Questa ricerca è stata sostenuta da un finanziamento dal NIH NCRR (R01 RR014166 a BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), il Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti (J Trumble PI; BH Smith co-PI) e Arizona State University. I finanziamenti per il workshop di formare gli studenti (dati in figura 4) è stata fornita dalla fondazione scienza del Cile.

<ol>
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The authors have no conflicts of interest to disclose.

Questo protocollo presentato due metodi affidabili per condizionare utilizzando la procedura PER. Questi sono due dei numerosi metodi che sono stati impiegati con successo 27, 21. Metodo 2 Ci avvaliamo per tutti gli studi sperimentali che utilizzano PER come è sempre affidabile, anche attraverso diversi sperimentatori. La stessa procedura di base è stato adattato a diversi tipi di studi con api da miele, compreso l&#39;uso di diversi stimoli condizionamento e diversi riflessi comportamentali. E &#39;stato anche legato alle indagini della base genetica delle differenze nell&#39;apprendimento 28,29, i correlati fisiologici della percezione olfattiva e della memoria nel cervello 13,14,30, e le modulatori e molecolari basi genetiche del comportamento 15,16,31 . A causa della conoscenza avanzata della rilevanza ecologica di apprendimento olfattivo alle api, che è iniziato con i primi studi di Karl von Frisch più di 100 anni fa <sup&gt; 31, i risultati di AL può essere facilmente collegato ad esigenze di sopravvivenza di una colonia. Più di recente, è stato adattato ad uno studio agricolo per studiare gli effetti subletali comportamentali di pesticidi e tossine ambientali 17. La procedura di base è potente nel senso che può essere applicato ad analizzare i problemi in altre specie. Due specie di falena, Manduca Sexta e Spodoptera littoralis, sono stati utilizzati in studi PER indagare le basi neurali di identificazione odore e capacità di apprendimento olfattivo &#39;ogni specie 32,33. PER esperimenti con i moscerini della frutta hanno fornito molte intuizioni sulle cascate di segnalazione molecolari coinvolti nella chemosensation e di apprendimento 34. E PER è stato recentemente utilizzato per studiare assuefazione alla pulce (Rhodnius prolixus) 35, un importante vettore di malattia. In generale, la procedura è robusto a variazioni nel metodo; l&#39;uso di dmetodi ifferent probabilmente produrrà la stessa differenza relativa tra i gruppi di trattamento. Nonostante la procedura relativamente semplice, diversi problemi possono a volte impedire alle api mellifere di imparare l&#39;associazione odore-saccarosio. I seguenti argomenti sono possibili modifiche al protocollo e alcuni dei problemi più comuni che possono insorgere durante PER condizionata. Considerazioni sul numero e tipo di prove nel protocollo condizionata Qualsiasi protocollo apprendimento richiederà l&#39;esposizione delle api a una serie di prove in fase di acquisizione. Questo numero dipende in gran parte la difficoltà del compito. Api del miele possono imparare un compito semplice dopo un singolo processo, ma hanno bisogno di almeno tre prove per indurre la formazione della memoria a lungo termine. Come previsto, le api mellifere richiederanno significativamente maggiore di prove per imparare adeguatamente un compito difficile. Generalmente, vi è un numero massimo di prove dalla quale le api non migliorano significativamente l&#39;prestazioni ir. Questa massima dipende dal compito specifico, i tipi di odori e concentrazioni, e la concentrazione di saccarosio. Quando si utilizza più di un tipo di prova con diversi odori, presentare i diversi tipi di prova in una sequenza pseudocasuale di mantenere le api da memorizzare una semplice sequenza di presentazioni odore invece di imparare le differenze tra gli odori 36. In queste sequenze pseudocasuali, ci deve essere un numero uguale di prove per ciascun tipo di odore. Inoltre, la probabilità di un processo di tipo odore preceduta da e seguito dallo stesso odore, o qualsiasi altri odori, deve essere uguale per tutti gli odori. Per due odori - A e B - utilizzare la seguente sequenza: ABBABAAB. Negli otto studi ogni odore è presentato quattro volte. Concatenare sequenze identiche per raggiungere il numero desiderato di prove per ciascun odore. Indipendentemente dal disegno sperimentale, ci sono alcuni parametri che devono rimanerecostante al fine di ottimizzare l&#39;apprendimento. La sovrapposizione tra il CS e gli Stati Uniti è fondamentale per il condizionamento efficace. L&#39;intervallo inter-trial (Figura 1, Tabella 1) deve essere costante e di essere ottimizzato per irregolarità o un intervallo inter-trial troppo corti o troppo lunghi possono influenzare in modo significativo l&#39;efficacia del protocollo di condizionamento 1. Considerazioni sull&#39;importanza e Progettazione di Trials test comportamentali Risposte registrati durante la &#39;fase di acquisizione&#39; di un esperimento, quando il CS e gli Stati Uniti sono presentati insieme, possono essere utili. Tuttavia, fate attenzione che le condizioni di presentazione odore possono variare da un tipo di prova per un altro. Durante le prove rinforzati, l&#39;odore seguita da saccarosio è presentato in combinazione con uno stimolo visivo (movimento del dispositivo per l&#39;erogazione della gocciolina saccarosio) che possono influenzare la risposta del ape. E le api hanno solo tre secondis per mostrare una risposta (quattro secondi di stimolazione odore meno quello sec sovrapposizione con la presentazione di saccarosio; Figura 1). Se l&#39;esperimento coinvolge le api imparano a differenziare i due odori (ad esempio, armato e non armato), l&#39;odore non rinforzato presentato sulla sperimentazione alternativi avviene senza lo stimolo visivo della presentazione ricompensa e le api hanno i ben quattro secondi per rispondere. Pertanto, le risposte alle due odori non sono pienamente comparabili durante l&#39;acquisizione. Con qualsiasi protocollo condizionata, non fare affidamento esclusivamente sulle curve di acquisizione 1. Per verificare meglio ciò che le api hanno imparato, introdurre una serie di prove di laboratorio, non armato, durante il quale né l&#39;odore è rinforzata, che assicura che i test di tutti gli stimoli si svolge in condizioni identiche. A seconda dello scopo specifico della sperimentazione, collaudo può essere costituita da prove di laboratorio singole odore condizionato o una serie di prove con il od condizionatao o una combinazione delle odori condizionati e nuovi. Uno studio singolo test dell&#39;odore condizionato fornisce un semplice test se ricordano le api l&#39;odore condizionata. Tuttavia, la risposta al primo test di prova può riflettere livello di motivazione delle api e il loro richiamo dell&#39;odore condizionato. Una serie di prove di laboratorio, sia una serie di prove di estinzione degli odori condizionata o una serie di singoli test del condizionato e uno o più nuovi odori, può anche essere utilizzato per valutare la memoria. La serie di prove di estinzione in grado di valutare quanto fortemente ricordano le api l&#39;associazione condizionato. Più forte è il richiamo del maggior numero di prove necessarie per estinguere la risposta condizionata. Una serie di singole prove di odori condizionati e nuovi può anche valutare la specificità memoria delle api dell&#39;odore condizionato. E &#39;inoltre indispensabile per condizionare e testare sia il controllo e gruppi trattati presso gli stessi punti temporali. Comparzione le prestazioni di api subito dopo condizionamento per le api detenuti per periodi di tempo più lunghi è problematico a causa della esposizione al saccarosio Uniti alimentando le api a sazietà. Ad esempio, un calo di prestazioni dopo lunghi intervalli di tempo potrebbe essere causa di memoria degrado o potrebbe essere dovuto a cambiamenti di stato motivazionale e / o apprendimento indotti dall&#39;esposizione rinforzato negli Stati Uniti, rendendo i risultati ambigui. Pertanto, le prestazioni di un gruppo di trattamento deve sempre essere giudicato rispetto a un gruppo di controllo condizionato e testato negli stessi punti temporali. Odore Concentrazione e Integrità Ci sono diversi modi in cui la concentrazione e l&#39;integrità del odore (CS) può essere compromessa. Il problema più diffuso con la consegna odore è l&#39;esaurimento delle cartucce di odori da un uso eccessivo (Figura 2). Sostituire le cartucce 10-12 usi (ogni 2 o 3 prove con gruppi di 5 api da miele) per evitare questa trappola. E &#39;inoltre fondamentale utilizzarecartucce freschi per prove di laboratorio, dal momento che le cartucce usate possono essere differenzialmente esauriti e quindi presenti stimoli odore ineguali. Un altro problema comune è la contaminazione cartuccia odore dovuto utilizzare la cartuccia per più di un odore completamente senza pulirlo. Un flusso d&#39;aria sporca o contaminata può anche involontariamente introdurre stimolo olfattivo aggiuntivo (filtri a carboni attivi possono prevenire contaminazione di fondo). Ciò è particolarmente problematico quando l&#39;accoppiamento PER condizionata con misure delle risposte fisiologiche l&#39;odore. Cartucce odore Leaky presentano un problema dal momento che le api da miele sono esposti agli odori prima del processo inizia, che riduce la salienza dello stimolo odore. Raccordo allentato la fornitura d&#39;aria per la consegna odore può causare poca o nessuna consegna odore quando si apre la valvola, riducendo artificialmente la risposta delle api per l&#39;odore previsto. Soluzione di saccarosio e stimolo incondizionato (Reward) L&#39;amonte, la concentrazione, e l&#39;integrità della soluzione di saccarosio utilizzato come gli Stati Uniti sono vitali per il successo dell&#39;esperimento. Il condizionamento è una funzione della quantità e concentrazione di soluzione di saccarosio-acqua usata come gli Stati Uniti 37. Le siringhe micrometriche utilizzati nel metodo 2 permettono un controllo molto preciso (fino a 0,2 ml) di consegna Stati Uniti, e si consiglia loro di utilizzare per entrambi i metodi descritti. L&#39;uso dei stuzzicadenti (metodo 1) è adeguato per le circostanze in cui non possono essere utilizzate le siringhe costosi, come ad esempio, nella formazione di grandi gruppi di studenti, lavoro nel campo, o con budget inferiori. Realizzazione accurata del metodo 1 è bene finché i tempi è mantenuta con regolare sostituzione di stuzzicadenti per evitare l&#39;accumulo di saccarosio (e la concentrazione consegnato). Tuttavia, utilizzando stuzzicadenti è più difficile da controllare con precisione e valutare la quantità e la grandezza degli USA erogata, che è importante per gli studi di condizionamento 1. La concentrazione di saccarosio necessaria perfornire una ricompensa sufficiente a mantenere le api motivati ​​a imparare l&#39;associazione condizionata può dipendere dalla difficoltà del compito e stato interno delle api o periodo dell&#39;anno. I compiti più difficili richiedono una soluzione di saccarosio più elevato per le api &#39;per imparare con successo il compito. Stampo può accumulo in soluzioni di saccarosio anche a 5 ° C, che compromettere l&#39;integrità della soluzione, che colpisce la salute e la percezione del premio delle api durante l&#39;esperimento. Si consiglia di sostituire la soluzione ogni pochi giorni. Precisione, Timing e coerenza di CS e US Consegna La questione più critica sulla corretta attuazione di una procedura di PER, o per quella materia qualsiasi procedura condizionata, comporta la precisione, i tempi e la consistenza di CS e la consegna degli Stati Uniti (Figura 1). Gli investigatori che sono nuovi alla procedura spesso sono imprecise circa la consegna di uno o entrambi gli stimoli. ISI diche non riescono a consentire la sovrapposizione CS e US compromettere le prestazioni condizionata. Il PLC automatizza un segnale acustico per lo sperimentatore di consegnare saccarosio 3 secondi dopo l&#39;inizio della consegna odore. Gli investigatori devono tenere il saccarosio / acqua goccia vicino al ape per una rapida consegna dopo il segnale. Queste procedure aiutano a trascinare un ISI coerente. Posizionamento di un cronometro da l&#39;arena di condizionamento permette per un comodo posizionamento momento del processo, nonché il monitoraggio il tempo delle api in campo sia prima che dopo la consegna degli stimoli. In questo modo l&#39;ITI di può essere relativamente coerente e l&#39;intera procedura può essere eseguito ad un ritmo controllato. ITI di che sono troppo brevi, per esempio meno di 1 min, o troppo lungo può portare a scarso rendimento condizionata 1. Stagionali, ambientali e contestuali Effetti sulla Honey Bee Prestazioni Prestazioni di miele d&#39;api può essere significativamente influenzato da suoi dintornisia prima che durante il condizionamento. Spesso, le fluttuazioni di temperatura e disponibilità di cibo che vengono con il mutare delle stagioni altereranno la motivazione delle api per imparare. Quando i fiori sono in fiore, la motivazione delle api per imparare l&#39;associazione condizionato in laboratorio diminuisce 38. Quando la colonia viene sottolineato - da temperature estreme, carenze alimentari, o di stress-correlate alla patologia - le api mostreranno una riduzione delle loro prestazioni di apprendimento all&#39;interno. Api del miele conservati in una stanza volo può imparare bene per un po &#39;, ma c&#39;è anche lo stress della malattia e invecchiamento degradano le loro prestazioni di apprendimento nel tempo. Il contesto durante il condizionamento può anche ridurre le prestazioni delle api. Eventuali odori estranei, di movimento, e altri stimoli possono distrarre l&#39;ape dagli stimoli sperimentali. Per evitare questo problema, mantenere un contesto visivo semplificato ragionevolmente coerenti. Genotipo e esperienza Influisce PER Prestazioni &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; lavoratori api possono differire notevolmente in termini di prestazioni su qualsiasi procedura di condizionamento dovuto alla specializzazione compito, genotipo, o altri fattori ambientali 20. Pertanto, è importante standardizzare, per quanto possibile, i tipi di animali utilizzati in un esperimento per ridurre variazione inter-individuale. In una colonia guidata da una regina open-accoppiati, il che significa che si accoppiò con molti diversi droni, gli operai saranno diversi nel genotipo paterno. Sfondo genetica può portare a differenze drammatiche reattività sensoriale 39 e l&#39;apprendimento delle prestazioni 29. Utilizzando colonie guidati da regine inseminate strumentalmente dallo sperma da singoli droni 28 riduce questo inter-individuale variazione. I protocolli descritti sopra, comprende un metodo per la raccolta di lavoratori api dall&#39;ingresso nido. Tuttavia, queste api mellifere differiscono l&#39;uno dall&#39;altro per quanto riguarda l&#39;età o l&#39;attività comportamentale. Possono essere giovani (inexperienced) o più anziani (più) raccoglitori esperti. Essi possono essere giovani api mellifere rendendo i loro primi voli di orientamento. Oppure possono essere le api di guardia. Per ridurre la variabilità, contrassegnare le api con smalto ad asciugatura rapida o tag di marcatura sia come emergono come adulti (da controllare per l&#39;età) e / o quando cominciano foraggiamento (per controllare per esperienza). Poi, pochi giorni dopo, raccogliere le api marcate per il condizionamento. I lavoratori che sono impegnati in comportamenti di cura possono essere raccolti dai fotogrammi all&#39;interno dell&#39;alveare. Gli infermieri possono essere identificati positivamente quando inseriscono le loro teste in una cella di covata per nutrire e curare la larva dentro. Utilizzando Vergine Queens o Droni per PER condizionata Oltre alle operaie api da miele, vergine regine api e droni possono essere facilmente condizionati in una procedura di PER per gli studi volti a sviluppare linee genetiche di api che si differenziano per l&#39;apprendimento delle prestazioni 28. Regine Vergini devono essere raccolti subito dopo they emergono da impupamento e messo direttamente in imbracature di ritenuta, senza anestesia. Giovani, droni immaturi raccolto dal favo di covata all&#39;interno della colonia non sono generalmente motivati ​​a imparare. Dopo che hanno iniziato l&#39;accoppiamento voli, droni facilmente imparano PER compiti 28. Essi devono essere raccolti che tornano da un volo di accoppiamento e mantenuto durante la notte in una piccola gabbia in una colonia utilizzato per l&#39;allevamento regine. Non tentare di imbrigliare il giorno prima di condizionamento; essi non sopravvivono bene in cablaggi durante la notte. Un paio di ore prima del condizionamento i droni possono essere raccolti dalle gabbie e inserito nel imbracature di ritenuta, senza anestesia. Conclusioni Questa procedura PER, nel modo di metodi, pari a un punto di partenza per la progettazione di esperimenti PER. La maggior parte dei protocolli PER richiederanno che la procedura descritta da modificare in qualche modo per attuare gli obiettivi specifici della sperimentazione e AlloggiE i gruppi di trattamento multipli. E &#39;facile da implementare. Tuttavia, la corretta esecuzione richiede attenzione ai dettagli e la pratica. Una volta masterizzato può essere un potente procedura per aggiungere come strumento di ricerca per diversi programmi di ricerca di base e applicata con diverse specie di insetti.

Molti insetti conoscere stimoli ecologicamente rilevanti, e quindi cambiano le loro risposte comportamentali a tali stimoli al fine di adattarsi a nuove relazioni predittive nel loro ambiente. Diversi meccanismi diversi possono essere alla base questa plasticità comportamentale (ad esempio, non associativa, associativa / pavloviano, e operante / strumentale 1). Questi tipi di plasticità differiscono nel modo stimoli o comportamenti sono associati a eventi importanti, quali il verificarsi di cibo, un compagno, o pericolo. La comprensione di queste forme di plasticità è molto importante per la ricerca di base nel modo in cui il sistema nervoso cambia per codificare nuove memorie 2. E &#39;anche importante per comprendere i comportamenti adattivi di insetti che sono vettori di malattie importanti (ad esempio, tse-tse e la zanzara) e di insetti che sono importanti agricolo, sia nella produzione agricola (api da miele) o come parassiti. Studiare la plasticità comportamentale in qualsiasi animAl richiede un livello di controllo sperimentale su un numero di variabili che non è realizzabile nel campo 1. Si richiede lo sviluppo di un protocollo di condizionamento robusto che può essere impiegato in condizioni più controllate, ma che sono ancora rilevanti per il comportamento in condizioni naturali. Il miele delle api (Apis mellifera) è un ottimo modello per come sviluppare un protocollo per l&#39;esecuzione di analisi controllate di plasticità comportamentale 3,4. La risposta estensione proboscide (PER) in api mellifere è un riflesso naturale comportamentale in cui l&#39;ape estende la sua proboscide in risposta alla stimolazione antenne con una soluzione di zucchero. Durante il normale comportamento di foraggiamento, PER verifica quando il miele delle api trova il nettare in un fiore. Fortunatamente, le api mellifere saranno prontamente presentare questo comportamento semplice e facilmente quantificabile in laboratorio. Questo rende possibile studiare, in un ambiente controllato, i meccanismi che influenzano questo comportamento ecologicamente rilevante 5. PER can essere utilizzato anche all&#39;interno di un protocollo di condizionamento per indagare la percezione dello stimolo e l&#39;apprendimento e la memoria in diverse condizioni di trattamento, che sono progettati per rivelare i meccanismi comportamentali e neurali che sono alla base della plasticità 6. Fin dai primi studi di Kuwabara 7, PER condizionata è stato ampiamente utilizzato per rivelare non associativa, associativo e meccanismi operanti che sono alla base della plasticità comportamentale api mellifere 8. Questi meccanismi sono identici a quelli rivelato negli studi di liberamente battenti api mellifere 9. A differenza degli studi di liberamente volanti api da miele, PER protocolli di condizionamento possono essere accoppiati con elettrofisiologia 10,11 o live-cell imaging di fluorescenza 12-14 del cervello. Inoltre, i protocolli PER permettono di manipolazione sperimentale dei processi neurali attraverso trattamenti farmacologici o genetici molecolari per verificare ipotesi circa i ruoli dei componenti specifici della rete, come ad esempio neuromodulators 15,16. PER protocolli hanno anche fornito un modo importante per valutare gli effetti subletali di condizioni ambientali e tossine sulla salute e bottinatrici efficienza delle api mellifere 17. Questa procedura descrive due metodi di consegna odore in parallelo. Metodo 1 è una versione di odore e di stimolo incondizionato (saccarosio) consegna che fornisce un metodo poco costoso e tecnicamente semplice per presentare l&#39;odore e la ricompensa di saccarosio. Questo metodo è buono per la formazione di base e quando l&#39;automazione non è possibile. Si tratta di un ottimo modo per introdurre questa tecnica per un laboratorio di classe o di insegnamento. Durante condizionata per gli esperimenti che coinvolgono compiti più difficili e valutazioni fisiologiche accoppiati della percezione degli odori, l&#39;apprendimento, o la memoria, è molto importante per regolare in modo accurato e preciso l&#39;insorgenza, tempistiche di consegna, la durata degli stimoli. Per la consegna stimolo più affidabile, usare un mezzo di automatizzare la consegna di un odorend un preciso metodo di consegna ricompensa. Metodo 2 impiega automatizzato consegna odore e precisa consegna saccarosio. E &#39;tecnicamente più sofisticato e richiede più per la configurazione iniziale di metodo 1, ma aumenta in modo significativo la coerenza dei tempi e la quantità di stimoli utilizzati per il condizionamento e dovrebbe essere usato quando possibile.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odorant Compounds (for example)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;1-hexanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471402-100ML</td><td>For additional examples</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;2-octanone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W280208-800G-K</td><td>of odorants, see any of</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;heptanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51778-5ML</td><td>the papers on olfactory</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;gerianol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163333-25G</td><td>processing from the</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;nonanal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131210-100ML</td><td>Smith lab.</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>Heavy mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>Make sure it&amp;rsquo;s odorless.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vials</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190535-1PAK</td><td>Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.</td></tr><tr><td>Bee harness</td><td></td><td></td><td>Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.</td></tr><tr><td>Duct tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Wash bottles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560847-3EA</td><td>For the 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Dryer tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;FOR METHOD 1 ONLY&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>20 ml disposable plastic syringes</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-07945-18</td><td></td></tr><tr><td>15 mm filter paper circles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274844-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Pushpins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;FOR METHOD 2 ONLY&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07840-00</td><td></td></tr><tr><td>Gilmont micrometer syringe tip</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07841-00</td><td></td></tr><tr><td>26 G 3/8&amp;rdquo; Leur hub hypodermic needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-10</td><td></td></tr><tr><td>1 cc tuberculin syringes (plastic/glass)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z181641-1EA OR Z192090-200EA</td><td>Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.</td></tr><tr><td>Small rubber/silicone restrictors</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-02</td><td>Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>75 x 100 mm filter paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695106-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Direct Logic 05 Programmable Logic Controller</td><td><a href="http://www.koyoele.co.jp/english/product/plc/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Koyo Electronics Industries Co, Ltd</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm, 4 mm, &amp;amp; 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>Various</td><td>Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.</td></tr><tr><td>Polypropylene connectors &amp;amp; leur fittings</td><td>Cole-Parmer</td><td>Various</td><td>Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.</td></tr><tr><td>65 mm Correlated Flowmeter</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03216-08</td><td>Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.</td></tr><tr><td colspan="4">OR</td></tr><tr><td>Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump</td><td><a href="http://www.aquacave.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Aquacave</a></td><td>AE-TETRA-300</td><td></td></tr><tr><td>LIF series Solenoid Valves for .042 &quot; ID Tubing, Configuration &quot;E&quot;</td><td><a href="http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> The Lee Company</a></td><td>LFAA1200118H</td><td>Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW</td></tr><tr><td>PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> RadioShack</a></td><td>273-074</td><td></td></tr></tbody></table>

a proboscis extension response protocol for investigating behavioral plasticity in insects: application to basic, biomedical, and agricultural research

Insetti modificano le loro risposte agli stimoli attraverso l&#39;esperienza di associare quegli stimoli con eventi importanti per la sopravvivenza (per esempio, cibo, compagni, minacce). Ci sono diversi meccanismi comportamentali attraverso i quali un insetto apprende associazioni salienti e li riferisce a questi eventi. E &#39;importante capire questo plasticità comportamentale per i programmi volti ad assistere i insetti che sono benefiche per l&#39;agricoltura. Questa comprensione può essere utilizzato anche per scoprire le soluzioni ai problemi biomedici e agricoli creati da insetti che fungono da vettori di malattie e parassiti. Il protocollo condizionata Proboscis Extension Response (PER) è stato sviluppato per api da miele (Apis mellifera) oltre 50 anni fa per studiare come percepiscono e conoscere gli odori floreali, che segnalano le risorse di nettare e polline una colonia ha bisogno per la sopravvivenza. La procedura PER fornisce un quadro solido e di facile impiego per lo studio di molti diversi mecha ecologicamente rilevantinismi di plasticità comportamentale. È facilmente adattabile all&#39;uso di parecchie altre specie di insetti ed altri riflessi comportamentali. Questi protocolli possono essere facilmente impiegati in combinazione con vari mezzi per il monitoraggio dell&#39;attività neuronale nel sistema nervoso centrale tramite elettrofisiologia o Bioimmagini, o per manipolare percorsi di neuromodulatori mirati. Si tratta di un test affidabile per rilevare rapidamente gli effetti sub-letali sul comportamento causati da stress ambientali, tossine o pesticidi. Mostriamo come il protocollo di PER è semplice da implementare utilizzando due procedure. Uno è adatto come un esercizio di laboratorio per gli studenti o per rapide analisi degli effetti di un trattamento sperimentale. L&#39;altro fornisce un maggiore controllo accurato di variabili, che è importante per gli studi di condizionamento comportamentale. Mostriamo come diverse misure per la risposta comportamentale che vanno dal binario sì / no a più variabile continua come la latenza e la durata della proroga proboscide può essere usato per testare Hypotheses. E, discutiamo alcuni problemi che i ricercatori incontrano comunemente quando utilizzano la procedura per la prima volta.

Presentiamo due esempi di utilizzo dei protocolli PER sopra descritti. Il primo esempio fatto uso del metodo 2 di studiare come le api il miele percepiscono odori diversi in funzione della somiglianza molecolare per l&#39;odore utilizzato come CS 5,24,25. Il secondo è un esempio di utilizzo del metodo 1 e alcune delle precauzioni che devono essere prese quando si inizia ad usare PER condizionata esperimenti nel laboratorio di ricerca. Studi come questo sono stati utilizzati per descrivere la olfattiva &#39;spazio percettivo&#39; di api e falene in combinazione con Bioimmagini 13 o elettrofisiologico analisi 26. Le api da miele (n = 20) sono stati condizionati ad associare l&#39;odorizzante decanale con rinforzo saccarosio oltre 12 avanti l&#39;associazione di condizionamento prove (Figura 3a). Circa il 10% delle api mellifere risposto &#39;spontaneamente&#39; il primo processo, che è normale. Dopo che la percentuale che responded aumentare nel corso dei prossimi studi fino al 100% delle api mellifere risposto alla quinta prova e ogni prova successiva. Diversi studi hanno dimostrato che questo aumento di risposta è specifico alla condizione in avanti accoppiamento (figura 1) rispetto a diversi importanti procedure di controllo 3. Dopo la fase di acquisizione, ogni ape è stato sottoposto ad una serie di prove di laboratorio, non rinforzate (Figura 3B) che comporta l&#39;esposizione al odore CS e diversi altri odoranti che sistematicamente diversi dalla CS in strutture molecolari. Le api da miele hanno risposto maggiormente al CS. Le loro risposte agli altri odoranti diminuite in funzione dei cambiamenti sistematici nella struttura, con le risposte più bassi ai odoranti meno come il CS. Nella Figura 4, i risultati di un recente workshop in cui gli studenti hanno imparato, per la prima volta, come per condizionare le api mellifere utilizzando il metodo 1 sono illustrati. Studenti abeti<html> t condizionato api da miele di avanti accoppiamento methycyclohexanone (MCH) o ottanolo (OCT) con rinforzo saccarosio (Figura 4A). Risposte per cento sono stati inferiori al primo processo e sono aumentati in prove successive, indicando che le api hanno imparato l&#39;associazione odore-saccarosio. Ci sono state differenze nel grado che le api hanno imparato l&#39;associazione condizionata tra i diversi gruppi di studenti. Nella nostra esperienza, questi tipi di differenze potrebbero essere dovute al odore che è stato utilizzato come CS, agli elementi imprecisi nel metodo (metodo 1), o al livello di formazione degli sperimentatori. Nel terzo caso, la prestazione diventa rapidamente più coerente con maggiore esperienza degli sperimentatori. Dopo il condizionamento, ogni ape è stato testato due volte con ogni odore. In gruppi di api che erano stati condizionati con abbinamento avanti di PTOM o MCH, la risposta è stata, come previsto, più forte l&#39;odore condizionato (Figura 4B). <html> ent &quot;&gt; Il secondo gruppo di api mellifere che hanno subito in avanti accoppiamento di ottobre è stata condizionata in parallelo ad un altro gruppo in cui l&#39;odore ottobre è stata all&#39;indietro accoppiato con saccarosio. abbinamento a ritroso è uno dei diversi tipi di procedure di controllo per dimostrare che l&#39;aumento della risposta è specifico per inoltrare l&#39;accoppiamento e non a causa di un altro processo, come ad esempio l&#39;eccitazione non specifico da sensibilizzazione. Per accoppiamento all&#39;indietro, il saccarosio Stati Uniti e l&#39;odore CS sono presentati in ordine inverso di ciò che viene mostrato in Figura 1. Acquisizione Dati da accoppiamento indietro siamo non mostrato perché la CR non può essere segnata data la presentazione dell&#39;odore CS dopo la presentazione del saccarosio. come sarebbe previsto per il condizionamento associativo, i livelli di risposta a ottobre erano più alti nel gruppo in avanti accoppiato rispetto al gruppo all&#39;indietro (Figura 4C). 7fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 1: Schemi di disegno sperimentale per il condizionamento utilizzando avanti accoppiamento. Vedere la Tabella 1 per le definizioni dei termini utilizzati in questa figura. (A) Il CS (odore) precede e si sovrappone con gli Stati Uniti (soluzione di acqua / saccarosio). Il rapporto tra il CS e US mostrato è ottimale per le api da miele condizionata e falene. Ma l&#39;ottimale ISI può dipendere dal protocollo di condizionamento e specie animale 1. (B) Ripartizione e relativa tempistica di CS, CR, Stati Uniti, e UR. Il CR che si verifica sia prima presentazione degli Stati Uniti o nel corso degli studi non armato &quot;test&quot; è la misura dipendente per protocolli sperimentali. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Odore esaurimento con il riutilizzo di cartucce. Per questi dati, cartucce odore eranoset-up con esanolo come descritto nel testo. Esanolo è comunemente usato come un CS in studi PER; Tuttavia, il tasso effettivo di esaurimento dipenderà l&#39;odore e solvente. Le cartucce sono stati poi utilizzati una volta per 4 secondi ogni minuto su 8 prove (supponendo 5 api mellifere / processo in un esperimento standard che sarebbe pari a 40 usi). Le diluizioni che il solvente indicato, che erano relativamente standard per gli esperimenti PER, erano 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) L&#39;odore è stata campionata dopo la prima e l&#39;ottava prove di adsorbimento su una fase solida microestrazione (SPME) fibra che è stato poi desorbito su un gascromatografo. Le relative aree sotto i picchi erano più alti dopo il primo processo relativo alla ottava per entrambi i solventi e per entrambe le concentrazioni (Wilcoxon abbinato coppie firmato rank test p &lt;0.05 [*] o maggiore), il che dimostra che meno l&#39;odore è stato consegnato dalla cartuccia dopo che la cartuccia è stata utilizzata più volte. (C, D) Gli stessi dati mostrano solo l&#39;ottavo tr<html> IAL con l&#39;asse y espanso. Essa mostra che la deplezione era leggermente maggiore per esano rispetto all&#39;olio minerale, ma solo alla concentrazione più bassa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Acquisizione e test utilizzando decanale come il CS e il metodo 2 di condizionamento. (A) Trial-by-trial di risposta (CR) su 12 prove di abbinamento a termine (Figura 1). I dati sono da api n = 20 miele condizionata in quattro gruppi di 5 api mellifere ciascuno. L&#39;ISI è stato di 3 secondi e l&#39;ITI era 6 min. (B) prove non rinforzate con odori diversi da decanale per lunghezza e / o la posizione del carbonio carbonilico catena di carbonio. Gli odori sono stati presentati in una serie randomizzato tra i quattro gruppi e sono stati intervallati da prove rinforzati con Decanal (ogni due o tre prove), al fine di evitare l&#39;estinzione del CR. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. dati provenienti da un workshop durante il quale studenti universitari sono stati addestrati a condizionare le api mellifere utilizzando PER metodo 1. dati (A) Acquisizione da tre gruppi di api da miele condizionati per ottanolo (n = 23 e 15 per Gps 1 e 2, rispettivamente) e metilcicloesanone (n = 10) (B) CR durante le prove non rinforzate con entrambi gli odori.; quattro studi presentati in serie casuale di tutti i gruppi. (C) prove non rinforzate con entrambi gli odori in due gruppi di api da miele, uno in avanti accoppiato (Gp 1, n = 23) e uno indietro accoppiati (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Term (sigla) </td><td> Definizione </td><td> Esempio Rilevante </td></tr><tr><td> Stimolo condizionato (CS) </td><td> Lastimolo che suscita poca o nessuna risposta in un primo momento e segnala Uniti </td><td> ODOR </td></tr><tr><td> Risposta condizionata (CR) un </td><td> La risposta al CS dopo associazione con gli Stati Uniti </td><td> Proboscide ESTENSIONE </td></tr><tr><td> Stimolo incondizionato (US) </td><td> Uno stimolo biologicamente significativo che suscita una risposta </td><td> Saccarosio / SOLUZIONE ACQUA </td></tr><tr><td> Risposta incondizionata (UR) un </td><td> La risposta alla US </td><td> Proboscide ESTENSIONE </td></tr><tr><td> Inter-Stimulus Interval (ISI) </td><td> Il tempo tra l&#39;inizio della SC e insorgenza degli Stati Uniti </td><td> ODORE di intervallo saccarosio </td></tr><tr><td> Inter-Trial Interval (ITI) </td><td> Il tempo tra successivi abbinamenti CS-USA per un singolo animale </td><td> ODORE (prova n) ODORE (prova n + 1) Intervallo </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Importante Terminologia. Fare riferimento alla Figura 1 per un esempio di questi termini. Per un PER di condizionamento del CR e UR sono gli stessi, anche se per altri tipi di associazioni e riflessi del CR e UR possono differire. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Movie 1.</a> Un video di un miele delle api PER esecuzione dopo che era stato condizionato a rispondere a un odore. Nota la risposta PER dell&#39;ape circa 1,5 sec seguente odore insorgenza. Software di monitoraggio mappato i movimenti delle antenne in risposta alla presentazione del odore. Le linee tracciate in alto a destra del video raffigurano i movimenti delle antenne reali. I due grafici in basso dello schermo mostrano movimenti delle antenne sulla X (a sinistra) e Y (destra) coordinate. Le linee verticali nel grafico mostrato nel video indicano, da sinistra a destra, la luce ON, PER, luce fuori e proboscide retrazione.

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A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

a-proboscis-extension-response-protocol-for-investigating-behavioral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.2K Views.  Arizona State University. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species. 

Video: A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth (labellum), there are hair-like structures called sensilla which houses taste neurons. When an attractive substance makes contact to the labellum, the fly extends its proboscis to consume the material. Proboscis Extension Response (PER) assay measures this taste behavior response, and it is a useful method to learn about food preferences in a single fly. Solutions of various sugars, such as sucrose, glucose and fructose, are very attractive to the fly. The effect of aversive substances can also be tested as reduction of PER when mixed in a sweet solution.Despite the simplicity of the basic procedure, there are many things that can prevent it from working. One of the factors that requires attention is the fly's responsive state. The required starvation time to bring the fly to the proper responsive state varies drastically from 36 to 72 hours. We established a series of controls to evaluate the fly's state and which allows screening out of non-responsive or hyper-responsive individual animals. Another important factor is the impact level and the position of the contact to the labellum, which would be difficult to describe by words. This video presentation demonstrates all these together with several other improvements that would increase the reproducibility of this method.

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Proboscis extension response or PER is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees. When the proboscis makes contact with an attractive substance, the fly extends its proboscis to consume the substance. Solutions of various sugars are very attractive to the fly.

Proboscide Estensione di risposta (PER) Assay in Drosophila

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

Ricerca

Biologia

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Neuroscienze

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Le misurazioni elettrofisiologiche da un sistema olfattivo Moth

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Proboscide Estensione di risposta (PER) Assay in Drosophila

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Le misurazioni elettrofisiologiche da un sistema olfattivo Moth

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l'attività neurale nel Locust (

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

SwarmSight: Monitoraggio in tempo reale dei movimenti di Antenna dell'insetto e proboscide estensione Reflex utilizzando una preparazione comune e Hardware convenzionali

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento