Ringraziamo il dottor Alexandre Mourot per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG è supportato da fellowship dal Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Ringraziamo la struttura animale di IBPS (Parigi, Francia).

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Singola cella RT-PCR multiplex dopo patch-clamp può sondare contemporaneamente e in modo affidabile l'espressione di più di 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'analisi di espressione genica a livello di singola cellula richiede gli iniettori di PCR altamente efficienti. Uno dei passi più limitanti è la raccolta del contenuto della cella. Sua efficienza dipende dal diametro del puntale della pipetta patch, deve essere più grande possibile, mentre le dimensioni della cella di corrispondenza. Pipette con un diametro di 1-2 µm punta aperta sono state dimostrate per essere adatto a tipi più neuronali. È anche essenziale per assicurarsi che solo il contenuto cellulare è raccolto e non il tessuto circostante. Questo è raggiunto controllando electrophysiologically la conservazione di una guarnizione a tenuta durante la vendemmia. La formazione di una configurazione di patch esterno-out durante il ritiro di pipetta ulteriormente protegge il citoplasma raccolto da detriti cellulari. Il tasso di successo della singola cella che Multiplex RT-PCR dipende anche dalla abbondanza di mRNA del tipo cella indagate. Per esempio, la resa ottenuta con gli astrociti, che esprimono i mRNAs in quantità relativamente basse3, è generalmente inferiore a quella ottenuta con i neuroni e così richiede sempre più campione dimensione15,16. Trascrizione d'inversione, che ha una bassa efficienza in tubi48, è la reazione limitante della singola cella multiplex RT-PCR. Pertanto è fondamentale utilizzare reagenti di qualità superiore, per memorizzarli come aliquote a-80 ° C e di usarli solo per un giorno. Infine, l'attività della polimerasi del DNA della RTase è spesso una fonte trascurata di formazione dimerica primer. Per risolvere questo problema, l'esecuzione di un avvio a caldo con gli iniettori è critico per aumentare l'efficienza di amplificazione. Inoltre questo ridurrà l'effetto inibitorio di RTase sulla Taq DNA polimerasi attività49.
La tecnica di RT-PCR multiplex singola cella è altamente versatile. È stato ampiamente utilizzato in roditori10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 , ma può essere adattato ai modelli praticamente tutti animali e geni supponendo che le sequenze del gene e del tessuto sono disponibili. Varie soluzioni di patch-clamp possono essere utilizzati, purché non interferiscono con la RT-PCR su analisi gratuita delle cellule. Per esempio interni soluzioni basate su K+ o cationi Cs+ , Cl– o gluconato sono state usate con successo6,36,41,55.
Classici risultati falsi negativi derivano dalla contaminazione RNAsi di filamento pipetta patch e/o soluzione interna patch clamp. Attentamente il filamento di clorurazione e convalida della soluzione interna in genere è possibile risolvere questo problema. Risultati falsi negativi possono verificarsi anche quando un gene è espresso ad un livello basso singola cella, poiché solo una parte del citoplasma è raccolto. La qualità del raccolto può essere aumentata utilizzando pipette più grandi e/o riducendo il tempo di registrazione della intero-cellula. Qualità di raccolta possa essere valutata includendo un gene conosciuto per essere espresso a un livello basso in cellule singole20. Risultati falsi positivi possono verificarsi con la qualità del tessuto male, in cui è alta la quantità di contaminante detriti cellulari. Test la presenza di detriti avviene inserendo una pipetta patch la fetta senza eseguire alcun sigillo e rilasciando la pressione positiva prima della rimozione di pipetta. La presenza di materiali amplificabile è sondata da multiplex RT-PCR42. Silanizzazione della pipetta patch è stato utilizzato anche per ridurre la raccolta di contaminanti extracellulare56. Singola cella PCR è una tecnica molto sensibile in grado di rilevare più di una singola copia del doppio filamento di DNA57. Nel caso di geni introne-di meno, il gDNA contenuta nel nucleo può anche produrre falsi positivi. Evitando la raccolta di gDNA inserendo la pipetta dal nucleo durante la raccolta aiuta a risolvere questo problema. La presenza di gDNA può essere attendibilmente sondata amplificando una sequenza intronic25.
La rivelazione di molecole di mRNA mediante RT-PCR diventa inaffidabile in 10 copie44, presumibilmente a causa della scarsa efficienza del RTase48e può portare a un sotto rilevazione delle trascrizioni di basso-abbondanza26,42. Questo può essere problematico nel caso dell'introne-meno geni. Infatti, evitando il raccolto del nucleo riduce la quantità di citoplasma che possa essere raccolti e quindi la sensibilità di rilevamento. La combinazione di cella singola RT-PCR dopo patch-clamp con biocitina etichettatura richiede che la forma della cellula è mantenuta il più possibile (Figura 3). Inevitabilmente, questo riduce la quantità di materiale che possa essere raccolti, riducendo così il tasso di successo. Un compromesso tra citoplasma raccolta e conservazione della morfologia cellulare è obbligatorio.
Dati di RT-PCR multiplex cella singola non sono quantitativi come offrono solo informazioni se i cDNAs sono presenti o assenti nel materiale raccolto. Tuttavia, a causa dei limiti di rilevamento descritti in precedenza, l'avvenimento di rilevamento a livello di popolazione può riflettere l'abbondanza dei geni a livello di singola cellula. Approcci alternativi consentono la generazione di ulteriori dati quantitativi, ma i vincoli tecnici imposti dalla loro strategie di amplificazione specifica (cioè, quantificazione relativa dei geni omologhi o RT-qPCR) in gran parte limitano il numero di geni che possono essere contemporaneamente analizzato41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66. La recente combinazione di registrazioni di patch-clamp e singola cella RNaseq, indicato come Patch-seq30,31, permette l'analisi trascrittomica quantitativa delle cellule electrophysiologically-caratterizzato. Si tratta di un approccio nuovo e promettente, ma richiede l'accesso a sequencer di alto-rendimento e i dati generati richiedono analisi che richiede tempo.

La corteccia cerebrale comprende numerosi tipi cellulari coinvolti in vari processi fisiologici. Loro identificazione e caratterizzazione, un prerequisito per la comprensione delle loro specifiche funzioni, può essere molto difficile data la grande diversità morfologiche, fisiologiche e molecolari che caratterizza di tipi delle cellule corticali1 ,2,3,4.
Cella singola multiplex RT-PCR si basa sulla combinazione di patch-clamp e tecniche di RT-PCR. E ' possibile sondare contemporaneamente l'espressione di predefiniti oltre 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'inclusione di un tracciante neuronale in ulteriormente la pipetta di registrazione permette la caratterizzazione morfologica delle cellule registrate dopo la rivelazione istochimica6,7,8,9, 10. è una tecnica molto utile per la classificazione dei tipi neuronali basato sull'analisi multivariata di loro tratti fenotipici5,9,10,11,12 ,13,14. Singola cella RT-PCR multiplex è adatto anche per la caratterizzazione di cellule non neuronali come astrociti15,16,17e può essere applicato praticamente a ogni cervello struttura18, 19,20,21,22,23 e cella tipo, supponendo che essi possono essere registrati nella configurazione di cellule intere.
Questa tecnica è molto conveniente per l'identificazione di fonti cellulari e/o obiettivi di trasmissione sistemi7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, soprattutto quando gli anticorpi specifici sono carenti. Esso si basa su registrazioni di patch-clamp da cellule visivamente identificati29e così permette anche l'ottimizzazione delle cellule in un ambiente cellulare specifico8,15,16. Inoltre poiché la citoarchitettura del tessuto cerebrale è conservato nelle fette del cervello, questo approccio consente inoltre studio dei rapporti anatomici delle cellule caratterizzate con elementi neuronali e non neuronali7,8 , 18.
Poiché questa tecnica è limitata dalla quantità di citoplasma raccolto e dall'efficienza della RT, il rilevamento del mRNA espresso al numero basso di copia può essere difficile. Anche se altri approcci basati sulla tecnologia di RNaseq permettono di analizzare l'intero trascrittoma di singole cellule3,4,30,31, hanno bisogno di alto-rendimento costoso sequencer non necessariamente disponibile per ogni laboratorio. Poiché la tecnica di RT-PCR multiplex singola cella utilizza PCR end-point, richiede solo thermocyclers ampiamente disponibili. Esso può essere facilmente sviluppata nei laboratori attrezzati con allestimenti elettrofisiologici e non richiede costose attrezzature. E ' in grado di fornire, entro un giorno, un'analisi qualitativa dell'espressione di un insieme predefinito di geni. Così, questo approccio offre un facile accesso per la caratterizzazione molecolare delle singole cellule in modo rapido.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Multiple alignement for primer design</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / desalted and diluted at 200 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT10 Series - 10 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>&amp;Phi;X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Smooth paper with satin appearance</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Potassium D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td><td>Wescor</td><td></td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Patch Clamp set-up cleaning</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>BX51WI Upright microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series with Straight Body (Holder)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemical revelation</td></tr></tbody></table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

La corteccia cerebrale è composto da numerosi tipi di cellule che esibiscono le varie caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari. Questa diversità ostacola la facile identificazione e caratterizzazione di questi tipi di cellule, prerequisiti per studiare le loro funzioni specifiche. Questo articolo viene descritto il protocollo multisala singola cella trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (RT-PCR), che consente, dopo la registrazione a fette, patch-clamp per rilevare simultaneamente l'espressione di decine di geni in una singola cella. Questo semplice metodo può essere implementato con caratterizzazione morfologica ed è ampiamente applicabile per determinare i tratti fenotipici di vari tipi di cellule e il loro particolare ambiente cellulare, come ad esempio in prossimità di vasi sanguigni. Il principio di questo protocollo è per registrare una cella con la tecnica del patch-clamp, per raccogliere e invertire trascrivere il suo contenuto citoplasmatico, e per rilevare qualitativamente l'espressione di un insieme predefinito di geni di multiplex PCR. Richiede un'attenta progettazione di iniettori di PCR e intracellulare patch clamp soluzione compatibile con RT-PCR. Per garantire una trascrizione selettiva e affidabile rilevamento, questa tecnica richiede anche controlli appropriati dal citoplasma raccolto ai passaggi di amplificazione. Sebbene precauzioni discussi qui devono essere strettamente seguite, praticamente qualsiasi laboratorio elettrofisiologico possibile utilizzare la cella singola multisala tecnica RT-PCR.

Una rappresentanza convalida di RT-PCR multiplex è illustrata nella Figura 3. Il protocollo è stato progettato per sondare contemporaneamente l'espressione di 12 geni diversi. Il vGluT1 del trasportatore vescicolare del glutammato è stato preso come un controllo positivo di neuroni glutamatergici42. Il GABA sintetizzare gli enzimi (GAD65 e GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) e somatostatina (SOM) sono stati usati come indicatori di GABAergic interneuroni3,5,11. L'enzima ciclo-ossigenasi-2 (COX-2) è stato utilizzato come indicatore della cellula piramidale subpopolazione3,16.
Le subunità di ATP1α1-3 del Na+/k+ dell'atpasi e le subunità Kir 6.2 e SUR1 dei canali ATP sensibili di K+ sono stati scelti per valutare la relazione tra attività neuronale e metabolica stati43. Poiché Kir 6.2 è un gene di introne-di meno, l'introne SOM è stato incluso come un controllo genomico. Il protocollo è stato testato su 1 ng di inverso trascritto RNA totale Estratto da intero cervello del mouse, che corrisponde approssimativamente alle trascrizioni di 20 cellule44. Il multiplex PCR prodotto 12 ampliconi della dimensione prevista (Figura 3 e tabella 1) che dimostrano la sensibilità e l'efficienza del protocollo. Il controllo negativo eseguito senza RNA non prodotto nessun amplicone (dati non mostrati).
Un neurone piramidale strato V visivamente è stato identificato dalla sua grande soma e un dendrite apicale prominente (Figura 5A, inserto). Registrazione di tutta la cella ha rivelato proprietà elettrofisiologiche tipico dello strato V regolari chiodare neuroni5,45,46 con, in particolare, una bassa resistenza d'ingresso, potenziali di azione di lunga durata e spike pronunciate adattamento di frequenza (Figura 5A). L'analisi molecolare di questo neurone ha rivelato l'espressione di vGluT1 (figura 5B), confermando la sua glutamatergic fenotipo42,46. Questo neurone espresse anche SOM, ATP1α1 e 3 subunità del Na+/k+ dell'atpasi. Biocitina etichettatura dei neuroni registrati confermato una morfologia piramidale (Figura 5).
Come previsto da neuroni glutamatergici, l'analisi molecolare delle cellule piramidali di 26 strato V ha rivelato espressione di VGluT1, ma nessuno dei due GADs (Figura 5). Marcatori di interneuroni sono stati osservati raramente5,42,46. COX-2, espresso principalmente da strato II-III cellule piramidali3,16, non è stata rilevata nelle cellule piramidali di livello V. Il ATP1α1 e 3 subunità erano più frequentemente osservate rispetto alla subunità di ATP1α23. Le subunità Kir 6.2 e SUR1 erano raramente rilevate nei neuroni piramidali strato V, che è coerente con la loro espressione preferenziale in strati superiori3,43. Cura è stata presa non per raccogliere i nuclei, risultante in una rara rilevazione degli introni SOM (3 su 26 cellule, cioè, 12%).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig1.jpg"> Figura 1: casella dedicata per singola cella RT-PCR. Elenco dei materiali riservati per la RT-PCR dopo patch clamp. (1) tubi capillari in vetro di borosilicato, (2) 20 µ l lunga, fine, flessibile suggerimenti, micropipetta µ l (3) 20, espulsore (4) fatti in casa, provette per PCR (5) 500 µ l, puntali con filtro anti aerosol (6) 10 µ l e marcatori (7) permanenti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57627/57627fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig2.jpg"> Figura 2: strategia di disegno di primer PCR. (A) rappresentazione schematica della sequenza di codificazione del cDNA COX 2 allineato alla sequenza del cromosoma 2 del mouse che contiene il gene COX 2. Esoni sono rappresentati da scatole nere e introni gDNA di scatole bianche. Notare le lacune nel cDNA corrispondenti alle sequenze introniche gDNA. Esempi rappresentativi di oligonucleotidi buoni e cattivi, rappresentate come frecce rosse e verdi, rispettivamente. Frecce destra e sinistra denotano primer forward e reverse. (B) sequenze e strutture secondarie di oligonucleotidi mostrati in (A). Pannello a destra e sinistro indica formazione di auto-complementarità e self-dimero tornante, rispettivamente. Il oligonucleotide B1 consente di visualizzare sia una formazione di auto-complementarità e dimero tornante forte mentre il oligonucleotide B2 Mostra solo formazione dimerica. Oligonucleotidi sia B3 e B4 sono nessun tornante auto-complementarità e nessuna formazione di dimero; sono introne overspanning (A) e sono stati selezionati come potenziali iniettori di PCR (Vedi tabella 1). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57627/57627fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig3.jpg"> Figura 3: convalida della PCR multiplex. 1 ng di RNA totale da tutto il cervello del mouse è stato sottoposto ad una trascrizione d'inversione seguita da due cicli di amplificazione di PCR. I 12 prodotti PCR sono stati risolti in corsie separate mediante elettroforesi in gel d'agarosio in parallelo con Φx174 digeriti da HaeIII. I prodotti di PCR secondo avevano dimensioni (in bp) previsto dalle sequenze: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (Kir 6.2), 211 (SUR1) e 182 (SOMint). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57627/57627fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig4.jpg"> Figura 4: raccolta di Patch-clamp in fettine di cervello. Una volta identificata visivamente una cella, la pipetta di registrazione viene avvicinata con una pressione positiva al fine di evitare la contaminazione di detriti cellulari sulla punta della pipetta. Si noti la fossetta sulla membrana di questo neurone. Pressione positiva viene interrotta al fine di formare una configurazione collegata alla cella con una guarnizione a tenuta Gigaohm. Breve aspirazioni vengono applicate per passare alla configurazione di cellule intere. Al termine della registrazione, il citoplasma è raccolto applicando una leggera pressione negativa nella pipetta mantenendo la tenuta. Nota il restringimento del corpo delle cellule durante la procedura di raccolta. La pipetta di registrazione quindi è ritirata delicatamente per formare un patch esterno-out, che favorisce la chiusura della membrana cellulare per successive biocitina rivelazione e la conservazione del materiale raccolto nella pipetta patch. Tratto da Cauli e Annalisa47 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57627/57627fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig5.jpg"> Figura 5: caratterizzazione delle cellule piramidali neocorticali strato V. (A) membrana potenziale risposta di una cellula piramidale strato V indotta da impulsi di corrente di -100, -40, -10, + 60, + 120 e + 500 pA (tracce di fondo). Il neurone Visualizza una deflessione potenziale debole dopo la risposta iniziale iperpolarizzante (superiore tracce). In risposta a una depolarizzazione soprasoglia, il neurone scaricato potenziali di azione di lunga durata con sviluppando lentamente dopo-hyperpolarization (traccia superiore). Vicino a saturazione, il neurone scariche a bassa frequenza e ha esibito un adattamento pronunciato (traccia superiore grigio). Inset: immagini a infrarossi del neurone piramidale registrato strato V. La superficie pial è verso l'alto. Barra della scala: 20 µm. (B) analisi di RT-PCR Multiplex rivelando espressione del vGluT1, SOM, ATP1α1 e ATP1α3. (C) profilo di espressione genica in un campione di 26 strato di cellule piramidali V. vGluT1 è stato espresso in tutti i neuroni mentre COX2, GAD67 e GAD65 sono stati mai rilevati. NPY, SOM, Kir 6.2, SUR1 e SOMint sono stati osservati raramente. Cellule piramidali espresso ATP1α3, 1 subunità del Na+/k+ dell'atpasi e ATP1α2 in misura minore. Massimo (D) proiezione di intensità delle immagini confocal risultati biocitina etichettatura del neurone registrate in (A). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57627/57627fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gene / GenBank numero</td>
			<td colspan="2">Primer esterno</td>
			<td>Dimensioni (bp)</td>
			<td colspan="2">Primer interno</td>
			<td>Dimensioni (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">vGlut1 NM_182993</td>
			<td colspan="2">Senso, -113</td>
			<td rowspan="4">259</td>
			<td colspan="2">Senso, -54</td>
			<td rowspan="4">153</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC</td>
			<td colspan="2">ATTCGCAGCCAACAGGGTCT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 126</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 79</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAGCCGACTCCGTTCTAAG</td>
			<td colspan="2">TGGCAAGCAGGGTATGTGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">GAD65 NM_008078</td>
			<td colspan="2">Senso, 99</td>
			<td rowspan="4">375</td>
			<td colspan="2">Senso, 219</td>
			<td rowspan="4">248</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAAAAGTTCACGGGCGG</td>
			<td colspan="2">CACCTGCGACCAAAAACCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 454</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 447</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TCCTCCAGATTTTGCGGTTG</td>
			<td colspan="2">GATTTTGCGGTTGGTCTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">GAD67 NM_008077</td>
			<td colspan="2">Senso, 529</td>
			<td rowspan="4">598</td>
			<td colspan="2">Senso, 801</td>
			<td rowspan="4">255</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TACGGGGTTCGCACAGGTC</td>
			<td colspan="2">CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 1109</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 1034</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCCAGGCAGCATCCACAT</td>
			<td colspan="2">AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">COX 2 NM_011198</td>
			<td colspan="2">Senso, 199</td>
			<td rowspan="4">268</td>
			<td colspan="2">Senso, 265</td>
			<td rowspan="4">181</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CTGAAGCCCACCCCAAACAC</td>
			<td colspan="2">AACAACATCCCCTTCCTGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 445</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 426</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCTTATTTCCCTTCACACCCAT</td>
			<td colspan="2">TGGGAGTTGGGCAGTCATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">NPY NM_023456</td>
			<td colspan="2">Senso, 16</td>
			<td rowspan="4">294</td>
			<td colspan="2">Senso, 38</td>
			<td rowspan="4">220</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGAATGGGGCTGTGTGGA</td>
			<td colspan="2">CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 286</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 236</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT</td>
			<td colspan="2">GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SOM NM_009215</td>
			<td colspan="2">Senso, 43</td>
			<td rowspan="4">208</td>
			<td colspan="2">Senso, 75</td>
			<td rowspan="4">146</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ATCGTCCTGGCTTTGGGC</td>
			<td colspan="2">GCCCTCGGACCCCAGACT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 231</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 203</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GCCTCATCTCGTCCTGCTCA</td>
			<td colspan="2">GCAAATCCTCGGGCTCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">
ATP1Α1 NM_144900
</td>
			<td colspan="2">Senso, 1287</td>
			<td rowspan="4">288</td>
			<td colspan="2">Senso, 1329</td>
			<td rowspan="4">183</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA</td>
			<td colspan="2">TAAGCGGGCAGTAGCGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 1556</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 1492</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCGTGGAGAAGGATGGAGC</td>
			<td colspan="2">AGGTGTTTGGGCTCAGATGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ATP1Α2 NM_178405</td>
			<td colspan="2">Senso, 1392</td>
			<td rowspan="4">268</td>
			<td colspan="2">Senso, 1430</td>
			<td rowspan="4">213</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG</td>
			<td colspan="2">AAATCCCCTTCAACTCCACCA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 1640</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 1623</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ACAGAAGCCCAGCACTCGTT</td>
			<td colspan="2">GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ATP1Α3 NM_144921</td>
			<td colspan="2">Senso, 127</td>
			<td rowspan="4">216</td>
			<td colspan="2">Senso, 158</td>
			<td rowspan="4">128</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGGAAATACAATACTGACTGCGTG</td>
			<td colspan="2">TGACACACAGTAAAGCCCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 324</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 264</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GTCATCCTCCGTCCCTGCC</td>
			<td colspan="2">CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Kir 6.2 NM_010602</td>
			<td colspan="2">Senso, 306</td>
			<td rowspan="4">431</td>
			<td colspan="2">Senso, 339</td>
			<td rowspan="4">342</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGGAGAGGGCACCAATGT</td>
			<td colspan="2">CATCCACTCCTTTTCATCTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 719</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 663</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CACCCACGCCATTCTCCA</td>
			<td colspan="2">TCGGGGCTGGTGGTCTTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SUR1 NM_011510</td>
			<td colspan="2">Senso, 1867</td>
			<td rowspan="4">385</td>
			<td colspan="2">Senso, 2041</td>
			<td rowspan="4">211</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CAGTGTGCCCCCCGAGAG</td>
			<td colspan="2">ATCATCGGAGGCTTCTTCACC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 2231</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 2231</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG</td>
			<td colspan="2">GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SOMint X51468</td>
			<td colspan="2">Senso, 8</td>
			<td rowspan="4">240</td>
			<td colspan="2">Senso, 16</td>
			<td rowspan="4">182</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CTGTCCCCCTTACGAATCCC</td>
			<td colspan="2">CTTACGAATCCCCCAGCCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Anti-senso, 228</td>
			<td colspan="2">Anti-senso, 178</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAGCACCAGGGATAGAGCC</td>
			<td colspan="2">TTGAAAGCCAGGGAGGAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Sequenze degli iniettori PCR di primo e secondo. La posizione di ogni primer PCR e le loro sequenze sono data da 5' a 3'. Ad eccezione dell'introne di somatostatina, posizione 1 corrisponde alla prima base del codone di inizio di ciascun gene.

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Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Views.  Sorbonne Université. Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Video: Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Ricerca

Neuroscienze

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologia

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety assessment models is a critical step during drug development. Currently, cardiac safety assessment is still highly dependent on animal studies. However, animal models are plagued by poor translational specificity to humans due to species-specific differences, particularly in terms of cardiac electrophysiological characteristics. Thus, there is an urgent need to develop a reliable, efficient, and human-based model for preclinical cardiac safety assessment. Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as an invaluable in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. hiPSC-CMs can be obtained from individuals with diverse genetic backgrounds and various diseased conditions, making them an ideal surrogate to assess drug-induced cardiotoxicity individually. Therefore, methodologies to comprehensively investigate the functional characteristics of hiPSC-CMs need to be established. In this protocol, we detail various functional assays that can be assessed on hiPSC-CMs, including the measurement of contractility, field potential, action potential, and calcium handling. Overall, the incorporation of hiPSC-CMs into preclinical cardiac safety assessment has the potential to revolutionize drug development.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as a promising in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. Here, we detail a protocol for measuring the contractility and electrophysiology of hiPSC-CMs.

Applicazioni tecniche di microelectrode array e patch clamp recordings su cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Medicina

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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