Questo lavoro è stato supportato da un NIH / NHGRI Genome Scholar / Facoltà Transition Award (K22 HG002908) di AMD e un partenariato strategico tra l&#39;Institute for Systems Biology e l&#39;Università di Lussemburgo. Le richieste di ceppi o plasmidi devono essere indirizzate al Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Strain Costruzione e Caratterizzazione <ol><li> Costruire il ceppo diploide eterozigote per essere utilizzato in croce accoppiando ceppi aploidi e diploidi selezionando 2 o utilizzando un ceppo eterozigote naturale. I ceppi non deve ospitare GFP. </li><li> Verificare che il ceppo è in grado di crescere su YPD 2 + 200 mg / ml G418. </li><li> Verificare che il ceppo è in grado di sporulare. BEST è compatibile con i bassi sporulazione croci di efficienza, ma aumenta la frequenza bassa sporulazione FACS tempo di smistamento richiesto. <ol><li> Creare una cultura O / N del ceppo in 5 ml YPD e crescere con agitazione a 30 ° C. </li><li> Lavare 0,5 ml di coltura O / N tre volte con PBS (pH 7,4). </li><li> Agglomerare le cellule lavate, rimuovere il supernatante, e risospendere in 2 ml di mezzo di sporulazione 7. </li><li> Agitare cellule a RT e controllare quotidianamente per la formazione tetrade utilizzando un microscopio ottico a contrasto di fase con un obiettivo 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Stimare la vitalità spore della croce da dissezione convenzionale 2,3 di un piccolo numero (~ 20) di tetradi. Redditività Spore in incroci tra diversi contesti di deformazione è molto variabile e imprevedibile. Tuttavia, a priori le aspettative di redditività spore possono essere utilizzati per valutare l&#39;efficienza di un BEST esperimento prima della manodopera-e costose misure di risparmio e di genotipizzazione dei ceppi. Pertanto, questo passaggio è altamente raccomandato. </li></ol> 2. Trasformazione di diploidi con Biblioteca di Barcoded plasmidi <ol><li> Inserire il plasmide codice a barre pCL2_BC nel ceppo diploide eterozigote utilizzando il protocollo trasformazione descritta in Gietz e Woods 8 con le seguenti modifiche. <ol><li> Dopo le cellule sono state incubate con la miscela trasformazione a 30 ° C per 20 minuti, aggiungere DMSO all&#39;8% del volume della miscela trasformazione. Aggiunta di DMSO è stato trovato per migliorare l&#39;efficienza di trasformazione in alcuni sfondi di deformazione 9. </li><li> Dopo lo shock passo calore, agglomerare le cellule con una breve centrifugazione, decantare la miscela di trasformazione, e lavare delicatamente le cellule in YPD. Poi, risospendere le cellule in 1 ml YPD e consentirne il recupero a temperatura ambiente per 3 ore senza agitazione. </li></ol></li><li> Selezionare trasformanti mediante placcatura sul YPD + G418 (200 mg / ml) piastre di agar. Per garantire una piscina complesso di codici a barre plasmide, raccogliere un gran numero di colonie, ad esempio 5 piastre con ~ 2.500 colonie per piastra. </li><li> Una volta che le colonie sono visibili (2-3 giorni di crescita a 30 ° C), piscina trasformanti da loro raschiando delicatamente la piastra in liquido YPD + G418 (200 mg / ml) + 15% di glicerolo. Vortex la sospensione cellulare, il trasferimento di una fiala crioconservazione, e congelare a -80 ° C. Fai un magazzino separato congelato per ogni piatto. Questi stock congelati servono come ceppi di partenza per Passo 3.1 e possono anche essere utilizzati per generare più tetradi in un momento successivo, se desiderato. </li&gt; </ol> 3. Sporulanti la Biblioteca di cellule trasformate ottenere Barcoded tetradi <ol><li> Ravvivare cellule dalle scorte congelate creati in 2.3 dalla crescita O / N in 5 ml YPD + G418 (200 mcg / ml) a 30 ° C con agitazione. </li><li> Lavare le cellule dalla O / N culture 3x in PBS (pH 7,4) e poi risospendere le cellule in sporulazione medio 7 più 200 mcg / ml G418. </li><li> Agitare culture sporulazione a RT e monitorare i progressi sporulazione tutti i giorni fino nuovi tetradi hanno smesso di formatura. </li><li> Una volta che la cultura contiene tetradi ben formate e relativamente pochi diadi, rimuovere le culture dall&#39;agitazione e lasciare a temperatura ambiente per almeno 7 giorni. Mentre alcuni ibridi possono essere suscettibili di sul piatto la digestione e la rottura appena tetradi si sono formate (valutata come descritto in 7.3), l&#39;incubazione supplementare (7-10 giorni nostri esperimenti) è essenziale per altre croci. Pertanto, questo passaggio è altamente raccomandato. </li></ol> 4. Stabilireil FACS Cancelli per Tetrad ordinamento Il meiotically espresso SPS2-GFP fusione sul plasmide pCL2_BC permette tetradi nella cultura sporulazione da rilevare e isolato dalla coltura mediante fluorescenza. Il seguente protocollo è stato sviluppato per un FACSAria II. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. FACS cancelli. Una serie di quattro porte sequenziali è utilizzato per isolare tetradi. I cancelli in (A) e (B) di ridurre il numero di ciuffi. Eventi fluorescenti vengono selezionati con il cancello in (C). L&#39;istogramma in (D) presenta due picchi. Eventi a picco sinistra sono principalmente tetradi (immagine riquadro a sinistra), e gli eventi nel picco destra sono generalmente tetradi con una gemma allegato (immagine riquadro a destra). Un cancello finale èapplicato a questo istogramma per selezionare gli eventi che sono per lo tetradi (barre rosse). Questa cifra è stata modificata da Ludlow, et al 1. <ol><li> Caricare la cultura sporulata su un sorter FACS e impostare due vincenti e scatter laterale cancelli in avanti per escludere detriti, cellule clumped, e più cellule per droplet (Figure 2A e 2B). </li><li> Ci dovrebbe essere una popolazione di cellule fluorescenti, che quando si utilizza il costrutto reporter SPS2-GFP includono diadi e tetradi 10. Porta la GFP vs FSC per includere questi eventi fluorescenti (Figura 2C). </li><li> A seconda del contesto ceppo può essere necessario includere un cancello supplementare per rimuovere i grumi che includono tetradi e altre cellule. Se questo è necessario, ispezionare un istogramma FSC degli eventi fluorescenti e specificare un cancello che comprende eventi con bassa FSC (Figura 2D, eventi gated sono in rosso). </li><li> Controllare l&#39;efficienza di t<html> egli gating regime di classificare ~ 1.500 tetradi su un vetrino da microscopio e contando la percentuale di tetradi ai non tetradi utilizzando un microscopio a contrasto di fase a 400X. La percentuale di tetradi può essere stimata con precisione contando solo ~ 200 eventi filtrate, ma classificare ~ 1500 riduce la quantità di tempo dedicato alla ricerca di cellule sul vetrino da microscopio. In alternativa, il rapporto di tetradi a non tetradi può essere valutata durante il Passo 4.5. </li><li> Controllare periodicamente che la selezionatrice viene accuratamente riporta il numero di eventi di classificare 25 tetradi su un vetrino da microscopio e dall&#39;esame delle cellule contenute nella gocciolina utilizzando un microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 400X. Ci dovrebbe essere di 25 tetradi nel droplet. Ripetere 3-4x valutare la varianza dello strumento FACS. </li></ol> 5. Ordinamento tetradi su una piastra di agar p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Posizionamento della piastra di agar sul sorter FACS. Per ordinare tetradi in una piccola goccia della soluzione zymolyase posta al centro di uno standard (circolare) piastra di agar, uno standard 100 mm (rettangolare) piastra a 96 pozzetti è prima posto sul piatto della cell sorter e sorter è programmato per depositare tetradi in una ben determinata (in questo caso D5). Poi, la piastra di agar circolare è posto sulla parte superiore della piastra a 96 pozzetti e orientato in modo che la goccia di zymolyase sia centrato sulla ben specificata. <ol><li> Riscaldare il numero desiderato di YPD + G418 (200 mcg / ml) piastre per almeno 1,5 ore in un incubatore a 37 ° C posizionato vicino al FACS sorter. </li><li> Una caratteristica fondamentale del protocollo ordinamento è la possibilità di indirizzare con precisione FACS ordinati tetradi a una posizione specifica su una piastra di agar contenente un pool di soluzione zymolyase. Per fare questo, inserire un &quot;landmark&quot; piastra a 96 pozzetti su tha automatizzato unità di deposizione delle cellule (ACDU), del sorter. Preparare un layout liste che ordinare 25 tetradi in un pozzetto di un formato a 96 pozzetti. Scegliere un pozzo vicino al centro della piastra, ad esempio ben D5. Figura 3 mostra una piastra di Petri e piastra a 96 pozzetti caricati su un cell sorter. Ordinamento 25 tetradi per piastra produce colonie ben separati. </li><li> Portare una pila di 10 piastre di agar dal termostato 37 ° C al sorter. </li><li> Prendere una piastra di agar e pipettare 25 ml di soluzione di zymolyase (1 mg / ml in 0,7 M sorbitolo) sul agar vicino al centro del piatto. Quindi, posizionare la piastra sulla piastra a 96 pozzetti punto di riferimento, allineando la goccia zymolyase sul bersaglio e dal punto 5.2, ad esempio, ben D5. </li><li> Avviare l&#39;ordinamento e depositare 25 tetradi al centro della goccia zymolyase sulla piastra di agar. Quindi, rimuovere e coprire la piastra. </li><li> Ripetere i punti 5.4 e 5.5 fino al 25 tetradi sono stati ordinati in goccioline zymolyase su ogni piatto nello stack. </li&gt; <li> Riportare la pila di piatti-tetrade contenente la 37 ° C incubatore. </li><li> Ripetere i passaggi 5.3 tramite 5.7 fino a quando tutti i piatti hanno tetradi. </li></ol> 6. Separazione Spore <ol><li> Incubare ogni pila di piastre di agar-tetrade contenente a 37 ° C per 1,5 ore. </li><li> Rimuovere le piastre dal termostato, aggiungere 15-25 perline sterile 3 millimetri di vetro per piastra, e agitare le piastre come una pila (o come due pile di 5 piastre) per 3-5 min. La migliore separazione spore è possibile spostando le piastre rigidamente da un lato all&#39;altro o davanti a dietro. Non spostare le piastre modo che il &quot;swirl&quot; perle intorno al bordo esterno della piastra. Lasciare le perline sulle piastre una volta terminato. </li><li> Posizionare la pila di piatti con perline a faccia in su in un incubatore a 30 ° C. Recuperare i piatti dello stack prossimi dal termostato a 37 ° C, e ripetere il passo 6.2. </li><li> Incubare le piastre O / N a 30 ° C. </li></ol> 7. Raccolta colonie <ol><li> Dopouna incubazione O / N a 30 ° C, piccole colonie avrebbero formato sulle piastre. Rimuovere con attenzione le piastre dal termostato senza disturbare le perline di vetro. </li><li> Rimuovere le perle di vetro con attenzione e invertendo rapidamente le piastre su un contenitore profondo. Il contenitore deve essere abbastanza in profondità per catturare le perline senza consentire loro di rimbalzare e colpire la piastra di agar. Toccando il fondo della piastra mentre è invertita può aiutare a muovere perline attaccati alla piastra. Queste sfere possono essere riutilizzati da lavaggio accurato con sapone, risciacquo con acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. </li><li> Contare il numero di colonie su ciascuna piastra e utilizzare il numero di colonie per stimare l&#39;efficienza della separazione e recupero spore. Ad esempio, 25 tetradi per piastra per un incrocio con vicino vitalità al 100% potrebbe produrre un totale di 100 colonie per piastra. </li><li> Dal piastre con un numero sufficiente di colonie (&gt; 65 per alta vitalità croci), le cellule di trasferimento di ogni colony in un pozzo separato di una piastra a 96 pozzetti contenente liquido YPD + G418. Inoltre, prendere nota di quali pozzi contengono colonie dalla stessa piastra di agar; questa informazione sarà utilizzato per aiutare il software assegnazione tetrade. </li><li> Utilizzare i 96-e piastre liquidi per seminare colture per la genotipizzazione e per il risparmio ceppi come azioni glicerolo congelati. Dettagli sul RAD-tag sequenziamento e l&#39;analisi di sequenza possono essere trovati in Ludlow et al 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti settori della ricerca genetica, che vanno dal carattere complesso di mappatura 11 per lo studio dei meccanismi sottostanti ricombinazione DNA 12, richiedono un numero estremamente elevato di progenie e alti volumi di sequenziamento del DNA. Tecniche che sposano il potere di approcci convenzionali con la capacità di high throughput sequenziamento del DNA hanno il potenziale per consentire studi che in precedenza erano intrattabile. Anche se molti high-throughput metodi di genetica del lievito sono stati applicati in modo efficace a problemi specifici, ognuno ha limitazioni che non raggiungono la vasta applicabilità dell&#39;analisi tetrade convenzionale. I migliori indirizzi a queste sfide utilizzando un approccio high-throughput unisce tetrade dissezione e genotipizzazione la progenie di incroci di lievito. In concomitanza con multiplex RAD-tag sequenziamento, BEST offre un modo economico per raccogliere informazioni genotipo per ogni ceppo progenie mantenendo rapporti tetrade per mezzo di codici a barre tetrade unici.0; Di tutti attualmente utilizzato metodi di high throughput, BEST ricapitola più strettamente le informazioni fornite da una croce lievito sezionato manualmente. BEST ha due caratteristiche principali. Il primo è l&#39;uso del FACS per isolare rapidamente tetradi distanti unsporulated cellule in coltura (protocollo passaggi 5-6). La capacità di isolare migliaia di eventi fluorescenti (tetradi) dà BEST suo più grande guadagno in velocità. Questa automazione fornisce una ancora maggiore vantaggio rispetto dissezione manuale per incroci con bassa efficienza sporulazione, a causa del maggior tempo necessario per identificare visivamente eventi rari. La seconda caratteristica fondamentale è l&#39;uso di un codice a barre molecolare molto complesso (Protocollo Fase 2) che viene trasmesso a ciascuna spora sorella di una tetrade. Poiché questi codici a barre possono essere utilizzati per computazionalmente ricostruire i rapporti tra tetrade spore che sono stati distribuiti a caso attraverso una piastra di agar, la necessità di manualmente celle di matrice in una griglia ordinata viene alleviata. Infine,perché il codice a barre molecolare e il gene reporter GFP-specific sporulazione sono fisicamente collegati (sullo stesso plasmide), solo tetradi che hanno mantenuto il codice a barre molecolare sono selezionati da FACS ordinamento. Ci sono due considerazioni che governano il periodo di tempo che le colture devono essere incubate in mezzo di sporulazione. In primo luogo, perché il giornalista specifico sporulazione (SPS2-GFP) è espresso all&#39;inizio del meiosi, da sola GFP non distingue completi tetradi 4 spore da cellule che non hanno completato la meiosi (cioè diadi). Mentre ulteriori gating FACS può diminuire il numero di fluorescenti, tetradi incomplete, il modo più semplice per ridurre questi eventi indesiderati è semplicemente monitorando la cultura sporulazione (punto 3.3) e procedere una volta nuovi tetradi hanno smesso di formatura. Nei nostri esperimenti, la frequenza delle diadi filtrate è inferiore all&#39;1%. In secondo luogo, per qualche croci ulteriore tempo trascorso in mezzo sporulazione a RT senza agitazione (punto 3.4) segnalemigliora significativamente la separazione delle tetradi dalle perle di vetro durante la placcatura ((Protocollo Fase 6). Infatti, questa fase è assolutamente necessaria per la rottura di alcune croci. Come tutti i metodi di high throughput, BEST è &quot;rumoroso&quot; di quanto l&#39;approccio convenzionale corrispondente. La modesta riduzione di efficienza del BEST rispetto ai tradizionali tetrade dissezione potrebbe risultare dalla combinazione di diversi fattori. Un fattore è l&#39;aumento della perdita di spore vitali in caso contrario, che potrebbero derivare da adesione alle perle di vetro durante la diffusione o aumentato di morte spore a causa delle sollecitazioni meccaniche del processo. Un secondo fattore potrebbe essere semplice perdita plasmide durante la meiosi. Un terzo fattore potrebbe essere un calo efficace in colonie utilizzabili derivanti da colonie con genotipi misti, si stima che circa il 5% delle colonie nel nostro pilota attraversa 1. È probabile che queste colonie rappresentano fallimenti di separazione spore sorella. Dato il rapido Fluorescence cernita e separazione spore consentire la raccolta di un numero enorme di tetradi, BEST è ben attrezzato per superare diminuzioni di efficienza su questa scala. Mentre future iterazioni di BEST potrebbe aumentare l&#39;efficienza vicina a quella del dissezione manuale, è forse più probabile che l&#39;attuale traiettoria esponenziale del DNA capacità sequenziamento sarà rapidamente compensare questo livello di perdita ceppo utilizzabile. Indipendentemente da ciò, la capacità di eseguire analisi tetrad sulla scala a cui può essere applicato BEST permetterà studi che sono attualmente irrealizzabile con metodi manuali.

Mappatura genetica meiosi, comunemente noto come analisi tetrade, è fondamentale per la genetica del lievito. In breve, due ceppi aploidi, ognuna contenente una sola copia di ciascun cromosoma, sono abbinati a formare un ceppo diploide eterozigote con due copie di ciascun cromosoma, uno da ciascun genitore. Starving cellule diploidi per l&#39;azoto induce meiosi (sporulazione), in cui i cromosomi duplicati, subiscono riarrangiamento, e si dividono in quattro cellule aploidi (spore o segreganti) con nuove combinazioni di alleli di ciascun genitore. Le quattro spore derivanti da una singola meiosi possono essere isolati da un processo manuale chiamato tetrade dissezione. Tetrade convenzionale dissezione 2,3 che è cambiato relativamente poco dopo la pubblicazione originale nel 1937 4, ha tre obiettivi. In primo luogo, le cellule che hanno subito la meiosi (tetradi) devono essere isolati da uno sfondo di cellule vegetative. In analisi convenzionale, questo viene realizzato da un ricercatore che, utilizzandoun microscopio, identifica visivamente tetradi su una piastra di agar e impiega un apparato micromanipolatore identificare visivamente tetradi su una piastra di agar e utilizzando un micromanipolatore per spostare il tetrade su una zona senza cellula della piastra. Successivamente, i quattro spore della tetrade devono essere fisicamente separati per evitare interspore accoppiamento. Le spore all&#39;interno di una tetrade sono tenuti insieme da entrambi un asco, il resto della parete cellulare della cellula diploide originale, e una serie di interspore ponti 5. Nell&#39;analisi tetrade convenzionale asco viene rimosso mediante digestione enzimatica, e un ricercatore utilizza il micromanipolatore per rompere i ponti interspore e prendere in giro a parte le spore. Infine, le singole spore sono disposte in un modello a griglia che mantiene il rapporto tra le spore, cioè tutti progenie in una fila di quattro sono spore sorelle della stessa tetrade originale. Un ricercatore lievito esperto in grado di completare il processo di dissezione 10 tetradi (un numero minimo generalmente accettatoa croce) in circa 15 min. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo tetrade di genotipizzazione high-throughput, che noi chiamiamo B arcode E nabled S equencing di T etrads (BEST) 1. BEST amplia gli attuali metodi di genetica high-throughput, consentendo la generazione e la genotipizzazione di un gran numero di discendenti che sono isolate, di genotipi, e mantenute come individui in un modo che permette i rapporti spore sorelle di tutti e quattro i prodotti meiotiche da recuperare. Ciò avviene utilizzando tre strategie principali (Figura 1). Il primo è l&#39;introduzione di un costrutto reporter di etichette che le cellule che hanno subito meiosi con GFP e permette loro di essere isolati da cellule fluorescenza-attivato (FACS). Seconda è l&#39;incorporazione di un codice a barre DNA altamente complesso (una stringa di 15 nucleotidi casuali) in una forma che si trasmette a tutti e quattro spore di un tetrade e può essere letto dal sequenziamento del DNA ricombinante della Progeny, e quindi identifica spore sorelle dalla stessa tetrade. Terzo è il passo genotipizzazione, e migliore è compatibile con numerose piattaforme di genotipizzazione che catturano sia un set di marcatori genomici così come il codice a barre specifico tetrade. Impieghiamo un sito-associata DNA tag sequenziamento restrizione (RAD-seq) 6 metodo che dirige il sequenziamento del genoma di specifici siti di restrizione 1, catturando in tal modo un consistente 2-3% del genoma dei ceppi progenie così come il codice a barre plasmide-borne . Il recupero dei rapporti tetrade insieme ai dati di genotipizzazione empiricamente derivata dalla croce permette l&#39;inferenza accurata delle informazioni mancanti, compreso lo stato di marcatori con bassa copertura sequenza e il genotipo completo di individui non vitali (e quindi non recuperabili). Qui, si descrive l&#39;applicazione del metodo nel microrganismo più comunemente usato per la mappatura meiotica, il lievito S. cerevisiae. Tuttavia, con sostituzioni minori di rea-specifico organismosignori, ad esempio, diverse proteine ​​specifiche per sporulazione fusi a GFP, il metodo dovrebbe essere facilmente trasferibile ad altri microrganismi, compresi gli organismi in cui la mappatura meiotic è significativamente più alta intensità di manodopera o attualmente intrattabile. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. Metodo migliore. (A) Il plasmide pCL2_BC è un plasmide 2 micron con una fusione GFP-specific sporulazione, resistenza a G418, e un codice a barre casuale 15-mer. Costruzione del plasmide biblioteca è descritto in Ludlow et al 1. (B) Un pool di plasmidi barcode viene trasformato nel ceppo diploide da una croce. (C) trasformanti vengono poi coltivate su selezione e ~ 10.000 colonie trasformate sono raggruppati e sporulate. Durante la meiosi ogni spore di una tetrade eredita un copy del plasmide codice a barre. (D) tetradi sono separati dalle cellule unsporulated mediante FACS e raccolti su piastre di agar, dove vengono digeriti e interrotti per consentire a ciascun spore per formare una colonia. (E) Le colonie vengono poi raccolti in piastre a 96 pozzetti, caratterizzati fenotipicamente e genotipizzazione. Durante la genotipizzazione del codice a barre plasmide viene letto e utilizzato per identificare i quattro membri di ogni tetrade. Questa cifra è stata modificata da Ludlow et al 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Analisi Tetrad è uno strumento prezioso per la genetica del lievito, ma la natura manuale laborioso del processo ha ostacolato la sua applicazione su larga scala. Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) 1 sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi in virtù di una proteina di fusione GFP-specific sporulazione che consente fluorescenza-attivato cell sorting di tetradi direttamente su piastre di agar, dove l&#39;asco è digerito enzimaticamente e le spore sono interrotti e in modo casuale schierati dalla placcatura di perle di vetro. Le colonie aploidi vengono poi assegnati i rapporti spore sorelle, vale a dire informazioni sulle spore originati dalla stessa tetrade, utilizzando i codici a barre molecolare letti durante la genotipizzazione. Eliminando il collo di bottiglia della dissezione manuale, centinaia o addirittura migliaia di tetradi possono essere isolati in pochi minuti. Qui vi presentiamo una descrizione dettagliata delle procedure sperimentali necessari per eseguire meglio nel lievitoSaccharomyces cerevisiae, a partire da un ceppo diploide eterozigote attraverso l&#39;isolamento di colonie derivate dalla progenie meiotica aploide.

BEST può migliorare notevolmente la velocità con cui le spore di tetradi possono essere isolati. Come esempio di throughput questo metodo può fornire, un ricercatore ha eseguito i FACS cernita e separazione spore (Procedura 5.1 al 6.3) con 149 piastre di agar in 3 ore 1. Una resa equivalente (circa 3.725 tetradi) richiederebbe più di 90 ore di dissezione manuale. Tuttavia, come con molti metodi ad alto rendimento, l&#39;iterazione corrente del metodo ha una certa perdita di efficienza rispetto a dissezione manuale. Questa perdita manifesta come un ridotto numero di colonie recuperato rispetto alla previsione calcolata sulla base della vitalità spore della croce, determinata dalla dissezione manuale (passo 1.4). Supponendo che le cause della perdita di spore (Discussione) influiscono spore a caso, le stime possono essere fatte di quante colonie recuperati saranno membri di tetradi in cui sono stati recuperati 1, 2, 3, o 4 spore (Figura 4). Figura 4. Simulazione dell&#39;efficienza metodo a livello tetrade. Mancata recuperare con successo spore (come colonie) può essere dovuta a spore inviability, spore adesione alle perline di vetro, mancata separazione spore uni dagli altri, ecc La distribuzione binomiale è stato usato per calcolare la frazione attesa di tetradi (con almeno una spora recuperato con successo) producendo 4, 3, 2 o 1 colonie basati sulla proporzione di tutte spore recuperati con successo. Questo grafico può servire come indicazione di massima per il numero di ceppi che infine essere assemblati in 3 - o 4 - tetradi spore. Poiché il numero di colonie per piastra aumenta, anche il numero di tetradi completi recuperati. Nell&#39;esperimento descritto sopra, 25 tetradi da un incrocio con spore redditività vicina al 100% (come detfoderata da dissezione manuale) 1 sono stati piastrati su 149 piastre di agar. In questo esperimento, il numero massimo di colonie osservate per piastra era 80, indicando che 20 spore riuscito a formare colonie discrete. Il numero medio di colonie per piastra era 62. Colonie da 61 piastre contenenti 65 o più colonie sono stati raccolti e sequenziati. Dei 3.700 ceppi che hanno superato il controllo di qualità di sequenziamento, il 72% potrebbe essere computazionalmente assegnato in 3 - o 4 - tetradi spore.

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BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi da cellule fluorescenza-attivato smistamento su piastre di agar, separa le spore mediante agitazione con perle di vetro, e determina che le colonie disposte in modo casuale sono stati ricavati dallo stesso tetrade originale utilizzando codici a barre molecolare.

BEST: Barcode Enabled Sequencing di tetradi

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Views.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi da cellule fluorescenza-attivato smistamento su piastre di agar, separa le spore mediante agitazione con perle di vetro, e determina che le colonie disposte in modo casuale sono stati ricavati dallo stesso tetrade originale utilizzando codici a barre molecolare. 

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Ricerca

Biologia

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Tick Microbiome caratterizzazione ordinando Amplicon del rRNA 16S di prossima generazione

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

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