Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) assegnato a Forest Rohwer. Ringraziamo Epicentre, una società di Illumina per fornire accesso anticipato ai kit Ribo-Zero Epidemiologia. Ringraziamo Mark Hatay per la progettazione e la produzione del supporto tubo ultracentrifugazione. Ringraziamo Andreas Haas e Benjamin Knowles per letture critiche e le discussioni del manoscritto, e Lauren Paolo per assistere il processo di ripresa.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomica virali Particelle virali sono concentrati utilizzando polietilene glicole (PEG) precipitazione o piccoli concentratori di volume. In alcuni casi, la concentrazione può non essere necessario, ma pre-filtrazione o centrifugazione a bassa velocità passi sono usati per rimuovere le cellule eucariotiche e microbiche. Lisati virali saranno ulteriormente arricchite e purificati mediante gradiente di densità ultracentrifugazione 9,41 o filtri di piccole dimensioni (ad esempio, 0,45 micron) per rimuovere le cellule microbiche eucariotiche e grandi 25. Gradiente di densità ultracentrifugazione viene in genere effettuata con soluzioni dense ma inerti come saccarosio o di cesio cloruro di isolare e concentrare le particelle virali 41. La separazione fisica si basa sulla dimensione e densità di galleggiamento di particelle virali. Pertanto, la corretta scelta della dimensione dei pori del filtro e la rigorosa preparazione di gradienti sono essenziali per isolare comunità virali specifici, come il successo del recupero fisico diVLP determina la comunità isolata 41 (cioè particelle virali che non passano attraverso il filtro o rientrano la densità di estrazione non saranno rilevate nel metagenoma). Dopo isolamento virale e concentrazione, ci possono essere contaminanti non virale materiale genomico presente nel campione sia nella forma di acidi nucleici liberi e microbica e cellule eucariotiche. Pertanto, è fondamentale per verificare la purezza di particelle virali nei campioni (Figure 1A e 1B). Un trattamento cloroformio è comunemente utilizzato per lisare cellule rimanenti, seguito da un trattamento con nucleasi di degradare gli acidi nucleici liberi prima dell&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico. Un avvertimento al flusso di lavoro presentato è stato l&#39;uso della separazione gradiente di densità per isolare le particelle virali come può escludere particelle virali con involucro che possono essere troppo positivo per inserire il gradiente di CsCl. Un&#39;alternativa &quot;catch-all&quot; metodo è quello di omettere la SEPAR gradiente di densitàzione e isolare il DNA comunità dalle 0,45 micron - filtrati trattati con cloroformio e DNasi I. Questo approccio è anche opportuno accogliere piccoli volumi di campione come quelli di tamponi o plasma sanguigno. Tuttavia, ciò può provocare la contaminazione batterica cloroformio-resistenti e superiori quantità di DNasi I-resistenti DNA extracellulare. Protocolli di sequenziamento attuali richiedono 1 ng a 1 mg di acidi nucleici per la preparazione biblioteca sequenziamento del DNA per cui i rendimenti più elevati offrono una scelta più ampia di opzioni di sequenziamento. La concentrazione di DNA viromes generati varia spesso da sotto del limite di rilevazione a più di 200 ng / ml. La quantità di acidi nucleici virali recuperati può essere insufficiente per la preparazione diretta biblioteca sequenziamento. In tali casi, l&#39;amplificazione dell&#39;acido nucleico è essenziale. Amplificazione fucile librerie Linker (LASLs) 2,42,43 e tutta l&#39;amplificazione del genoma basata su più spostamenti di amplificazione (MDA) sono i duemetodi più comunemente utilizzati per generare DNA sufficiente per sequenziamento. MDA metodi come quelli basati su Phi29 DNA polimerasi sono noti a soffrire di pregiudizi amplificazione, e possono amplificare preferenzialmente ssDNA e DNA circolare, con conseguente tassonomico non quantitativa e caratterizzazione funzionale 44,45. Una versione ottimizzata dell&#39;approccio LASLs ha dimostrato introdurre solo distorsioni minime, promuove maggiore sensibilità (per piccole quantità di materiale di partenza), ed è facilmente adattato per diverse piattaforme 43 sequenziamento. Tuttavia, l&#39;approccio ha molti passaggi, richiede attrezzature specializzate per ridurre al minimo la perdita di DNA, ed è limitata ai modelli dsDNA. Nel nostro laboratorio, questo approccio è stato adattato con successo per amplificare quantità rilevabile e non rilevabili di DNA estratto da lavage- broncoalveolare, VLP-derivati ​​acqua coralline e mare (inediti e Hurwitz et al. 46). Lo sviluppo di gasdotti di analisi dei dati ha classically stato uno degli aspetti più impegnativi di analisi metagenomica virale a causa della natura altamente diversificata e in gran parte sconosciuti delle comunità virali. Mentre ci sono circa 10 8 genotipi virali nella biosfera, ad oggi attuali banche dati virali contenere ~ 4.000 genomi virali, che è circa 1 / 100.000 di questa diversità virale totale approssimativa. Pertanto, le ricerche basate similarità (come BLAST 47) per l&#39;assegnazione tassonomica e funzionale in metagenomi virali possiedono sfide inerenti. Molte sequenze non avere analogie significative genomi nel database, e di conseguenza, sono classificati come sconosciuti. Anche se le ricerche basate omologia-sono le applicazioni più importanti per l&#39;assegnazione di tassonomia e la funzione per la sequenza di dati, metodi alternativi basati su analisi indipendente dal database sono stati sviluppati 48- 50. Fancello et al. 51 forniscono una revisione completa di strumenti di calcolo e gli algoritmi utilizzati in Virametagenomica l. Microbica Metagenomica Tipicamente, la quantità totale di DNA estratto da comunità ipotonici lisi trattati microbiche (HL-DNA) vanno da 20 ng a 5 mg. La resa è fortemente dipendente dallo stato di salute del paziente e la quantità di campione di espettorato raccolti, che spiega le variazioni visti nella resa totale di HL-DNA estratto in questo studio (Tabella 2). I passaggi critici per generare dati di sequenza buona qualità affidamento sulla qualità delle librerie sequenziamento generati. Figura 2 mostra un intervallo tipico dimensioni per le librerie sequenziamento generati dal DNA microbico CF espettorato derivato utilizzando una procedura basata frammentazione del DNA enzimatica-. La dimensione ottimale biblioteca dipende dalla scelta della piattaforma sequenziamento e l&#39;applicazione, e di conseguenza, la procedura frammentazione può essere ottimizzata, se necessario, attraverso approcci alternativi come sonicazione e nebulizzazione. Inoltrei risultati rappresentativi presentati, il successo del metodo presentato su espettorato CF raccolti da più pazienti su più punti di tempo è anche illustrata in Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10. Studi precedenti 9,10 suggeriscono che ogni paziente ospita un set unico di comunità microbica che sposta nel tempo, riflettendo così la persistenza dei principali attori all&#39;interno della comunità, mentre fluttuazioni sono probabilmente dovute a perturbazioni quali trattamenti antibiotici. Se queste fluttuazioni si verificano quotidianamente anche senza perturbazioni esterne oa causa di modalità di campionamento e trattamento del campione, è ancora in discussione. Basato sul metagenomic HL-DNA e l&#39;analisi amplicon 16S rDNA, il campionamento longitudinale 7 giorni mostra che la fluttuazione giornaliero di profili microbici senza perturbazioni antibiotico (giorno 1, 2 e 3) è minima (Figure 3A e 3B). Su introproduzione di antibiotici per via orale subito dopo il Day 3 di campionamento, i cambiamenti nel profilo di comunità divenne evidente il giorno 4. Mentre la ciprofloxacina antibiotico si rivolge a un ampio spettro di batteri patogeni noti come P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus e la polmonite, il trattamento aumentato la relativa abbondanza di P. aeruginosa mentre diminuendo il spp Streptococcus. e P. melaninogenica. By Day 6, la comunità lentamente recuperato alla struttura iniziale comunità di partenza. I risultati suggeriscono che le fluttuazioni dei profili microbici all&#39;interno di un singolo paziente è più probabile a causa di perturbazioni della comunità nelle vie aeree. Data la coerenza tra i profili microbici delle biblioteche 16S rDNA e metagenomi di DNA HL-derivato, abbiamo escluso i pregiudizi derivanti dai primer 16S rRNA utilizzati in questo studio. Una possibile spiegazione per le differenze viste attraverso 16S rDNA tassonomicaprofili AL generati dal DNA totale e DNA HL-derivato (Figura 3B) possono essere la presenza di elevate quantità di Pseudomonas spp. DNA extracellulare dopo il trattamento antibiotico. Questo è supportato dai risultati che queste differenze sono più evidenti a 7 ° giorno, tre giorni dopo il trattamento di antibiotici, che si rivolge Pseudomonas spp. oltre ad altri. La ciprofloxacina è comunemente usato come trattamento di prima linea nei pazienti con FC e P. cronica infezione aeruginosa anche se il suo spettro di attività include la maggior parte patogeni CF-associate. Abbiamo ipotizzato che il trattamento antibiotico sradica le comunità a rischio, tra cui Streptococcus spp. e quindi la creazione di una nicchia riempito da resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa può ottenere aumentando la resistenza sue comunità biofilm e DNA extracellulare ha dimostrato di essere il principale sostegno strutturale della sua architettura biofilm 52. Anche se tegli struttura della comunità recuperato, DNA extracellulare può stare nella CF sputo. Pertanto, questi dati suggeriscono che la lisi ipotonica e le fasi di lavaggio presentati in questo flusso di lavoro potenzialmente beneficiare non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma il DNA extracellulare anche microbica derivato che possono falsare i profili microbici reali. Metatranscriptomics Un&#39;alta qualità metatranscriptome deve contenere relativamente poche sequenze di RNA ribosomiale (rRNA) e rappresentano un campione imparziale delle trascrizioni comunità (mRNA). A causa della breve emivita e quantità limitata di mRNA, è fondamentale che il protocollo, come presentato qui, riduce al minimo la manipolazione del campione per massimizzare il numero di trascrizioni recuperati. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. Questi includono MicroB Enrich, Ribo-Zero, e specifici del campione sottrattiva hybridizations 53 che si basano sulla oligonucleotide ibridazione, e l&#39;mRNA SOLO kit che si basa sull&#39;attività enzimatica exonuclease RNA mira contenente un &#39;monofosfato 5. Inoltre, diversi approcci per arricchimenti mRNA come il MessageAmp Kit II-I batteri che polyadenylates preferenzialmente ed amplifica RNA lineari sono inoltre disponibili. Alcuni di questi metodi (ad esempio, di mRNA-ONLY, MicroB E Xpress e la MessageAmp) vengono utilizzati contemporaneamente per l&#39;efficienza ottimale. Tuttavia, l&#39;efficacia di tutti questi approcci sono limitati, in particolare quando si lavora con parzialmente degradata rRNA, come spesso osservato in RNA totale estratto da campioni CF. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato per generare metatranscriptomes costituiti sia mRNA eucariotico e procariotica. Inoltre, il poli (A) coda aggiunto alle sequenze può ridurre la quantità di dati di sequenza utili. Regioni con tratti omopolimero tenderanno ad avere punteggi di qualità inferiori, causing un numero significativo di legge per essere filtrati dal sequenziamento e software di post-sequencing, e la durata media di lettura utile dopo il taglio off poly (A) code saranno ridotti significativamente 54. Trattare con le comunità microbiche complesse CF e RNA parzialmente degradati (Figure 4A e 4C), il nostro studio precedente ha mostrato che il metodo di ibridazione-capture dal kit oro Ribo-Zero è stato più efficace nella rimozione sia rRNA umana e microbica rispetto ai trattamenti combinare con altri kit 9 (tabella 3). I dati risultante permette l&#39;analisi simultanea di entrambi ospite umano e trascrizioni microbiche. A seconda della resa e la qualità dell&#39;RNA, nonché scelta definitiva della piattaforma di sequenziamento, molti di questi processi compreso sintesi passo cDNA possono essere semplificati con generazione librerie sequenziamento. Ad esempio, RNA trattato Ribo-Zero può essere usato per fare metatranscriptome sequenziamento libraRies utilizzando kit ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparazione. Analisi metagenomica di comunità animali associate fornisce una rappresentazione completa dell&#39;entità funzionale globale che comprende l&#39;host e le sue comunità associate. Il flusso di lavoro qui presentato è adattabile ad una varietà di campioni animali associata complesse, in particolare quelli che contengono muco denso, elevate quantità di detriti cellulari, DNA extracellulare, proteine ​​e complessi glicoproteici, così come cellule ospiti, oltre al microbica virale e desiderato particelle. Anche se le particelle virali e microbiche possono essere persi ad ogni passo, particelle isolamento e purificazione sono essenziali per minimizzare la quantità di DNA ospite. Mentre i dati metagenomica offre potenzialità metaboliche delle comunità esaminati, metatranscriptomics completare tale rivelando l&#39;espressione differenziale delle funzioni codificate 9. Una valutazione completa dei dati genomica e trascrizioni ha dato nuove insIRITTI alla dinamica delle interazioni nelle comunità e facilita lo sviluppo di migliorare terapie 9,10,55.

<html> Comunità virali e microbiche associate con il corpo umano sono stati studiati estesamente negli ultimi dieci anni attraverso l&#39;applicazione di tecnologie di sequenziamento 1,2. I risultati hanno portato al riconoscimento dei microbi importanza nella salute umana e la malattia. L&#39;importante iniziativa è venuto dal progetto umano microbioma che descrive i batteri (e alcuni archeobatteri) residenti sulla pelle umana, e all&#39;interno di cavità orale, vie respiratorie, del tratto urogenitale e gastrointestinale 3. Ulteriori studi microbioma di sane vie aeree umani attraverso lavaggio broncoalveolare (BAL) di 4,5 e tamponi nasofaringei 4 hanno dimostrato che il polmone può servire come strumento di campionamento ambientale, i risultati di colonizzazione microbica transitoria nelle vie aeree. Tuttavia, l&#39;impatto della colonizzazione microbica in superfici delle vie aeree con problemi può portare a infezioni polmonari gravi e croniche, come quelli visti in fibrosi cistica (CF) pazienti. t &quot;&gt; CF è una malattia genetica letale causata dalla mutazione in transmembrana della fibrosi cistica regolatore (CFTR) gene 6. Queste mutazioni generano proteine ​​CFTR difettosa che a loro volta influenzano il trasporto di ioni transepiteliale attraverso la superficie apicale dell&#39;epitelio. La malattia colpisce molteplici sistemi di organi, ma la maggior parte di mortalità e morbilità è imputabile a malattie polmonare FC 7. Il polmone CF fornisce un ecosistema unico per la colonizzazione microbica. Il difetto di trasporto di ioni provoca muco per costruire nelle vie aeree CF, creando microambienti, comprensivi di aerobica , microaerofili e scomparti anaerobici ancorati da una superficie mucosa ricca di nutrienti statico. Questo ambiente facilita la colonizzazione e la proliferazione di microbi, tra cui virali, batteri e funghi. acuta e le infezioni microbiche polmonari croniche portano a risposte immunitarie costanti ma inefficaci, con conseguente ampio rimodellamento delle vie aeree, perdita di capacità polmonare, e in ultima analisi pulmofallimento nario. Comunità batteriche associate al polmone CF sono stati ben descritti utilizzando approcci cultura-dipendenti e cultura indipendente, che includono uso 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene sequenziamento 8 e metagenomica fucile 9,10. L&#39;approccio basato rRNA 16S è in grado di caratterizzare una vasta gamma di specie microbiche e catturare ampi cambiamenti nella diversità delle comunità. Tuttavia, è limitata nella sua risoluzione nella definizione comunità (riassunte Claesson et al. 2010 11) e le previsioni di potenziali metaboliche sono limitati a tali funzioni generali noti per il taxa identificati. Pertanto, 16S rRNA metodi di sequenziamento del gene sono insufficienti per il necessario tassonomica e funzionale la precisione analitica delle diverse comunità microbiche presenti nei polmoni CF. L&#39;approccio metagenomica descritto qui completa l&#39;approccio basato rRNA 16S, supera i suoi limiti, e consente un modo relativamente efficaceper analizzare sia la tassonomia comunità microbica e contenuto genetiche nei polmoni CF. DNA microbica isolato da campioni animale associato spesso contiene una grande quantità di DNA ospite. Campioni di espettorato o tessuto polmonare CF solito contengono una grande quantità di DNA umano rilasciata dai neutrofili nella risposta immunitaria, spesso superiore al 99% del DNA totale 12 - 14. Sebbene alcune cellule umane intatti possono essere presenti, la maggior parte di questo DNA è libero in soluzione o adsorbiti sulla superficie dei microbi. Inoltre, la presenza di tappi particolarmente viscosi muco, detriti cellulari e altri contaminanti sconosciuti complicare ulteriormente isolamento delle cellule microbiche. Diversi metodi sono stati testati per deplezione questi campioni di DNA umano, compresi Percoll a gradienti umana separata da cellule microbiche 15, il trattamento con DNasi I, bromuro di etidio monoazide a degradare selettivamente DNA umano 16, e il kit MolYsis, tutti con successo limitato.<html> Ad oggi la procedura di purificazione del DNA microbico più efficace per CF espettorato è una modificazione del processo descritto da Breitenstein et al. (1995) 17. Questo approccio, noto come metodo qui ipotonica lisi (HL), utilizza una combinazione di β-mercaptoetanolo per ridurre mucina legami disolfuro, lisi ipotonica delle cellule eucariotiche e trattamento DNasi I di DNA solubile 9. Nonostante la mancanza di alternative al metodo HL ha sollevato alcune preoccupazioni a causa di (i) eventuali pregiudizi derivanti dalla lisi indesiderato di microbi e (ii) se le fluttuazioni osservate nella composizione della comunità 9,10 sono un artefatto di variazioni associate con l&#39;elaborazione del campione. Oltre alla generazione di metagenomi fucile, abbiamo affrontare questi problemi confrontando i profili del gene 16S rRNA del DNA totale e DNA microbico estratto dal metodo HL utilizzando la stessa serie di campioni di espettorato raccolti da un singolo paziente in sette giorni consecutivi. ent &quot;&gt; Rispetto alla comunità microbiche, la caratterizzazione delle comunità virali associati con gli animali è limitato 18,19 Le comunità virali CF vie aeree sono state caratterizzate solo in minima parte 20 -.. 22 Il primo studio metagenomica caratterizza il DNA delle comunità virali in CF vie respiratorie hanno dimostrato che la maggior parte dei virus associati polmoni CF sono fagi 20. Il potenziale metabolico del fago in CF e individui non-CF è stata significativamente diversa. In particolare, le comunità dei fagi in individui CF effettuate geni riflettente di adattamenti ospitanti batteriche alla fisiologia del CF vie aeree, e batterici di virulenza. 20 studi metagenomiche successivi di virus nel tessuto polmonare CF dimostrato distinto eterogeneità spaziale delle comunità virali tra le regioni anatomiche 22. Inoltre, il tessuto polmonare CF ospitava la diversità virale più basse fino ad oggi in qualsiasi ecosistema 22. La maggior parte dei virus identificati erano fagicon la possibilità di infettare i patogeni CF. Tuttavia, sono state rilevate anche virus eucariotiche quali herpesvirus, adenovirus e virus del papilloma umano (HPV). In un caso in cui sono stati osservati cisti nel tessuto polmonare durante la dissezione, più del 99% di un genoma papillomavirus umano è stato recuperato, anche se il paziente non è mai stato diagnosticato un papilloma polmonare o carcinoma. Ciò indica che la diversità virale presente non solo riflette la gravità del danno tissutale, ma può anche esporre e spiegare una malattia non caratterizzato sottostante. I protocolli descritti forniscono un modo semplice, ma potente per isolare particelle virali (VLPs) da campioni che consistono di grandi quantità di muco denso, di accoglienza e di cellule microbiche, DNA libero, così come detriti cellulari. A complemento metagenomica, metatranscriptomics viene utilizzato per monitorare le dinamiche di espressione genica in tutta la comunità microbica e l&#39;host 9,23. In questo caso, sia microbica e host mRNA devono essere preferenzialmente selezionato. Poiché mRNA batteriche non sono poliadenilato, un metodo di pull-down mRNA basato oligo-dT non può essere sfruttata. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato in campioni ospitanti associata se sono noti i campioni contengono grandi quantità di mRNA eucariotico. Molti campioni animali-associata, compresi CF espettorato, contengono un&#39;alta densità di cellule oltre a elevate quantità di detriti cellulari e nucleasi che includono RNasi. Pertanto, un altro compito impegnativo è quello di evitare una eccessiva degradazione dell&#39;RNA durante metatranscriptome lavorazione. Nella maggior parte dei casi, l&#39;RNA totale estratto da espettorato CF è parzialmente degradata, limitando le applicazioni a valle e l&#39;utilità del RNA derivato. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. L&#39;efficacia di questi approcci è tuttavia limitata, soprattutto quando si lavora con parzialmente degradato rRNA 9,24. I metodi impiegati qui consentonoed per il recupero di RNA totale parziale degrado adatto per la rimozione efficiente rRNA totale valle. Confronto diretto della efficienza nella rimozione rRNA parzialmente degradata da RNA totale confrontando due diversi kit è stato illustrato da Lim et al. (2012) 9. In generale, lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire un set completo di protocolli (figura 1) per generare metagenomi fucile virali e microbiche, e un metatranscriptome, da un singolo campione animale-associata, utilizzando campione di espettorato indotto come esempio. Flusso di lavoro di laboratorio molecolare dovrebbe includere zone pre e post-amplificazione separati per ridurre al minimo la contaminazione incrociata. I metodi sono facilmente adattabili ad altri tipi di campioni come il tessuto 22, nasofaringeo e orofaringei 25, lavaggio broncoalveolare (BAL) e corallo (dati non pubblicati). Ogni campione deve essere trattato immediatamente al momento della raccolta soprattutto quando metagenomica microbica e ha incontratoatranscriptomics studi sono desiderati. Se sono stati congelati i campioni, limita l&#39;isolamento di cellule microbiche intatte per metagenomi microbici come il congelamento potenzialmente compromettere l&#39;integrità delle cellule. Tuttavia, il congelamento non esclude metatranscriptomics e isolamento virale, ma la qualità di RNA e la quantità di particelle virali recuperati possono essere influenzati attraverso il processo di congelamento-scongelamento. È importante notare che espettorato indotto è servito come fonte primaria di campioni in molti studi associati pazienti CF adulti e altre malattie polmonari croniche come 26,27 BAL può essere troppo invasivo. Nei nostri studi, campioni di espettorato sono stati raccolti con un metodo di campionamento attenta e coerente, cioè, dopo collutorio e risciacquo della cavità orale con soluzione salina sterile per mantenere la contaminazione microbi orali nei campioni di espettorato al minimo.

<table><tbody><tr><td>Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td></tr><tr><td>Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Zirconia-silicate beads were used in this study</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, molecular grade (dry powder)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.45 &amp;micro;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I enzyme&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diameter: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &amp;frac12; in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 fixed angle rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Previously bought from Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td></tr><tr><td>Total rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td></tr><tr><td>Cesium chloride&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

L&#39;accessibilità di high-throughput sequencing ha rivoluzionato molti campi della biologia. Per comprendere meglio le comunità virali e microbiche ospite-associato, un flusso di lavoro completo per l&#39;estrazione di DNA e RNA è stato sviluppato. Il flusso di lavoro genera contemporaneamente metagenomi virali e microbiche, nonché metatranscriptomes, da un singolo campione per sequenziamento di prossima generazione. L&#39;accoppiamento di questi approcci fornisce una panoramica sia delle caratteristiche tassonomiche e le funzioni della community codificato. I metodi presentati usano fibrosi cistica (CF) espettorato, un tipo di campione problematica, poiché è estremamente viscoso e contiene elevata quantità di mucine, DNA neutrofili libera, e altri contaminanti sconosciuti. I protocolli descritti qui di mira questi problemi e con successo il recupero del DNA virale e microbico alla contaminazione minima DNA umano. Per completare gli studi metagenomica, un protocollo metatranscriptomics è stato ottimizzato per recuperare sia microbicae mRNA host che contiene relativamente pochi RNA ribosomiale (rRNA) sequenze. Una panoramica delle caratteristiche dei dati viene presentato per servire come riferimento per valutare il successo dei metodi. Altri campioni di espettorato CF sono stati raccolti per (i) valutare la consistenza dei profili microbioma in sette giorni consecutivi in ​​un solo paziente, e (ii) confrontare la coerenza di approccio metagenomica per un sequenziamento basato sui geni 16S RNA ribosomiale. I risultati hanno mostrato che la fluttuazione giornaliera dei profili microbici senza perturbazione antibiotico era minimo ei profili di tassonomia dei comuni batteri CF-associate sono stati molto simili tra le librerie 16S rDNA e metagenomi generati dalla lisi ipotonica (HL) DNA -derived. Tuttavia, le differenze tra i profili tassonomiche 16S rDNA generati dal DNA totale e HL-DNA derivato suggeriscono che lisi ipotonica e le fasi di lavaggio vantaggio non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma anche extracellul microbica-derivatiDNA ar che possono travisare i profili microbici effettivi.

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Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Views.  San Diego State University.  Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata. 

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

L&#39;analisi metagenomica di insilato

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Ricerca

Genetica

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Un flusso di lavoro metaproteomica Aquatic microbica: dalle celle ai Trittico Peptidi per l&#39;analisi basata su spettrometria di massa tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

Scoperta di romanzo sequenza genomica sottrattiva

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Biologia dello sviluppo

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Neuroscienze

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Biologia

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Purificare l'Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Riepilogo

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