This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

הצהרת אתיקה:: הערה הפרוטוקול לטיפול בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, אירווין, פרוטוקול # 2010-2943. 1. ההסרה של חוט השדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגבות נייר רטובה עם ~ 100% isoflurane הנוזלי, USP בהרדמת חסד תא ולמקם את מגבות נייר יבשות על גבי. מניחים את העכבר בתא על גבי מגבות נייר יבשות כל כך העכבר לא נוגע בisoflurane ולוודא קאמרי מכוסה. חכה לפחות דקה אחת לאחר הפסקת הנשימה על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חיתוך רוחב השדרה של הצוואר כדי להבטיח את העכבר הוא מורדמים. אל תבצע נקע בצוואר הרחם כמו זה יכול לגרום נזק לחוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס העכבר עם אתנול 70% להרטיב את השיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי פיין חדים כדי להסיר את השיער והעור מהחלק האחורי של העכבר כדי לחשוף את עמוד השדרה מכ צוואר רחם lamina 1 (C1) לlamina עצם העצה 4 (S4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל עם # 10 להב, לעשות חתכים בצד השמאל וימין של עמוד השדרה כדי להפריד אותו משריר והשומן. זה יגרום להסרת של חוט השדרה הרבה יותר קלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: rongeurs Luer מעוקל יכול לשמש כדי לגרוף את בשר נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את החלק העליון של חוליות עמוד השדרה עם מלקחיים גרפו משוננים, הכנס מספריים Vannas טיטניום עקומים, עם הצד המעוגל למעלה לתוך עמוד השדרה נחשף בC1, נזהר שלא לגעת בחוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק מספריים Vannas מעוקלים טיטניום כל הדרך לנכונה ולעשות חתך קטן אחד. קול מחנק קטן צריך להישמע והרגיש כמו המספריים לחתוך את החוליות. חזור על זה לחתוך בצד השמאלי של הכבל. היזהר שלא ללכת מהר מדי או להפוך גדול מדי של קיצוץ כמו זה יהיה לסכן את נזק לכבל עם המספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lamina אחד אמור להיות מסוגל להיות הרים עם המלקחיים פעם ציד החוליות נחתכים. REPEAT שלב זה עבור כל lamina עד S4, ממשיך להחזיק ולמשוך בחזרה את חוליות עמוד השדרה. הערה: החוליות מעל אתר ההשתלה צפויה לבוא מפעם אחת שהוא כרת לאתר ההשתלה. המשך ההליך מתחיל ממש מתחת לאתר ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להניח את החוליות למטה כדי לראות היכן אתר ההשתלה הוא ומידה ולחתוך ~ 20 מ&quot;מ מקורי ואת הזנב לאתר ההשתלה. הערה: כאשר השתלת NPCs יותר לא יהיה צורך כNPCs המושתל בדרך כלל אינו נודד רחוק יותר מ- 15 מ&quot;מ. הסכום של חוט השדרה הדרוש יהיה תלוי במאפייני ניסוי והגירה של סוג התא המושתל. ביצוע חתכים מקורי ואת הזנב, כי הם במרחק שווה לאתר ההשתלה יאפשר אתר ההשתלה להיות ממוקמים בקלות רבה יותר במהלך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל עם להב # 11 לחתוך בזהירות את הגרעינים מימין ומשמאל לצד הגחון של חוט השדרה מתחיל בסוף מקורי. w זהחולה לאפשר את חוט השדרה להסרה מחוליות הגחון בקלות רבה יותר. הערה: בוצע במהירות (שלבים 1.7-1.11), חוט השדרה לא תתייבש. עם זאת, 1x PBS יכול להינתן לחוט כדי לשמור אותו לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את העכבר והחזק את העכבר עד כה חוט השדרה פונה כלפי מטה. לקלף בזהירות את חוט השדרה באמצעות מלקחיים גרפו משוננים סגורים. בלי שסחב את חוט השדרה, לחתוך בזהירות כל הגרעינים שנותרו כדי לאפשר את חוט השדרה ליוסר בחתיכה אחת שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחוט השדרה הוא בRPMI-1640 ולמקם אותו על קרח להובלה למיקרוסקופ 2P. </li></ol> 2. הכנת חוט השדרה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטבעת חוט השדרה בagarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את חוט השדרה המבודד בRPMI-1640 מקוררים על קרח לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את agarose (טמפרטורת gelling נמוכה) ולהכין פתרון 5% ב 5 מיליליטר של 1x PBS. מיקרוגל פתרון agarose 5% למשך 15 שניות כדי לפזר את agהתעורר ולתת הפתרון מגניב עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חוט השדרה על ידי הצבתו על גיליון Parafilm עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet כ 5 מיליליטר של 5% פתרון agarose על צד הגחון של חוט השדרה. בואו agarose לבסס על ידי קירור לטמפרטורת חדר. מיצוק מלא לוקח כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בשכבה דקה של דבק רקמות ל-22 מ&quot;מ להחליק את מכסה מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את חוט השדרה המשובץ, הצבת צד הגחון על Parafilm. צד הגב עכשיו יהיה כלפי מעלה. לדבוק להחליק את המכסה בצד הגב, ולהטביע את הכנת agarose מוטבעת חוט / כיסוי השדרה להחליק בRMPI כדי לחזק את הדבק. להסיר עודפי הקרושה agarose באמצעות סכין גילוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת חוט השדרה על הבמה מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל וזלין לתחתית להחליק את המכסה. זה יתייצב ההכנה במהלך זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנת חוט השדרה בהדמיה גם על הבמה מיקרוסקופ עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה לכיוון מטרת טבילת 25x. גם ההדמיה שהותקן הוא כ 20 מ&quot;מ עמוק, ארוך 50 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ ורוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה תוך superfusing ההכנה עם התחמם (37 ° C), מחומצן (95: 5 חמצן: דו תחמוצת-פחמן carbogen) בינונית RPMI-1640 ללא סרום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת טרום חמה עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים ולחבר אותו למשאבת צינורות על ידי החדרת הצינור לתוך בקבוק התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומר על טמפרטורת התקשורת על 37 מעלות צלזיוס מכשיר חימום בחיבור של הצינור לתא. תקשורת Superfuse דרך גם בשעה 3 מיליליטר / דקה באמצעות צינורות מחוברים למשאבת צינורות (איור 1). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P הדמיה של חוט השדרה הגחון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות מחוט שדרת Thy1-EYFP באמצעות Ti Ultra Chameleon: ספיר לייזר מכוון 900 ננומטר. להחליש כוח הלייזר בדגימה ל&lt; 5% כדי להבטיח phototoxicity המינימלי 16. לשמור על טמפרטורה על ידי מרוסס-perfused חמצן RPMI-1640 בC 37 מעלות קבועות באמצעות תנור פתרון מוטבע אחת כדי להבטיח הדמיה יציבה, וכדי למנוע סחף רקמה ונזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפריד אות ניאון eGFP וEYFP, למקם dichroic 520 ננומטר חד-קצה ומפצל קרן dichroic 560 ננומטר חד-קצה בסדרה להפריד 2P פליטה לשלושה ערוצים, בכוונה פיצול הפליטה הירוקה כדי לשפר את ראות. הערה: ערוץ אלה המכונה כחולים-ירוק (פליטה &lt;520 ננומטר), ירוק-צהוב (520-560 ננומטר), ואדום (פליטה&gt; 560 ננומטר). צינורות מכפיל לזהות נפלטו אור בכל ערוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי הדמיה איתור של עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעינית ומקור אור בשדה בהיר, להתמקד במטרה הטבילה בקצה הגחון של חוט השדרה כדי לקבוע נקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מקור אור הסביבה בטוחה כבוי וSWגירוד ל2P עירור על ידי פתיחת תריס הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זמין, בעת חיפוש רקמה לתחומי עניין, להשתמש בהגדרת רזולוציה נמוכה יותר, נפח גבוה יותר ללא זום דיגיטלי, וקצב סריקה גבוה יותר מאשר בעת רכישת תמונות סופיות. הגדרות טיפוסיות עם מערכת זו בעת חיפוש רקמה לאזור של עניין הן: רזולוציה: 256 פיקסלים; נפח: x = 600 מיקרומטר, y = 600 מיקרומטר, z = 0-300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לאקסונים EYFP ליד קצה הגחון של חוט השדרה. אות הרמונית שנייה מקולגן (כחול) תהיה בהיר בקצה רקמת חוט השדרה. אתר את האקסונים EYFP רק הגבו לאות ההרמונית השנייה מקולגן ואות EYFP היא דמיינה בערוץ הירוק-צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את אתר ההשתלה במרכז האורך של הכנת חוט השדרה 14. לעכברי יום 1 לאחר השתלת eGFP-NPC, לאתר את אתר ההשתלה, תוך התמקדות נתיב הקרן במישור z העמוקה לתוך הרקמה. Wi אתר ההשתלהll להשתנות מעט בין בעלי החיים, אבל בדרך כלל ממוקם ~ 200 מיקרומטר מקצה הגחון. שים לב לאשכולות של eGFP-NPCs בשטחי חומר הלבנים, קרוב יותר לקצות הגחון ורוחב בעכברים לאחר יום 1 לאחר השתלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונות סופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש רזולוציית תמונה של 512 פיקסלים; נפח: x = 270 מיקרומטר, y = 212 מיקרומטר, וz = 100 מיקרומטר Slidebook תוכנה באמצעות 6. לקמפל Z- ערימות על ידי רכישת מטוסי מוקד רציפים במרווחים של 2.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקה דו-כיווני עם שרג הראוי לקזז כדי להבטיח כימות מהיר של כל חפצים נודדים בחוט השדרה. ודא שמסגרת שיעור הרכישה האידיאלית כדי לקבוע מהירות הסלולר בתוך חוט השדרה הוא כ 1 מסגרת / sec. ניתן לשנות את הגדרות הדמיה להעדפות של משתמשים שונים, כגון קצב רכישת מסגרת, רזולוציה הדמיה וכרכי הדמיה: הערה. כרכי הדמיה גדולים יהיו בדרך כלל לוקחים זמן רב יותר כדי לרכוש בGIVהרזולוציה en. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח, יבול, קבצי תמונת Slidebook חלק, וpseudocolor עם תוכנת ניתוח תמונה כגון Bitplane Imaris 7.7. להפיק קטעי וידאו הזמן לשגות סופי על ידי סירוק כרכי הדמיה ברציפות באמצעות תהליך אוטומטי בSlidebook וImaris. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+model+of+MS:+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment.">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li><li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis:+the+role+of+cell+transplantation.">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li><li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li><li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination.">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li><li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li><li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination.">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination.">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status.">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).</li><li>Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+3.">Ch. 3.</a> Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).</li><li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1,+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li><li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CXCL12+(SDF-1alpha)+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis:+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein.">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus.">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca(2+)+imaging.">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826 (2013).</li><li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development.">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22 (2014).</li><li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li><li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance.">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li><li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy.">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).</li></ol>

The authors have no competing interests.

בזמן אמת 2P הדמיה של רקמות שלמות נדרשת לחקור קינטיקה NPC ואינטראקציות לאחר השתלה לתוך חוט השדרה עכבר demyelinated. ההדמיה Intravital 2P משמשת בדרך כלל כדי לקבוע דינמיקה סלולרית בצד הגבי של חוט השדרה בעכברים חיים, ונעשתה בו שימוש כדי ללמוד demyelination הגב בdemyelinating המחלה 17-19. עם זאת, מכיוון שNPCs המושתל להגר לחומר לבן הגחון, שנמצא עמוק מדי לתמונה באתר באמצעות 2P מיקרוסקופיה, הכנת vivo לשעבר היא הכרחית. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לקבוע את קינטיקה תנועתיות וחידוש יצירת המיאלין של NPCs הושתלו בעמוד השדרה נפגע ולא נגרם נזק 6. Ex vivo הכנות תאפשר סריקה של חוט שדרה לא רק longitudinally אלא גם באופן רוחבי מהצד הגחון 6,20 . זה מאפשר ניתוח של הבדלים בתנועת תא (מהירות וכיוון) ואינטראקציות בtאתר ransplant, סמוך לאתר ההשתלה, ובמרחקים שונים מאתר ההשתלה 6. הואיל ואנו בתחילה תוכננו בתכשיר זה לתמונה המושתלת eGFP-NPCs בצד הגחון של חוט השדרה, ניתן להשתמש בו לכל תמונה שכותרתו או תא צבוע מהגחון, הגב, או צדדים לרוחב על ידי שינוי כיוון חוט השדרה הוא fluorescently רכוב. יתרונות של הכנה זו על פני ההדמיה intravital כוללים המאפשר הדמיה צד הגחון וחסר הצורך בהרדמה וניתוח הישרדות, שעדיין יש צורך בהכנות intravital החדשות באמצעות התקנה &#39;חלון זכוכית&#39; המאפשרות לפגישות הדמיה מרובות ללא ניתוחים חוזרים ונשנים 19,21 . יש לציין כי מגבלה אחת של הליך זה בהשוואה לגישתו של חלון זכוכית &#39;בשילוב עם ההדמיה intravital היא חוסר היכולת להשיג נקודות זמן מרובות מעכבר אחת, מאז חוט השדרה הוסר והעכבר הוא מורדמים. ההדמיה 2P היא אידיאלית לפתרון הדינמיקה של תאים בודדים בתוך רקמות שלמות 22,23. עירור 2P מנצל פוטונים קרובים אינפרא אדום המאפשרים לתקופות ממושכות של הדמיה רקמות עמוקה עם phototoxicity המינימלי. עירור 2P מתרחש על הקליטה בו זמנית של שני פוטונים על ידי fluorophore. הריכוז הגבוה של פוטונים דרושים ל2P עירור מושגת על ידי דחיסת מרחב ובזמן של פלט לייזר 2P במישור מוקד אחד. זה מגביל עירור ניאון למוקד, מזעור נוסף phototoxicity באזורי חוט השדרה מחוץ למישור המוקד. פוטונים האינפרה-אדום קרוב גם צמצמו פיזור, המאפשרים עד כ 300 מיקרומטר מהצד הגחון של חוט השדרה 16 הדמיה. כמו עם כל טכניקה חדשה, לעומת זאת, יש 2P הדמיה של עמוד השדרה explanted מגבלות שחייבות להיות כל הזמן בראש. פרוטוקול הדמיה זו משתמש בdichro 520 ננומטרמראה ic המאפשר הפרדת הקרינה eGFP וEYFP על ידי הטיית פליטת eGFP לערוץ הניאון שמורות בדרך כלל לאור כחול. דור שני-הרמוני שנוצר על ידי קולגן בחוט השדרה מופיע גם בערוץ הכחול, אבל יש להבדיל בקלות מהתאים שכותרתו-eGFP שהם בהירים באופן משמעותי בהכנה זו, ויש להם חלק מפליטה לזיהוי בערוץ ירוק-הצהוב כ קולגן לא. טכניקה זו של מיזוג ערוץ והפרדה של חלקים שונים של ספקטרום פליטה באמצעות dichroics הספציפי היא לעתים קרובות שימושית לזיהוי חזותי או אוטומטי של fluorophores בודדת עם ספקטרום פליטה קרוב או כמעט חופף. Phototoxicity הוא מגבלה נוספת של פרוטוקול ההדמיה 2P זה. תאים בתוך אחת הדמיה נפח רגישים לphototoxicity; לכן, בניסויים צריכים להיות מודעים היטב לסימנים של phototoxicity. Phototoxicity הוא בדרך כלל לידי ביטוי הראשון בהפחתה או חוסר התאתנועתיות, ואחרי photobleaching ו / או שינויים מורפולוגיים ברקמות מקומיות. מספר גורמים יכולים לגרום נזק לרקמות מובילים לphototoxicity או טיוח זה אינו מתאים לLive- תא הדמיה. זה קריטי כדי לפקח על כוח הלייזר וטמפרטורה והחמצון של RPMI-1640 perfused. זה גם הכרחי על מנת להבטיח הסרה נכונה של חוט השדרה מהעכבר ללא מוגזם מתיחה או דחיסה של חוט השדרה ובלי לחתוך את חוט השדרה עם הלהבים. אם ינוהל כהלכה, הכנת חוט השדרה explanted תישאר קיימא עבור עד עשר שעות, כפי שנקבעו על ידי תנועתיות סלולרית חזקה בתוך חוט השדרה הגחון ללא הפחתה בעשר שעות שלאחר חילוץ. מגוון רחב של רקמות שחולצו הוא הדמיה בדרך כלל לפרקי זמן ארוכים ונחשב בר-קיימא 23-26. לכן, כימות של דינמיקה סלולרית באזורים מרובים בחוט השדרה יחיד אפשרית. לבסוף, יש לציין כי רובם המכריע של tha תאיםt לא fluorescently שכותרתו לא דמיין ידי ההכנה הזה (אלא אם כן autofluorescent באופן טבעי), וזה חשוב להכיר בכך שתאי שכותרתו נמצאים באינטראקציה עם סביבה מורכבת של תאים אחרים ללא תווית, לכאורה בלתי נראים אנדוגני ואלמנטים מבניים.

מודלים עכבר של demyelination, כוללים Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE) וזיהום תוך-גולגולתי עם וירוס צהבת עכבר neuroadapted (MHV), הם כלים מצוינים ללמוד מסלולים מולקולריים ואינטראקציות הסלולר הקשורים במחלה. הם הובילו ולתמכו ביעילות של ה- FDA אישרה טיפולי תרופות, בעיקר מיקוד הפסקת אוטואימוניות ודלקת 1. עם זאת, ברגע שחידוש יצירת המיאלין אנדוגני נכשל, הטיפולים שאושרו כרגע לא ביעילות לתקן נגעי demyelinated במערכת העצבים המרכזית. לכן, טיפולים ממוקדי תיקון בשלב זה של מחלה הם קריטיים להקלת סימפטומים כרוניים ושיפור איכות החיים. לאחרונה, תאים עצביים מבשר (NPCs) הגיעו לחזית ככלים טיפוליים משובי פוטנציאל להתמקד באזורים של דלקת ופגיעה במיאלין. מספר מחקרים הדגישו את היכולת של NPCs כדי לגרום endogenoשלנו חידוש יצירת המיאלין ולהשתתף באופן ישיר בחידוש יצירת המיאלין 2-8. בגלל NPCs מעורב בחידוש יצירת המיאלין ישיר, זה הכרחי כדי להבין קינטיקה ויחסי הגומלין שלהם עם תאי אנדוגני לאחר השתלה. לאחר השתלה, NPCs להעביר ventrally לאזורי נזק בחומר לבן, אז rostrally וcaudally ביחס לאתר ההשתלה 5,9. קינטיקה של הגירה שונה בתגובה לרמזים סביבתיים; יש NPCs הושתלו בעמוד השדרה פגוע שאינן מהירויות גדולות יותר מNPCs הושתלו בעמוד השדרה ניזוק 6. לאחר תקופה נודדת, הועבר NPCs להתרבות בהרחבה, בשיעור גבוה יותר בהשוואת חוט השדרה פגועה לחוט השדרה שלם 6. לבסוף, רוב NPCs להתמיין oligodendrocytes וליזום 4,6,9 חידוש יצירת המיאלין ישיר. נגע demyelinated הוא מורכב ויכול לכלול אוכלוסייה מגוונת של תאים בשלבים שונים שלctivation. לדוגמא, נגע פעיל בטרשת הנפוצה (MS) עשוי לכלול אוכלוסייה משמעותית של תאים מופעלים T, מיקרוגליה M1 ומקרופאגים M1, אבל נגע MS שקט כרוני יכול להיות מורכב בעיקר של האסטרוציטים תגובה עם כמה תאים דלקתיים 10-13. בגלל המגוון של תאי מפעיל, הדמיה שני פוטונים (2P) במודלים של עכברים של demyelination היא כלי מאוד שימושי שיעזור להבין אינטראקציות הסלולר מקומיות בנגע. בטרשת נפוצה ומודלי מחקר MS שימוש נרחב רבים, רוב הנגעים נמצאים בצד הגחון של חוט השדרה, באזור שאינו נגיש להדמית 2P intravital בשל עומק נגע ותוכן שומנים הגבוה של חוט השדרה. כדי לעקוף בעיות אלה ואינטראקציות תא-תא מחקר בנגעים לאורך חוט השדרה הגחון פיתחנו לשעבר הכנת ההדמיה vivo 2P 6 פשוט. מחקר זה עוקב אחר פרסום שיטות קודם, אשר הראההליך השתלת חלבון משופר ירוק ניאון (eGFP) NPCs -expressing לחוט השדרה של עכברים הבאים מתח JHMV של demyelination המושרה MHV 14. עכברים בן חמישה בשבוע שנגועים בJHMV ומושתל עם eGFP-NPCs ברמת בית החזה 9 ביום 14 לאחר פגיעה. הפרוטוקול המובא כאן מספק את צעדים מפורטים כיצד לחלץ את חוט השדרה, לעשות הכנת vivo לשעבר agarose, ואינטראקציות eGFP-NPC תמונה מושתלת עם חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) האקסונים -expressing. עכברים להביע EYFP תחת אמרגן Thy1 העצבי ספציפית שמשו בהליך זה 15. רק חלק מהאקסונים להביע EYFP, מה שהופך אותו לשימושי הדמיה אקסונים בודדים. כאן אנו מראים מיתרי השדרה הוסרו בשעה 7 ימים לאחר השתלה; עם זאת, ניתן לחלץ מיתרי השדרה בכל נקודת זמן לאחר השתלה. אמנם אנו מציגים אינטראקציות של NPCs עם אקסונים פגועים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש בשילוב עם סמני ניאון גנטייםשל סוגי תאים אחרים כדי לחקור מספר רב של אינטראקציות הסלולר מתרחשות ברחבי חוט השדרה העכבר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:381px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:175px;">Piramal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td>sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #10</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Luer rongeurs</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Graefe forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15615-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #11</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">12-115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9414-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Parafilm</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td style="width:175px;">3M</td>
			<td style="width:136px;">1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">22 mm square cover slip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">12-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">25x dipping objective, 1.1 NA</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">CFI Apo LWD 25XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Single inline solution heater</td>
			<td style="width:175px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:136px;">64-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">520 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF520-Di02-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">560 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">photomultiplier tubes</td>
			<td style="width:175px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:136px;">R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">C/L variable-speed tubing pump</td>
			<td style="width:175px;">Masterflex</td>
			<td style="width:136px;">77122-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">digital thermometer</td>
			<td style="width:175px;">Comar Instruments</td>
			<td style="width:136px;">3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Slidebook 6 software</td>
			<td style="width:175px;">3i</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Imaris 7.7 software</td>
			<td style="width:175px;">Bitplane</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> בעוד פרוטוקול ההדמיה חוט השדרה explanted יכול לשמש כדי לחזות כל הקרינה בתוך חוט השדרה, תוצאות הנציג שלנו להפגין אינטראקציות eGFP-NPC עם EYFP-האקסונים. ראשית, אנו מציגים את ההכנה המוטבעת הגחון בחוט השדרה באיור 1 א. בשלב הבא, אנו מציגים את תוכנית ההתקנה של 2P מיקרוסקופ ורכיבי מפתח באיור 1. איור 2 מדגים הקרינה eGFP וEYFP בz-ערימה אחת בתוך חוט השדרה הגחון. רכישת Z- ערימות רצופות ניתן להדר בהפקת סרטי זמן לשגות לנתח דינמיקה סלולרית בזמן אמת בתוך הרקמה שלמה. באמצעות dichroic 520 ננומטר חד-קצה ומפצל קרן dichroic חד-קצה 560 ננומטר, כאמור בפרוטוקול, יכול להפריד בין אות eGFP וEYFP. ניתן pseudocolored ערוצים בודדים תוכנת הדמיה באמצעות ירוקה וצהובה. 80 / 52580fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: חוט השדרה והתקנת מיקרוסקופ. (א) חוט השדרה המשובץ ב5% agarose ג&#39;ל (משמאל) ורכוב על coverslip לאחר פינוי agarose העודף (מימין). (ב) תמונה של התקנת מיקרוסקופ עם רכיבי מפתח שכותרת. אמבט מים 1. להגדיר על 37 מעלות צלזיוס. 2. טרום חיממו RPMI-1640. 3. C / משאבת צינורות משתנים במהירות L. 4. דוד פתרון מוטבע יחיד. מטרה לטבול 5.. 6. מדחום דיגיטלי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52580/52580fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52580/52580fig2.jpg" /> איור 2: תמונת דוגמא 2P רכש בתוך חוט השדרה הגחון 3D שחזורים של הצד הגחוני של נגוע, שאינם פגום () וחוט נגוע JHMV, demyelinated (B) בעמוד השדרה.מההשתלה הבאה עכבר Thy1-EYFP עם NPCs שכותרת eGFP. האקסונים fluorescently שכותרתו הם pseudocolored צהובים וNPCs הם pseudocolored ירוק. רזולוציית תמונה: 512 פיקסלים; תמונת נפח: (א) x = 239 מיקרומטר, y = 259 מיקרומטר, z = 65 מיקרומטר נבנו באמצעות 26 Z- ערימות במרווחים של 2.5 מיקרומטר וחוץ (B) x = 497 מיקרומטר, y = 389 מיקרומטר, z = 127.5 מיקרומטר נבנה באמצעות 51 Z- ערימות במרווחים של 2.5 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K Views.  University of California, Irvine.  הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה. 

Video: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

ההדמיה דיפוזיה בחוט השדרה עכברוש צוואר הרחם

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...