The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTA: L&#39;Università di Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee ha approvato tutti gli esperimenti. 1. Preparazione degli strumenti Ultrasound-microiniezione e embrioni <ol><li> Impostare palco, monte, e sonda (Figura 1), così come gli strumenti chirurgici (Figura 2). Luogo soluzione tampone fosfato salino (PBS) (pH7.4) a 37 ° C il riscaldamento bagno. Riempire microiniezione ago completamente con olio minerale, con siringa da 1 ml collegato a una seconda flessibile 25 ago G, attraverso la sua base. </li><li> Fissare ago sulla rotazione del braccio di montaggio, e vuota ago della soluzione di olio minerale. Re-riempire con 2,5 ml di soluzione TL. Assicurarsi che non bolle d&#39;aria sono presenti all&#39;interno l&#39;ago iniezione. Ruotare il braccio l&#39;ago verso la parete, lontano dal palcoscenico. </li><li> Anestetizzare la madre incinta in camera di anestesia via infusione continua di isoflurano. Quando la madre è uno stato di incoscienza, trasferire l&#39;anestesia per tubo naso posizionato sul clato audal del palco, e posto la madre in posizione supina con il muso in tubo naso per consentire la continuazione di uno stato completamente anestetizzato. </li><li> Arti nastro in angoli di 45 °, o con le mani ei piedi riposati e posizionati sovrastano schede / monitor temperatura ECG. È importante che la diga incinta è costantemente monitorata per garantire che l&#39;anestesia è sufficiente e che in pomata applicata agli occhi per ridurre l&#39;essiccazione. </li><li> Applicare il prodotto di rimozione dei capelli attraverso basso addome della madre, pulire delicatamente con tamponi di cotone asciutto, e poi di nuovo con un 70% di tamponi di cotone etanolo-saturi per rimuovere qualsiasi prodotto in eccesso e capelli. Assicurarsi di pulire la pelle addominale fuori di tutti i capelli nel sito di incisione (Figura 3). </li><li> Eseguire una laparotomia sulla madre incinta con pinze chirurgiche fini e forbici. Fare attenzione a non tagliare le navi grandi o organi viscerali. Fate prima incisione diritta dell&#39;epidermide 1,5-2 cm sopra la vagina e continuare tagliare verso costole per approximately 2-3 cm. Esporre la membrana sottocutanea, individuare la linea alba (&quot;linea bianca&quot;) (Figura 3), e tagliare parallelo incisione iniziale, lungo la stessa lunghezza, per esporre organi interni viscerali e sacculi uterini. </li></ol> 2. Estrazione di embrioni <ol><li> Utilizzare applicatori di cotone con punta da 6 pollici di manovra madre ed embrioni. Premere delicatamente (non forzare) sulla pelle con applicatore di manipolare primo embrione di apertura dell&#39;incisione. Dopo l&#39;estrazione del primo saccule dell&#39;embrione, delicatamente e lentamente tirare il resto del corno uterino attraverso e sulla parte esterna della madre. Evitare di tirare intestino o altri organi attraverso un&#39;incisione in questa fase. </li><li> Quantificare embrioni e inserire delicatamente corno uterino posteriore sinistra in madre. Poi iniziare mettendo il corno uterino destra nuovamente dentro la madre a partire dal lontano embrione sacculo dalla vagina sul corno e in movimento verso il basso. Continuare questo fino a soli due embrioni rimangono esposti (Fifigura 4). Infine, gli embrioni di posizione in una colonna sopra e parallela alla linea di incisione, essendo consapevoli di non tagliare la circolazione uterina. </li><li> Posizionare i blocchi di argilla e la posizione tra le braccia e il corpo, così come le gambe e la coda. Assicurarsi che le superfici in terra battuta sono circa livello con incisione laparotomica. Bagnare la piastra Petri finestrato con 37 ° C PBS. </li><li> Afferrare forcipe estendono con la mano destra e piatto fenestrato Petri con la mano sinistra (finestratura parallelo embrioni) e portare chiuso pinze ~ 5 cm attraverso fenestrazione, dalla parte superiore della scatola di Petri. Pinze aperte completamente senza strappi maglia finestratura. </li><li> Manovra mani sopra embrioni e concentrarsi vista sulle due sacculi embrione. Senza (o leggermente) toccando sacculi con finestratura meshing o pinze, farle scorrere attraverso fessura e impostare piastra di Petri sul ventre della madre. Con pinze ancora estese, manipolare maglia fenestrata a sedere su entrambi i lati e alla base di ogni embrione (Figura 5 </strong&gt;) e tirare pinze di apertura a fessura. </li><li> Quindi, posto di gomma blu contenente muro in capsula di Petri, senza pizzicare o ferire embrioni (Figura 6). Assicurarsi che i blocchi di argilla sono saldamente equilibrando capsula di Petri, embrione, e la parete contenenti gomma. Infine, riempire piastra di Petri con 37 ° C PBS fino embrioni sono completamente sommersi (Figura 6), controllando eventuali perdite a meshing fenestrata. </li></ol> Procedura 3. Iniezione <ol><li> Stadio inferiore iniezione con la madre e gli embrioni verso il basso con manopola di regolazione del livello Z (figura 1) e quindi ruotare ago per l&#39;iniezione e il braccio di montaggio e allineare direttamente con sonda ecografica, con ½ ago cm a sinistra e sotto la punta della sonda (Figura 7) . Spingere l&#39;ago-braccio (non l&#39;ago) a 45 ° di distanza dalla sonda. Fare attenzione a non colpire la punta dell&#39;ago con la sonda piatto o ad ultrasuoni. </li><li> Sollevare fase di iniezione di nuovo all&#39;altezza originale, con gli ultrasuoni probe direttamente sopra Probe embrioni deve essere un po &#39;sommerso e entro 3-4 mm del tessuto embrionale. Usa X &amp; Y manopole di regolazione fase (Figura 8) per modificare la posizione dell&#39;embrione / madre / stage per individuare sistematicamente cuore embrionale battere. </li><li> Direttamente Centro di schermo ultrasuoni osservare un pennarello nero bersaglio centro disegnato (*). Individuare ventricolo sinistro (preferibile) o Atrium con le manopole di regolazione fase X &amp; Y (Figura 8) e poi alzare o abbassare il palco con la manopola girevole sul palco per posizionare obiettivo iniezione esattamente sopra il marker nero sullo schermo ultrasuoni. </li><li> Utilizzare X manopola di regolazione fase embrionale per spostare a destra, fuori dello schermo ultrasuoni. Riposizionare microiniezione ago e il braccio in posizione, ½ cm di distanza dal e 90 ° rispetto alla sonda ecografica (Figura 7). </li><li> Utilizzando microiniezione montaggio manopole di regolazione (figura 9C-G), la posizione dell&#39;ago con la punta chiaramente aligned con il marcatore centrale. Regolare l&#39;angolo di iniezione (con manopole in Figura 9C &amp; EG), e X, Y, Z e vettori di micro-aghi per garantire punta dell&#39;ago è focalizzata nel piano corretto. Ritrarre microiniezione ago utilizzando esclusivamente la manopola &quot;iniezione&quot; (Figura 9F), attenzione a non modificare altre dimensioni. </li><li> Ancora una volta, utilizzando esclusivamente l&#39;X regolazione fine manopola fase embrionale mossa di nuovo sotto la sonda, con l&#39;obiettivo esattamente sul segno centrale sullo schermo ultrasuoni. Assicurarsi che il ventricolo sinistro è ora esattamente nella stessa X, Y, e Z aereo. </li><li> Successivamente, con la sola manopola &quot;iniezione&quot; sul supporto microiniezione, lentamente forare embrione con l&#39;ago microiniezione e gradualmente portare punta nel ventricolo sinistro. Iniettare il pieno di 2,5 ml di soluzione di TL in ventricolo sinistro o fino a quando i segnali acustici di allarme vuote, tenendo &quot;vuoto&quot; e toccando &quot;riempire&quot; una volta (figure 2A &amp; B). In questo momentodell&#39;iniezione osservare un&#39;ombra proveniente dalla punta dell&#39;ago che è la TL entrare nella camera cardiaca (Figura 10). In contrario, ritirare rapidamente microiniezione ago ruotando la manopola &quot;iniezione&quot; (Figura 9F) sulla microiniezione monte quando l&#39;iniezione è completa. </li><li> Proseguimento per il prossimo dell&#39;embrione e ripetere la procedura per embrioni rimanenti seguito questa serie di passaggi e, infine, mettere gli embrioni finali nuovamente dentro l&#39;addome della diga. Passare anestesia a scatola da camera e spostare delicatamente la madre qui per 15 minuti dal momento dell&#39;ultima iniezione. </li></ol> 4. raccolta embrioni e analisi <ol><li> Sacrifica diga via dislocazione cervicale. Espandere l&#39;incisione laparotomica per rimuovere facilmente le corna uterine dalla madre. Mantenere gli embrioni all&#39;interno dell&#39;utero sac. Mettere embrioni in raffreddato PBS. </li><li> Sezionare embrioni da uterino sac (se il tessuto necessario per raccogliere genotipizzazione) e porre il tutto embrione in 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte, poi in 30% di saccarosio durante la notte, congelare in criostato sezionamento di media. Poi tagliare il cryosection e posizionarlo su vetrini per l&#39;analisi immunoistochimica. Facoltativamente, utilizzare tessuti di tutto il montaggio da disidratazione in 100% di metanolo, dopo fissazione in 4% PFA. </li><li> Per l&#39;analisi immunoistochimica mettere le criosezioni in PBS per rimuovere Office. Poi bloccare le sezioni con siero normale asino 10% per 30 min. Quindi aggiungere anticorpo primario PECAM a 1: 100 diluizione notte a 4 ° C. Il giorno dopo, lavare i vetrini in PBT 3 volte per 10 minuti ciascuno e aggiungere asino contro ratto 594 secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: Questa è una tecnica molto esigente che richiede l&#39;ottimizzazione e il coordinamento di ultrasuoni e microiniezione. C&#39;è una curva di apprendimento molto ripida legati a questa tecnica e richiede 4-6 settimane di iniezioni mentore prima si diventa abili. </li></ol>

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	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microiniezione anestesia e tempi Per quanto riguarda anesthetization della madre, è essenziale per mantenere costante il flusso d&#39;aria (2-3 L / min) e la bassa PSI. Il flusso del sedativo deve essere tenuto a circa 1,75-2 L / min. Contemporaneamente, tempi in cui le iniezioni hanno luogo devono essere attentamente monitorati e controllati per con ogni cucciolata. Per ogni cucciolata la procedura di iniezione deve essere tenuto sotto 45 min. L&#39;importanza di tale termine è fondamentale per l&#39;esperimento, poiché ogni embrione deve essere mantenuto entro una gamma normale frequenza cardiaca costante per facilitare perfusione controllato ed invariabile tutto il corpo e organo di interesse. Abbiamo scoperto che l&#39;allungamento iniezioni risultati in risultati dubbi e le fluttuazioni nei modelli di perfusione tra embrioni e abbassa i tassi di iniezioni di successo (ad esempio, frequenza cardiaca, morte cardiaca). Infine, dopo l&#39;ultima iniezione entro la lettiera, è essenzialeper consentire a circa 15 minuti prima che gli embrioni vengono raccolti per facilitare una corretta, perfusione completa all&#39;interno di ogni embrione. Trattamento e la cura degli embrioni procedurale Durante l&#39;estrazione degli embrioni, abbiamo trovato maggiori tassi di successo con iniezioni che sono ottiene costantemente curando la salute e l&#39;integrità del rivestimento uterino e embrioni generale durante l&#39;estrazione embrione. Utilizzando gli applicatori di cotone con punta delicati (saturi con PBS) per manipolare e manovrare il sacco uterina e sacculi sono indispensabile per garantire la sopravvivenza della madre e degli embrioni durante tutta la procedura. In primo luogo, è importante assicurare che l&#39;integrità fisica dell&#39;utero e della placenta è correttamente mantenuta. Evitare contorcersi le sacculi in un modo che ostacolare il flusso di sangue per gli embrioni o causare rotture significative in vasi sanguigni che forniscono il flusso di sangue alla placenta. Questo può essere ottenuto estraendo un maximum di 1-2 embrioni alla volta (a meno estraendo l&#39;intero sac uterino per conteggio iniziale) e posizionando applicatori distanti principali vasi sanguigni alla base della placenta. Posizione del sito di iniezione Embryonic Guida l&#39;ago microiniezione nella posizione corretta con la macchina ad ultrasuoni è anche fondamentale per ogni tentativo di iniezione. Particolare attenzione deve essere data al posizionamento e centraggio del ventricolo sinistro del centro. Successivamente, l&#39;ago deve essere posizionato e centrato precisamente sul marcatore centro e per allineare l&#39;ago e il sito di iniezione secondo lo stesso piano Y X e. Una volta che questo è completo, lentamente disegnare la punta dell&#39;ago più vicino al sito di iniezione e di evitare l&#39;applicazione di stress eccessivo per il pericardio e il cuore. Questo viene fatto consentendo l&#39;ago di passare gradualmente attraverso strati di tessuto, piuttosto che forzare il passaggio dell&#39;ago attraverso di loro. Durante l&#39;iniezione, è anche importante look per un&#39;ombra nera proveniente dalla punta dell&#39;ago (Figura 10). Questo è indicativo della soluzione TL riempimento del ventricolo. Se la punta dell&#39;ago è nella posizione corretta, l&#39;ombra deve continuamente appaiono e scompaiono come TL viene espulso in aorta. Tuttavia, se la cavità pericardio sembra engorge, ciò è indicativo che l&#39;ago è fuori del ventricolo sinistro e la soluzione TL sta riempiendo la cavità pericardico circonda il cuore. Questo è un errore comune che è facilmente correggibile riposizionando l&#39;ago per l&#39;iniezione sul suo X e Y piano, con eventuali piccoli aggiustamenti che si svolgono con l&#39;ago ancora all&#39;interno dell&#39;embrione. Evitare estrarre l&#39;ago dal embrione in questo stadio. Ecoguidata in limitazioni microiniezione vivo Intrinsecamente, la microiniezione ecografia possiede un certo numero di limitazioni tecniche fondamentali. In primo luogo, il volume ago microiniezioneCapacità restringe la fascia d&#39;età di iniezioni a E17.5 nel topo. 2,5 ml di soluzione TL è stato dimostrato nei nostri studi di perfusione completamente embrioni fino a E15.5. Tuttavia, proprio seguendo questo punto di tempo, il TL in rapporto al volume di sangue diventa a minuscoli e diluita di taggare efficacemente membrane endoteliali renali periferici. Così, un&#39;immagine diminuito del flusso di sangue è presente al punto temporale iniezioni successive. Inoltre, la formazione di osso e cartilagine nell&#39;embrione crea una barriera naturale per la punta dell&#39;ago, determinando in tal modo i tempi di iniezione allungate e frequenti crepe nella testa dell&#39;ago. Tali limiti possono essere superati utilizzando un sistema iniezioni nuovi con maggiori capacità di resistenza dell&#39;ago e di volume. Tecniche di mappatura del flusso sanguigno embrionali alternativi Ad oggi, i metodi alternativi di mappatura embrionale flusso di sangue del mouse includono l&#39;attuazione di calchi in resina, immunoistochimica colorazione, e alta resolut<html> ion ecografia. Come calchi resina (con l&#39;integrazione di tecniche di imaging avanzate) sono attualmente l&#39;alternativa più popolare, questo sarà discusso in maggior dettaglio di seguito. Calchi in resina consentono la creazione di tre rappresentazioni tridimensionali accurate di flusso all&#39;interno di organi dopo la nascita. Tuttavia, poco successo è stato avuto con tessuto renale prenatale di imaging a causa porosa vascolarizzazione del sangue e le limitazioni in risoluzione. In confronto, macchie TL coniugati consentono bonding endoteliali antigeni di membrana che portano ad un elevato grado di precisione. In altri casi, resina viscosità tronca prematuramente flusso in vasi glomeruli e piccoli capillari, creando limitazione in fase di sperimentazione a ingrandimenti elevati. A ingrandimenti inferiori, questa tecnica è chiaramente praticabile a stabilire modelli di flusso nelle regioni in via di sviluppo. Al contrario, TL consente l&#39;analisi ad alta risoluzione del flusso di sangue rispetto a strutture di sviluppo a livello cellulare. ent &quot;&gt; La futura applicazione e le indicazioni I nostri dati suggeriscono che il flusso di sangue e l&#39;ossigenazione sono fattori critici per quanto riguarda la differenziazione nefrone progenitore. Per chiarire ulteriormente il loro ruolo nello sviluppo renale, indagini future devono delineare meccanismi anatomici sottostanti precipitanti questo processo fisiologico come pure esaminare vie di segnalazione trascrizionali che mediano questo fenomeno pure. Una ipotesi, per quanto riguarda colmare il divario tra fenomeno e il meccanismo, è che la cellula muscolare e periciti aggregati lisce giocano un ruolo contributivo nell&#39;orchestrare il troncamento transitorio del flusso sanguigno in regioni di cellule staminali di organi in via di sviluppo. Per testare questa, un&#39;ulteriore colorazione e l&#39;analisi di immunofluorescenza devono essere condotte con particolare attenzione su questi tipi di cellule, al confine della zona nefrogenica. In termini di future indagini sottostanti vie di segnalazione, vorremmo esplorare il ruolo dell&#39;ipossia fattori inducibili eVon Hippen Lindau vie di segnalazione. Entrambi sono stati in gran parte implicata in tutta la letteratura come giocare ruoli importanti induttivi nel mantenimento ipossico e ambienti ossigenati all&#39;interno delle regioni di cellule staminali (in gran parte visto essere ipossico) e aree di differenziazione (aree più bisognose di ossigenazione), rispettivamente. Inoltre, vorremmo interrogare il ruolo di eritropoietina (EPO), nel mediare i processi di angiogenesi e vasculogenesi durante lo sviluppo vascolare del rene. EPO è una glicoproteina renale che svolge un ruolo critico nel differenziamento endoteliale e manutenzione. Il suo ruolo nel sangue mediata differenziazione endoteliale è in gran parte sconosciuto. Infine, vorremmo condurre esperimenti di microiniezione vivo con composti vasodilatazione per rafforzare ulteriormente la validità di queste indagini.

Durante lo sviluppo embrionale, due processi vascolari discreti, ma simultanei avvengono: angiogenesi, il processo mediante il quale una nave cresce da un vaso, e vasculogenesi pre-esistente, che è una formazione de novo di navi da residenziali progenitori endoteliali 1,2. Rispettivamente, il primo è sinonimo di flusso sanguigno, mentre il secondo è pensato avvenire sostanzialmente in assenza di esso. Simultanea di formazione dei vasi sanguigni, un processo ciclico e dinamico della sintesi progenitrici delle cellule renali, la proliferazione e la differenziazione comincia a svolgersi il giorno embrionale 9.5 (E9.5). A questo punto la gemma ureterale (UB) invade dorsale in circostante mesenchima metanefrico (MM), e continua fino alla nascita 3. Ripetuto ramificazione della UB in rapida condensazione metanefrico tappo mesenchima inizia la formazione delle unità funzionali del rene, nefrone. Con ogni nuova generazione di UB e nephron, le vecchie generazioni sono collocate in regioni corticali e midollari interni, dove poi subiscono ulteriore maturazione e differenziazione all&#39;interno di ambienti prevalentemente vascolare-densi. Come evidenziato da Dressler et al. 3, questo processo embrionale viene precipitato mediante segnalazione induttivo, come crosstalk tra UB e MM, e una miriade di fattori extracellulari 3-6. Due fattori extracellulari recentemente esaminato entro il pancreas e reni in via di sviluppo includono tensione di ossigeno e il flusso di sangue 7,8. Quest&#39;ultimo sarà discusso in maggior dettaglio nel seguito con riferimento allo sviluppo del rene. Per esporre il ruolo induttiva che il flusso di sangue potenzialmente gioca nella differenziazione delle cellule progenitrici nefrone, così come in altri processi organogenesi, metodi precise ed accurate di mappatura del flusso sanguigno embrionale è imperativo. Metodi alternativi di misurazione del flusso sanguigno includono la prescrizione di ultrasound immagini e resina calchi 9,10. Conclusivamente, queste modalità hanno dimostrato di essere intrinsecamente carente nella loro capacità di svelare contemporaneamente giustapposizioni temporali e spaziali tra il flusso di sangue e di differenziazione delle cellule staminali. Calchi in resina, per esempio, offrono un valido modello di patterning nave nei tessuti adulti, ma in vasi immaturi, come ad esempio con punti di tempo embrionali, le navi sono gravemente sottosviluppati e perde. Pertanto, la resina getta non riescono a tenere all&#39;interno dei vasi piccoli, spesso porosi,. Per questi ostacoli apparenti, tra gli altri, abbiamo scelto di integrare ecoguidata in vivo intra-cardiaca embrionale lectina pomodoro (TL) microiniezioni nelle nostre indagini di sviluppo del rene. In questa procedura utilizziamo una sonda ad ultrasuoni per guidare in modo sincrono una micropipetta ago montato riempita con 2,5 ml di soluzione TL nel ventricolo sinistro di embrioni di topo in punti E11.5, E13.5, E15.5 e E17.5 tempo. E17.5 È l&#39;ultima età evolutiva come gli aghi non sono abbastanza forti per penetrare l&#39;embrione più sviluppato. I vantaggi di questo metodo sono abbondanti microiniezione. Microiniezione Ultrasound-guida permette il posizionamento preciso di un ago per iniezione nel ventricolo embrionale di sinistra, espulsione passiva e controllata della soluzione nel cuore pulsante dell&#39;animale, il minimo danno al cuore e tessuti circostanti, e la prevenzione di improvvisa insufficienza cardiaca e morte embrione prima della perfusione tutto il corpo. Con l&#39;uso di un TL FITC-marcato, qualsiasi vascolarizzazione perfuso manterrà il marker lungo il suo endoteliale membrana apicale. In combinazione con l&#39;immunoistochimica, utilizzando pecam (CD31, Platelet endoteliale molecola di adesione delle cellule) e vari altri marker vascolari, siamo in grado di distinguere chiaramente tra navi perfuso e non-perfusione, nonché caratterizzare qualsiasi colorazione anomala dei tessuti circostanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

La formazione e la perfusione di sviluppare vasi sanguigni renali (a parte glomeruli) sono molto poco studiato. Come vascolare si sviluppa attraverso l&#39;angiogenesi (che è la diramazione dei vasi) e vasculogenesi (de novo formazione dei vasi), tecniche di mappatura di perfusione, come calchi in resina, in vivo imaging ad ultrasuoni, e micro-dissezione sono stati limitati a dimostrare le relazioni intime tra questi due processi e le strutture renali in via di sviluppo all&#39;interno dell&#39;embrione. Qui, descriviamo la procedura di in utero intra-cardiaca ecoguidata FITC-etichettati pomodoro microiniezioni lectine su embrioni di topo per valutare l&#39;ontogenesi della perfusione renale. Pomodoro lectina (TL) è stato perfuso tutta l&#39;embrione e reni raccolto. I tessuti sono stati co-colorate per varie strutture renali, tra cui: i progenitori nefrone, strutture nefrone, ureterale epitelio, e vascolare. A partire da E13.5 grandi vasi di grosso calibro sono stati perfusi, tuttavia periferichenavi rimaste unperfused. Con E15.5 e E17.5, piccoli vasi periferici e glomeruli iniziato a diventare perfusione. Questa tecnica sperimentale è critico per studiare il ruolo della vascolarizzazione e del flusso sanguigno durante lo sviluppo embrionale.

Formazione vascolare precede flusso in via di sviluppo del rene La maggioranza di tessuto embrionale (compreso il rene) contiene un sistema vascolare denso (sia unperfused e perfuso), anche a primi punti temporali embrionali. Per meglio calibro e analizzare il flusso di sangue all&#39;interno del rene sviluppo abbiamo utilizzato un metodo di In Utero microiniezioni intracardiache embrionali. Con l&#39;uso di un ultrasuoni ad alta risoluzione per identificare cuore embrionale E11.5 E17.5 attraverso, e dopo l&#39;estrazione e l&#39;esposizione di un singolo saccule uterina mediante una laparotomia, siamo stati in grado di iniettare 2,5 ml di TL (isotiocianato di fluoresceina (CIC) -conjugated). Abbiamo trovato la più grande iniezione E13.5 successo e E15.5 punti di tempo embrionali, con una percentuale di successo di circa il ~ 80% al 90%, rispettivamente. A causa della presenza di un cuore relativamente immaturo a E11.5 e una esistenza di denso cartilagine e la formazione di osso E17.5, TI perifericome punti sono relativamente difficili da iniettare, con una probabilità di successo sostanzialmente inferiore rispetto alle medie punti temporali embrionali. Ci si può aspettare almeno il ~ 50% ~ 30% e tassi di successo con E11.5 e ora E17.5 punti rispettivamente. In tessuto co-marcatura con PECAM (CD31), un marker endoteliale universale, siamo in grado di categorizzare qualitativamente vasi e tessuti fluorescenti in tre gruppi: vasi perfusi (PECAM positivo e TL positivo), vascolare unperfused (pecam positivo), e aberrante perfuso strutture (TL positivo). Questo particolare pattern di colorazione consente di distinguere spazialmente tra le aree di perfusione e non-perfusione (Figura 11). A E11.5, abbiamo scoperto che le navi perfusi incapsulano il rene di sviluppo in un modello web-like senza effettivamente penetrare nell&#39;organo (Figura 12B). Da E13.5, grandi navi sono state perfusi con alcuni dei più piccolivasi accessori colorazione con TL (Figura 12C). La colorazione può essere visto anche durante alcune dell&#39;epitelio ureterale, questo può essere sia da glomeruli già perfuso o per la leakiness intrinseca dei primi vasi embrionali. Con E15.5 grandi vasi sono stati perfusi tuttavia numerosi glomeruli potrebbe anche essere osservato che tiene la macchia TL, suggerendo che il filtraggio avviene significativa (Figura 12D). Anche in questo momento indicare un numero di navi più piccole calibro apparire perfusi, anche se una parte significativa della zona nefrogenica esterna sembra essere privo di flusso sanguigno. Infine, tuttavia, E17.5 maggioranza del rene è stato perfuso eccezione vascolarizzazione della zona nefrogenico, che è prevalentemente privo di perfusione (comunque densa in pecam vasi positivi) indicando così un&#39;assenza di angiogenesi in regioni periferiche. Vasi di calibro più piccoli contengono TL e il numero medio di glomeruli perfusi ha drammaticamente inaumentati rispetto ai punti temporali precedenti (Figura 12E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig1.jpg" /> Sonda Figura 1. Ecografia, fase chirurgica, sistema di microiniezione, sistema ferroviario, e ECG / monitor temperatura set up di base. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig2.jpg" /> Figura 2. Attrezzatura necessaria chirurgici, soluzioni e dispositivi. (A) applicatori di cotone con punta. (B) L&#39;estensione (Ring) pinze. (C) forbici chirurgiche. Pinze (D) Blunt-punta. (E) pinza sottile. (F) Microiniezione Needle (ORIGIO, # C060609). (H) Iniezione / Fill controller. (I) tampone fosfato (PBS). (J) Mineral Oil (Sigma Aldrich). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig3.jpg" /> Figura 3. A 2 cm laparotomia viene effettuata sulla madre anestetizzato, esponendo lo strato sottocutaneo (parete addominale) sopra l&#39;utero. Utilizzando le forbici chirurgiche e una pinza sottile, esporre la linea alba e fare un&#39;incisione parallelo epidermica taglio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig4.jpg" /> Figura 4. 1-2 E15.5 sacculi uterini estratti attraverso un&#39;incisione laparotomia ed esposti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una più grande</a>versione della figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig5.jpg" /> Figura 5. Exposed sacculi uterini guidati attraverso fessura capsula di Petri fenestrata con pinze estendono. Fenestrato meshing posti snuggly alla base delle sacculi. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig6.jpg" /> Figura 6. Blu muro di contenimento posta a destra del sacculi uterini. Piatto Petri riempita con 37 ° C PBS fino embrioni e contenente pareti sono completamente sommerso. Blocchi in laterizio collocati saldamente sotto Petri-dish / embrione tra braccia e il corpo e le gambe e la coda. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig7.jpg" /> Figura 7. Positio Sistema di iniezione<html> ned ½ cm verso sinistra e sotto, e 90 ° a sonda ecografica. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig8.jpg" /> Figura 8. Fase X e meccanismi di regolazione Y. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig9.jpg" /> Figura 9. Vuoto / Fill dispositivo, sistema microiniezione, e in scena monte. (A) pulsante Fill. (B) Pulsante Iniettare. (C) ago circolare manopola di regolazione dell&#39;angolo. Manopola di regolazione (E) Belle X. Manopola (F) &quot;Injection&quot;. Manopola di regolazione (G) Corso X. (H) palcoscenico girevole manopola di regolazione in altezza. <html> 98fig10.jpg &quot;/&gt; Figura 10. Ecografia immagine di E15.5 TL microiniezione. Tip Needle intra-cardiaca è posizionato all&#39;interno della camera cardiaca, soluzione TL è indicato da un&#39;ombra nera in due camere. Pericardio e la cavità pericardica sono facilmente distinguibili. <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig11.jpg" /> Figura 11. Aree tra perfusione, unperfusion, e la colorazione anomala discernimento. Il primo pannello mostra la macchia pecam. Il pannello centrale mostra la macchia TL sopra esattamente la stessa area di tessuto. Ureteric bud è aberrante macchiato; grandi navi sono racchiusi da linee bianche tratteggiate. L&#39;ultimo pannello è l&#39;unione. Frecce bianche indicano perdite nave, e le frecce grigie mostrano una transizione verso una nave diventando perfuso. Strutture gialle rappresentano vascolarizzazione completamente perfusione.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande della figura. <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig12.jpg" /> Figura 12. Embrioni e perfusione renale ontogenesi è indagato. (A) totale E11.5 embrione è perfuso, con i vasi molto periferici all&#39;interno delle regioni di testa e di coda che fissano il TL. (B) navi perfuso sono stati osservati circostante, ma non inseriti nel rene di sviluppo a E11.5 in un modello nastriforme, vi è anche abbastanza una grande quantità di colorazione diffusa a questo punto. (C) E13.5 rene mostra grandi, grandi vasi di calibro sono perfusi tutto rene (freccia bianca e gialla), con perfusione assente nella zona nefrogenica (bianco linea tratteggiata). (D) E15.5 rene mostra perfusione tutta piccolo calibro, vasi periferici (frecce gialle),in alcuni glomeruli (frecce bianche), e ancora un&#39;assenza di perfusione a mantello periferico reni. (E) E17.5 rene mostra vasto perfusione tutto glomeruli (frecce bianche) e piccoli vasi calibro (frecce gialle). La zona nefrogenica è indistinguibile dal resto del rene a questo ingrandimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig12large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.</a>

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

In Utero iniezioni intra-cardiaca di pomodoro-lectine su embrioni di topo per valutare renale Blood Flow

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K Views.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

Utilizzo della citometria a flusso per rilevare e quantificare la formazione di sangue alterato nel pesce zebra in via di sviluppo

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...