Ripetere questa operazione per il lato controlaterale del cranio. </li></ol></li><li> Ruotare la siringa Hamilton chiara fuori strada. </li><li> Fissare 0,8 millimetri testa di perforazione per il trapano. Prendere il trapano con entrambe le mani, impostare gomiti sulla superficie del tavolo per la stabilità, e posizione leggermente la testa di perforazione sopra il punto sharpie sulla sinistra o destra ML coordinate. Attivare il trapano, abbassare la punta della fresa sulla superficie del cranio di introdurre un foro nel cranio. Ripetere questa operazione per il lato controlaterale. Nota: Alcuni sanguinamento può avvenire dai fori di nuova introduzione. Se c&#39;è sanguinamento quindi utilizzare un batuffolo di cotone pulito e asciutto per tamponare il sangue. </li><li> Spostare la siringa Hamilton di nuovo in posizione su uno dei due fori ML di nuova introduzione. Abbassare l&#39;ago Hamilton appena passato il cranio. A questo punto fare attenzione a non forare il cervello. Per assicurarsi che l&#39;ago è passato il cranio prendere il dito indice e spingere delicatamente l&#39;ago contro il cranio per fare sure l&#39;ago non uscire dal buco. </li><li> Registra la coordinata DV partenza. </li><li> Calcola la coordinata DV fine sottraendo 2,2 millimetri dal DV partire coordinate. </li><li> Abbassare l&#39;ago verso il DV fine di coordinate. </li><li> Attivare la pompa iniettore stereotassica per pompare 4 ml di Ap 1-42 nel giro dentato ad una velocità di 0,5 ml / min. </li><li> Quando l&#39;infusione è completo lasciare l&#39;ago rimanga in vigore per un ulteriore 1 min per ridurre al minimo il riflusso di soluzione fuori del sito di iniezione. </li><li> Spostare l&#39;ago verso l&#39;altro lato del cervello e ripetere i passaggi 6,13-6,18. </li></ol> 7. Rimozione animali e Cura postoperatoria <ol><li> Allentare le barre orecchio e guardia faccia / naso. Rimuovere il mouse dall&#39;apparecchio. </li><li> Utilizzare uno studente pinza modello standard per tirare chiudere il cuoio capelluto e quindi sigillare la ferita con sutura. </li><li> Iniettare 1 ml di soluzione salina sterile nel mouse tramite IP per l&#39;idratazione. </li><li> Ingetto buprenorfina (0,1 mg / kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore. </li><li> Mantenere il mouse nella gabbia vuota pulito sulla cima di 42 ° C piastra fino a quando non si sveglia, per poi tornare alla sua gabbia alloggiamento con abbondante acqua e cibo. </li><li> Somministrare buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 ore per 3 giorni per alleviare il dolore. </li></ol> 8. sutura rimozione <ol><li> Anestetizzare il mouse con ketamina / xylazina cocktail a 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xlyazine da IP. Nota: Questo viene fatto 7-10 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Utilizzare uno studente pinza modello standard e diritte forbici sottili per rimuovere la sutura. </li><li> Iniettare 1 ml di soluzione salina sterile nel mouse tramite IP per l&#39;idratazione. </li><li> Mantenere il mouse in una gabbia vuota pulito sulla cima di 42 ° C piastra fino a quando non si sveglia, e poi tornare alla sua gabbia alloggiamento con abbondante acqua e cibo. </li></ol> 9. Animal sacrificio e Tissue Processing <ol><li> Anestetizzare il mouse e perfuse con 4% paraformaldeide 15, rimuovere il cervello, ed elaborare per criosezionamento 16. Nota: I tempi di sacrificio animale dipende sperimentatore. Tuttavia, per i nostri studi abbiamo scelto 7 e 14 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+mediates+memory+formation.">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning &amp; memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Per ottenere un successo Ap 1-42 iniezione lo sperimentatore o chirurgo deve: 1) utilizzare una tecnica asettica; 2) identificare correttamente la regione del cervello di interessi con coordinate precise; 3) essere in grado di rendere sicure le mouse nella telaio stereotassico con il cervello livellato sull&#39;asse AP e ML; 4) avere la capacità di operare il micromanipolatore con precisione; 5) assicurare una corretta assistenza post-operatoria. Osservando tali passaggi chiave il mouse dovrebbe sopravvivere alla chirurgia senza infezione osservabile. In accordo con studi in vitro, noi e altri hanno dimostrato che Ap 1-42 direttamente infusa nel ippocampo suscita la morte dei neuroni 1,4,9,10, raffigurante una delle caratteristiche chiave di AD. La degenerazione è chiaramente evidente in prossimità del sito di iniezione, come mostrato da una diminuzione nel volume del giro dentato che è completato da aumenti di marcatori per la degenerazione 1. Inoltre, tegli colinergici neuroni che proiettano ai ippocampo muoiono in maniera retrograda, come mostrato da una diminuzione di etichettatura colinergici e un aumento di colorazione TUNEL-positivi in BF 1,10. Quindi, questo modello in vivo serve come un ottimo modello per studiare gli effetti semi-acuti di Ap 1-42 localmente. Il vantaggio principale di questo modello di iniezione è la sua natura dinamica: ogni regione del cervello può essere mirato e diversi animali anziani possono essere utilizzati. 9 mesi topi maschi sono stati scelti nei nostri esperimenti, perché crediamo crescente Ap 1-42 livelli in topi anziani migliori simula la malattia che si verifica nelle persone anziane. Inoltre, ci proponiamo di mantenere gli esperimenti coerente utilizzando topi della stessa età. Tuttavia, i topi di qualsiasi età potrebbero essere utilizzati per l&#39;iniezione. In passato abbiamo sperimentato su topi che erano 16 mesi di età e altri ricercatori hanno utilizzato topi che erano 2 mesi 9,10. Solo topi maschi dovrebbero essere usati in studi come topi femmina mostra estrofluttuazioni del livello gen e gli estrogeni sono noti per avere effetti neuroprotettivi 20. Anche se molti interessi di ricerca centro attorno gli effetti patologici di Ap 1-42, ci sono anche prove che i bassi o fisiologici Ap 1-42 livelli sono necessari per le normali funzioni per l&#39;apprendimento e la memoria 21,22. In questi studi i ricercatori abbassato la concentrazione di Ap 1-42 iniettare e infuso in ippocampo 22,23, rivelando efficace ancora un altro esempio della natura dinamica dell&#39;utilità di questo paradigma. Altri composti che sono stati infusi con successo stereotaxically comprendono farmaci, virus, siRNA, anticorpi, e peptidi 1,22-26 per indagare i vari effetti che vanno dalla cella della morte / sopravvivenza di comportamento animale. Quindi, ci sono numerose applicazioni per impiegare questo paradigma infusione. La metodologia descritta infusione, mentre espone varie potenzialità di in vivo studia utilizzando questa tecnica, viene fornito con limiti intrinseci. In primo luogo, questo modello tenta solo di riprodurre gli effetti di Ap 1-42 in una regione del cervello isolato. In secondo luogo, il sito di iniezione è danneggiata dall&#39;introduzione di un ago nel cervello. Ciò contribuisce alla morte delle cellule supplementari e gliosi. Pertanto, l&#39;analisi deve essere effettuata dal tratto iniezione. Con un appropriato controllo del veicolo sul lato controlaterale del cervello stesso questo non dovrebbe essere un problema in quanto il veicolo iniettato e Ap 1-42 soluzioni diffusione al tessuto circostante. In terzo luogo, perché i neuroni colinergici BF proiettano per l&#39;ippocampo, il danno fisico dell&#39;ippocampo, come evidente dal crollo della DG per l&#39;ago (Figura 1B) può inavvertitamente uccidere alcuni BFCNs. Fortunatamente, esaminando i circuiti neuronali nel breve termine - entro 1 settimana di infusione a colpo singolo - non rappresentare un problema dal momento che i nostri dati suggeriscono che l&#39;aumentomorte colinergico nel proencefalo basale è il risultato di Ap 1-42 e non dal trauma dell&#39;ago; iniezioni di controllo prevedono l&#39;analisi appropriata. I dati suggeriscono che la degenerazione del DG è anche necessario per la perdita di neuroni colinergici BF come questi neuroni perdono le loro bersagli sinaptici (Figura 2B). Sfortunatamente, per animali sopravvissuti fino a 2 settimane veicolo lato iniettato mostra significativo aumento della morte BFCN oltre 1 settimana post-veicolo animali iniettati che sembra essere dovuto in parte alla degenerazione e assottigliamento del giro dentato risultante dal trauma fisico della ago. Tuttavia, anche in questa fase, i dati suggeriscono vi è significativamente più morte nel ipsilaterale BF al sito -injected Ap 1-42. Quarto, identificare i margini anatomiche sottili può essere difficile da raggiungere. Ad esempio, il confine tra il setto mediale e la banda diagonale stato determinato sulla base della posizione del anteriorcommissure, una tecnica che era descritto in precedenza 27. Inoltre, a causa della omolaterale BF colinergica proiezione neuronale - principalmente dal setto mediale e il ramo verticale della banda diagonale (MS / DB) - al giro dentato dell&#39;ippocampo 12,28,29 abbiamo deciso di iniettare un emisfero con Ap 1-42 e utilizzare nell&#39;emisfero opposto il controllo per il confronto. E &#39;concepibile che una preoccupazione per questo paradigma sarebbe la corretta identificazione del confine che separa sinistra e destra MS / DB. Mentre la MS è nella regione mediana, i DB sono più laterale. Per questo lavoro in corso e la nostra più recente pubblicazione 1 siamo stati in grado di distinguere comodamente DB sinistra e destra. La quantificazione rivela chat (+) neuroni riducono di circa il 25% nel DB nel lato -injected Ap 1-42. Tuttavia, non sono stati rilevati cambiamenti significativi nella chat (+) neuroni nel MS 1. A causa della loc lateralizione dei DB ei cambiamenti osservati ci siamo sentiti giustificato impiegare veicolo e Ap 1-42 iniezioni all&#39;interno dello stesso animale. Inoltre, il test 2 diverse condizioni sperimentali all&#39;interno dello stesso animale massimizza non solo l&#39;uso dell&#39;animale ma riduce anche la variabilità potenziale animale a animale. Mentre il nostro disegno sperimentale ci permette di confrontare gli emisferi destro e sinistro non è escluso questa tecnica confronto non può essere fattibile in studi futuri, vale a dire, se il setto mediale è l&#39;obiettivo principale dello studio. In tal caso ogni animale dovrà servire come una condizione sperimentale. Pertanto, l&#39;uso di animali è a discrezione degli sperimentatori. In quinto luogo, il modello può essere iniezione di corrente utilizzato per altri read-out come comportamento? Il nostro scopo in impiegando la corrente Ap 1-42 modello di iniezione è stato quello di valutare gli effetti neuropatologici di Ap 1-42 in vivo e confrontarlo con i risultati in vitro 1 </sup&gt;. A tal fine, il suo scopo. AD è una malattia che colpisce le funzioni di memoria e di comportamento di un individuo. Così, è naturale chiedersi se l&#39;attuale modello può essere utilizzato per studi comportamentali. Per espandere l&#39;attuale modello in studi sul comportamento sperimentatori dovranno caratterizzare ulteriormente il modello e possono regolare la strategia di iniezione. Ad esempio, dal momento che abbiamo osservato DG degenerazione (Figura 1B e 2B) quando puntiamo l&#39;ago iniezione dentro o vicino alla DG a 7 giorni, la distruzione della DG può dar luogo ad anomalie comportamentali non intenzionali. Quindi, se uno studio richiede esaminare l&#39;effetto di Ap 1-42 sul comportamento ippocampo-dipendente, il target iniezione può essere riposizionato in prossimità dell&#39;ippocampo piuttosto che direttamente in esso e permettere Ap 1-42 diffondere nell&#39;ippocampo. Detto questo, è possibile l&#39;uso del paradigma iniezione di corrente per i test comportamento, ma richiede più di provazione e la caratterizzazione e la strategia sperimentale finale sarà determinato dall&#39;utente finale. È interessante notare che ci sono stati studi comportamentali roditore precedenti che prevedono la consegna esterno di Ap 1-42 direttamente nel cervello. 22,30 Nel loro insieme, questi limiti devono essere considerati quando si progetta in studi sui topi in vivo che utilizzano questo modello. Dal momento che nessun modello singolo mouse esistenti cattura gli effetti patologici pieno di AD della stereotassica Ap 1-42 tecnica di infusione fornisce sperimentatori con un&#39;alternativa in vivo Ap modello 1-42 mouse. Quando è eseguita da un individuo ben addestrato questo modello è più adatto per studi a breve termine incentrati sugli effetti della Ap 1-42 su una regione specifica del cervello ei circuiti.

Depositi di placca amiloide, che sono composti di beta-amiloide (A? 1-42), sono un elemento chiave della patologia della malattia di Alzheimer (AD). Numerosi studi hanno dimostrato che i livelli elevati o tossici di ricombinante oligomeri Ap 1-42 suscitare morte neuronale, sinaptica la distrofia, perdita e disfunzioni; così come apprendimento e memoria deficit 1-4. Regioni cerebrali colpite sono l&#39;ippocampo, la corteccia, e le strutture sottocorticali, come prosencefalo basale e il 5,6 amigdala. Ad oggi, ci sono più modelli di topi transgenici che tentano di simulare l&#39;Ap 1-42 patologia di AD. A seconda del ceppo questi animali rivelarsi utile in esame selezionare caratteristiche patologiche di AD. Purtroppo, con l&#39;eccezione di 2 linee transgeniche, APP23 e 5XFAD, questi topi non replicano completamente perdita neuronale, un aspetto fondamentale di AD. Anche con la perdita neuronale osservata in APP23 e 5XFAD, l&#39;osser morte neuronaleved era sottile, l&#39;età dipendente, e isolato di un paio di regioni selezionate 7,8. L&#39;infusione diretta di oligomerica Ap 1-42 nel cervello di topo wild-type fornisce un&#39;eccellente modello in vivo che riproduce l&#39;aspetto morte neuronale di amyloidopathy 1,9,10. A differenza dei modelli di topo transgenico comunemente utilizzate il oligomerica Ap 1-42 modello infusione è ideale per acutamente elevare Ap 1-42 livelli in modo spaziale e temporale. Il vantaggio di utilizzare topi wild-type per questo modello evita di compensazione o collaterali potenziali effetti delle mutazioni introdotte nelle linee di topi transgenici. Studi precedenti hanno mostrato che l&#39;infusione livelli tossici di Ap 1-42 nell&#39;ippocampo provoca la morte dei neuroni in prossimità del sito di iniezione entro 1 settimana 1. Inoltre, in linea con l&#39;osservazione che Ap 1-42 è tossica per i neuroni colinergici 11 del prosencefalo basalecolinergici neurone (BFCN) Popolazione quali progetti l&#39;ippocampo è diminuita del 20-50% entro 7-14 giorni seguenti beta-amiloide infusione 1,10 nei topi, in modo efficace che consente per gli esami di isolato circuiti neuronali nel cervello. Dal progetto BFCN ipsilaterale al giro dentato dell&#39;ippocampo 12, per il massimo controllo parte / veicolo e oligomeri Ap 1-42 soluzioni possono essere iniettati su entrambi i lati del cervello che permette di effettuare confronti tra l&#39;emisfero destro e sinistro 1. In questo rapporto ci fornirà una metodologia chirurgica e iniezione dettagliato per adulti wild-type C57BL / 6J. Questo ceppo di topi è stato scelto a causa del suo largo uso nel campo della ricerca. Tecnicamente, ogni regione del cervello può essere mirata per infusione, ma qui useremo il giro dentato dell&#39;ippocampo, come l&#39;obiettivo di illustrare la tecnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (100mg/ml)</td>
			<td>Henry Schein Medical</td>
			<td>1049007</td>
			<td>100 mg ketamine per 1 kg animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine (20mg/ml)</td>
			<td>Henry Schein Medical</td>
			<td>not available</td>
			<td>10 mg xylazine per 1 kg animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex (0.3mg/ml)</td>
			<td>Henry Schein Medical</td>
			<td>1217793</td>
			<td>0.1 mg buprenex per 1 kg animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946;1-42</td>
			<td>David Teplow/UCLA</td>
			<td>not available</td>
			<td>100 &#956;M; This amyloid was used in the paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946;1-42</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>H-1368</td>
			<td>Can be used in place of amyloid from the Teplow lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A&#946;1-42</td>
			<td>American Peptide</td>
			<td>62-0-80B</td>
			<td>Can be used in place of amyloid from the Teplow lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled A&#946;1-42</td>
			<td>American Peptide</td>
			<td>62-0-46B</td>
			<td>Can be used as control peptide for comparing A&#946;1-42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody)</td>
			<td>Gift from William Klein/Northwestern U.</td>
			<td>not available</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Amyloid Oligomeric Antibody&#160; (Polyclonal Rabbit)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AB9234</td>
			<td>May be used in place of Nu4; needs to&#160; be tested by the end user</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>sig-39320</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChAT Antibody (Polyclonal Goat)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3250</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s directions for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>Use when coverslipping slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>not available</td>
			<td>2% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td>For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 10-20% Tricine gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6625BOX</td>
			<td>For separating A&#946;1-42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC1675</td>
			<td>For running 10-20% Tricine gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>For transferring 10-20% Tricine gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46640</td>
			<td>For enhancing A&#946;1-42 signal; follow manufacturer&#39;s protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 &#956;m</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10402088</td>
			<td>For transferring 10-20% Tricine gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Lubricant Eye Gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>not available</td>
			<td>For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh Optive Lubricant Eye Drops</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>not available</td>
			<td>For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50998</td>
			<td>For sanitizing and disinfecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round/Tapered Spatula&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-490</td>
			<td>For opening animal mouth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td>Optional; For keeping scalp skin apart during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>For cutting scalp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Surgical Blade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For making scalp incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5mm; Length 11.5cm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>For holding scalp closed during suturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer Combo Kit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>CL9990-1201</td>
			<td>For shaving hair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Warm Water Recirculator&#160;</td>
			<td>Kent Scientific&#160;</td>
			<td>TP-700</td>
			<td>For warming animal during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resusable Warmining Pad (5&#34; x 10&#34;)</td>
			<td>Kent Scientific&#160;</td>
			<td>TPZ-0510FEA</td>
			<td>For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Micro Drill</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58610</td>
			<td>Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse &#38; Neonatal Rat Adaptor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Just for Mouse Stereotaxic Instrument</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>Can use this in place of Stoelting Cat. #51615</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quintessential Stereotaxic Injector</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50287</td>
			<td>For sterilizing stainless steel instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Drape (18&#34; x 26&#34;)</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>For brain injection; use different syringes for different solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-06</td>
			<td>For attaching to the Hamilton syringe for brain injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml BD Tuberculin Syringes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309659</td>
			<td>For administering anesthesia and saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Gauge Needle (0.5&#34;)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305106</td>
			<td>For administering anesthesia and saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>65500-202</td>
			<td>For weighing animals to determine anesthesia dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25in)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-148</td>
			<td>For warming animals post-surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>S1173</td>
			<td>For closing wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive (3M)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-361931</td>
			<td>Optional: for aiding in wound closure; Use with suture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-029-488</td>
			<td>For cleaning and drying surgical wound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For collecting brain sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393241</td>
			<td>For mounting microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>194-2520</td>
			<td>For sterilizing saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical</td>
			<td>Medline</td>
			<td>VIS1422SRL91</td>
			<td>For marking coordinates on the skull</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic infusion of oligomeric amyloid-beta into the mouse hippocampus

Malattia di Alzheimer è una malattia neurodegenerativa che colpisce la popolazione. Una caratteristica neuropathological fondamentale della malattia è l&#39;eccessiva produzione di beta-amiloide e la deposizione di beta-amiloide placche nelle regioni del cervello degli individui afflitti. Nel corso degli anni gli scienziati hanno generato numerosi modelli del mouse della malattia di Alzheimer che tentano di replicare il beta-amiloide patologia. Purtroppo, i modelli di topo solo selettivamente imitano le caratteristiche della malattia. La morte neuronale, un effetto importante nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer, è notevolmente carente in questi topi. Quindi, noi ed altri abbiamo impiegato un metodo di infondere direttamente solubili specie oligomeriche di beta-amiloide - forme di beta-amiloide, che hanno dimostrato di essere più tossico per i neuroni - stereotaxically nel cervello. In questo rapporto utilizziamo maschi C57BL / 6J per documentare questa tecnica chirurgica di aumentare i livelli di beta-amiloide in una selezione regione del cervello. Ilbersaglio infusione è il giro dentato dell&#39;ippocampo perché questa struttura cerebrale, insieme al proencefalo basale che è collegata dal circuito colinergico, rappresenta una delle aree di degenerazione nella malattia. I risultati di elevare beta-amiloide nel giro dentato tramite infusione stereotassica rivelano aumenti di perdita di neuroni nel giro dentato entro 1 settimana, mentre vi è un concomitante aumento della morte cellulare e la perdita di neuroni colinergici nel ramo verticale della banda diagonale di Broca del proencefalo basale. Questi effetti sono stati osservati fino a 2 settimane. I nostri dati suggeriscono che il beta-amiloide modello infusione attuale prevede un modello alternativo del mouse per affrontare regione specifica morte dei neuroni in una base a breve termine. Il vantaggio di questo modello è che amiloide-beta può essere elevato in modo spaziale e temporale.

L&#39;attuale metodo di preparazione umana ricombinante oligomeric Ap 1-42 produce specie oligomeriche solubili costituiti da monomeri, dimeri, trimeri e tetrameri (Figura 1A). Questi a basso peso molecolare Ap 1-42 specie, ma non le fibrille e placche, sono state esposte in numerose impostazioni per essere più tossico per i neuroni 1,4,9,17-19. Per determinare se oligomerica Ap 1-42 induce la morte dei neuroni nel cervello di topo Ap 1-42 (4 ml di 100 mM soluzione madre) è stato infuso nella DG dell&#39;ippocampo in un emisfero di 9 mesi wild-type C57BL / 6J. Il peso di un ippocampo per C57BL / 6J è stimato a circa 0,018 g, e quindi l&#39;erogazione di Ap 1-42 era circa 100 mg / g. La controlaterale DG dello stesso cervello di topo è stato infuso con una soluzione di controllo / veicolo - che consisteva di uguale volume di DMSO usato a sciogliere Ap 1-42 diluito in (1x) PBS - per il confronto. Come accennato in precedenza criptato o invertire Ap 1-42 peptide può essere utilizzato come controllo per il confronto poiché abbiamo precedentemente riscontrato alcun effetto sui neuroni ippocampali 1. Poiché l&#39;introduzione dell&#39;ago nel cervello crea danno tissutale locale (Figura 1B) e provoca eventuale DG collasso abbiamo deciso di effettuare analisi post-iniezione adiacente al tratto iniezione in cui il tessuto è ancora intatta. Entro 1 settimana di Ap 1-42 iniezione DG esposto elevati Ap 1-42 livelli nello strato molecolare e lo strato di cellule polimorfico in prossimità del sito di iniezione (Figura 2A). A 7 e 14 giorni Ap 1-42 provocato aumento TUNEL-positive colorazione e diminuisce di spessore DG, confermando gli effetti neurodegenerative di Ap 1-42 (Figura 2B). Poiché i neuroni colinergici BF proiettano alla DGdell&#39;ippocampo abbiamo determinato prossimo se la perdita di neuroni nella DG innesca BF degenerazione. Per questo studio un tracciante fluorogold retrograda (2% di sospensione) è stato co-iniettati con Ap 1-42 nella DG. 7 giorni dopo fluorogold iniezione è stata rilevata nel BF (Figura 2C) suggerendo trasporto retrogrado dell&#39;etichetta tramite i neuroni colinergici. Pertanto, ai fini della quantificazione del BF abbiamo scelto neuroni fluorogold positivi perché questo indica che i terminali neuronali sono stati esposti a Ap 1-42 nella DG. In entrambe le 1 e 2 settimane successive DG Ap 1-42 infusione, il nucleo della band diagonale - una subregione BF dove i neuroni colinergici proiettano alla DG - omolaterale al sito -injected Ap 1-42 aumenti TUNEL esposto e diminuisce in neuroni colinergici (Figura 2D). La perdita di neuroni osservata nel BF conferma studi precedenti che collegano il distruttivoeffetti di Ap 1-42 al percorso di 1,10 BF-ippocampale. È inoltre fondamentale sottolineare che dal confronto del punto di tempo 2 settimane a 1 settimana punto tempo sul lato del nucleo del nastro diagonale in cui la soluzione di controllo / veicolo è stato iniettato nella DG c&#39;erano ulteriori aumenti TUNEL e diminuzioni di neuroni colinergici (Figura 2D, tabella). Questi risultati riflettono una diminuzione significativa dello spessore GCL e aumenti di etichettatura TUNEL-positivi (Figura 2B, tabella) presso la DG del veicolo iniettato lato il confronto tra i punti di tempo iniezione 2 postali, il che implica che il trauma fisico causato dall&#39;ago contribuisce a degenerazione nel tempo. Anche con questo effetto collaterale indesiderato dell&#39;ago, gli effetti neurodegenerative di Ap 1-42 sono ancora significativamente superiori a quelli della soluzione di controllo / veicolo (Figura 2D). Nel loro insieme, l&#39;attuale modello di infusione effectively riproduce gli effetti tossici di Ap 1-42 nel cervello del mouse entro 7 giorni rendendo questo un modello attraente per lo studio a breve termine A? 1-42 stimolazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52805/52805fig1.jpg" /> Figura 1. oligomerica Ap 1-42 preparazione e il cervello del mouse tratto iniezione di visualizzazione. (A) 2 micron Oligomeric Ap 1-42 è stato separato il 10-20% gel tricina e trasferito su membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata cancellata con Ap 1-42 anticorpi 6E10 (1: 1.000). (B) Ap 1-42 (4 ml di 100 mM soluzione) o il controllo / veicolo è stato infuso in sinistra e destra DG dell&#39;ippocampo, rispettivamente, di 9 mesi C57BL / 6J. I topi sono stati sopravvissuti per 7 giorni. Cervelli sono stati sezionati in serie a 20 micron per sezione. Sezioni dell&#39;ippocampo sono state colorate per DAPI. Segni di Hash raffiguranoil tratto di iniezione. Le frecce mostrano crollato DG. La barra della scala rappresenta 200 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52805/52805fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52805/52805fig2.jpg" /> Figura 2. oligomerica Ap 1-42 induce la morte neuronale nel DG e BF. Controllo / veicolo o Ap 1-42 (4 ml di 100 mM soluzione) è stata infusa sinistra e destra DG dell&#39;ippocampo, rispettivamente di 9 mesi di età C57BL / 6J. I topi sono stati sopravvissuti per 7 o 14 giorni. Cervelli sono stati sezionati in serie a 20 micron per sezione. (A) 7 giorni dopo l&#39;iniezione di sezioni di ippocampo colorate per Ap 1-42 (anticorpi NU4, 1: 2.000). ML, strato molecolare; GCL, strato di cellule gangliari; PCL, strato di cellule polimorfico. La barra della scala rappresenta il 50 micron. (B </strong&gt;) 7 o 14 giorni dopo l&#39;iniezione di sezioni di ippocampo colorate per DAPI o TUNEL. * P &lt;0,05 rispetto a 1 settimana. *** P &lt;0,001 rispetto a 1 settimana. * P &lt;0,05 rispetto al veicolo. ** P &lt;0,01 rispetto al veicolo. La barra della scala rappresenta il 50 micron. (N = 5 topi) (C) Veicolo o Ap 1-42 co-iniettati con fluorogold (soluzione al 2%). Etichettatura Fluorogold determinata nel BF 7 giorni dopo l&#39;iniezione. Diapositive contenenti il ​​BF sono stati scelti in modo casuale. Etichettatura Fluorogold stata utilizzata per determinare la regione di interesse. Una volta che è stato identificato la regione di interesse fettine di cervello adiacenti sono stati usati per colorare per i marcatori di interesse. Gli inserti sono regioni nelle quali sono scelti immagini (D). La barra della scala rappresenta 200 micron. (D) 7 o 14 giorni dopo l&#39;iniezione sezioni BF colorate per la chat (1: 100, capra policlonale) o TUNEL. *** P &lt;0,001 rispetto a 1 settimana. * P &lt;0,05 rispetto al veicolo. La quantificazione è stata effettuata su tutta la regionedi interesse. Il confine tra il setto mediale e la banda diagonale è delineato in base alla posizione della commissura anteriore. La barra della scala rappresenta il 100 micron. (N = 5 topi). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52805/52805fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

stereotaxic-infusion-oligomeric-amyloid-beta-into-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.0K Views.  Columbia University Medical Center. Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Ricerca

Neuroscienze

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

La chirurgia stereotassica della lesione eccitotossico di specifiche aree cerebrali nel ratto adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Building An Open-source Robotic Stereotaxic Instrument

This protocol includes the designs and software necessary to upgrade an existing stereotaxic instrument to a robotic (CNC) stereotaxic instrument for around $1,000 (excluding a drill), using industry standard stepper motors and CNC controlling software. Each axis has variable speed control and may be operated simultaneously or independently. The robot&#39;s flexibility and open coding system (g-code) make it capable of performing custom tasks that are not supported by commercial systems. Its applications include, but are not limited to, drilling holes, sharp edge craniotomies, skull thinning, and lowering electrodes or cannula. In order to expedite the writing of g-coding for simple surgeries, we have developed custom scripts that allow individuals to design a surgery with no knowledge of programming. However, for users to get the most out of the motorized stereotax, it would be beneficial to be knowledgeable in mathematical programming and G-Coding (simple programming for CNC machining).
The recommended drill speed is greater than 40,000 rpm. The stepper motor resolution is 1.8&#176;/Step, geared to 0.346&#176;/Step. A standard stereotax has a resolution of 2.88 &#956;m/step. The maximum recommended cutting speed is 500 &#956;m/sec. The maximum recommended jogging speed is 3,500 &#956;m/sec. The maximum recommended drill bit size is HP 2.

This protocol includes the designs and software necessary to upgrade an existing stereotaxic instrument to a robotic (computer numeric controlled; CNC) stereotaxic instrument for around $1,000 (excluding a drill).

Costruire un Open-source Robotic Stereotassica Instrument

This protocol includes the designs and software necessary to upgrade an existing stereotaxic instrument to a robotic (CNC) stereotaxic instrument for ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale<i&gt; via</i&gt; Carotide interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Registrazione spazialmente limitate oscillazioni nell'ippocampo dei topi di comportarsi

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).