Gli autori riconoscono il Dr. Michael J. Friedlander, direttore del Virginia Tech Carilion Research Institute per aver incoraggiato i nostri sforzi di ricerca. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di sviluppo per S.M.M e D.F.K. e in parte dall'iniziativa Nano-Bio dell'Institute for Critical Technology and Applied Science di Virginia Tech.

1. Preparare i dispositivi di acquisizioneaffinità 16
<ol><li>Pulire gli E-chips di nitruro di silicio incubandoli in 15 ml di acetone per 2 minuti seguiti da 15 ml di metanolo per 2 min(Figura 1A). Lasciare asciugare i trucioli sotto il flusso d'aria laminare.</li>
	<li>Incubare i trucioli essiccati su una piastra di agitazione riscaldata (senza mescolare) per 1,5 ore a 150 °C, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Utilizzare siringhe Hamilton per comporre miscele lipidiche in piccoli tubi di vetro per contenere il 25% di cloroformio, 55% DLPC (1,2-dilauroil-fosfocolina) in cloroformio (1 mg/ml) e 20% lipide Ni-NTA (1,2-dioleoil-iminodiacetico acido-succinil-nichel sale) in cloroformio (1 mg/ml) per un volume totale di 40 μl.</li>
	<li>Applicare un'aliquota di 1 μl della miscela su ogni goccia di 15 μl di acqua Milli-Q su un pezzo di Parafilm in una piastra di Petri umida (Figura 1B). Incubare campioni sul ghiaccio per almeno 60 minuti.</li>
</ol>2. Cattura macromolecole17
<ol><li>Posizionare un E-chip con un distanziale integrato di 150 nm sopra un campione monostrato e incubare per 1 min(Figura 1C).</li>
	<li>Sollevare delicatamente il truciolo dal campione e aggiungere un'aliquota di 3 μl di proteina A. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente(Figura 1D).</li>
	<li>Asciugare la goccia in eccesso usando Whatman #1 carta da filtro e aggiungere immediatamente un'aliquota di 3 μl di soluzione anticorpale. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione in eccesso utilizzando una siringa Hamilton e aggiungere immediatamente un'aliquota di 1 μl di DSP rotavirus (0,1 mg/ml) in soluzione tampone contenente 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM CaCl2. Incubare per almeno 2 minuti a temperatura ambiente. La preparazione dei DPP è stata descritta in precedenza18.
</li>
</ol>3. Assemblare la camera microfluidica e caricare il portabocca in situ
<ol><li>Caricare l'E-chip umido contenente il campione virale nella punta del portacampioni microfluidico. Scarica a bagliore un secondo chip elettronico piatto per 1 minuto quindi caricato sopra il chip del distanziale(Figura 2, pannelli 1-5).</li>
	<li>In alternativa, per aumentare il contrasto delle macromolecole biologiche, è possibile aggiungere macchie di metallipesanti (ad esempio lo 0,2% di formato uro-ranil) ai campioni bagnati prima di posizionare il secondo chip E sul campione bagnato. Tuttavia, il chip elettronico contenente il campione dovrà essere lavato con acqua Milli-Q prima di aggiungere il reagente di contrasto.</li>
	<li>Mettere insieme l'intero assieme per formare un involucro sigillato, tenuto in posizione meccanicamente all'interno del supporto da 3 viti di ottone(Figura 2,pannelli 6-8).</li>
	<li>Dopo il montaggio, la punta del supporto viene pompata a10-6 Torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbopompata prima di posizionare il supporto all'interno del TEM.</li>
</ol>4. Imaging in liquido utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione
<ol><li>Caricare il porta campioni in situ in un microscopio elettronico a trasmissione (FEI Company) dotato di filamento LaB6 e operante a 120 kV.</li>
	<li>Accendere il filamento TEM e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione wobbler per inclinare il campione da -15° a +15° avanti e indietro nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione z per aiutare a tenere conto del corretto spessore della camera liquida. Questo passaggio garantisce inoltre che durante la registrazione delle immagini si usi un ingrandimento accurato.</li>
	<li>Registrare prima le immagini lungo i bordi e nelle regioni angolari della camera microfluidica. Queste aree contengono in genere la soluzione più sottile. Registra immagini di campioni in condizioni a basso consumo (1-3 elettroni/Å2)utilizzando una telecamera CCD. Utilizzare ingrandimenti nominali da 6.000X a 30.000X.</li>
	<li>Determinare il valore di defocalizzazione corretto concentrandosi sul bordo della camera fluidica. Utilizzare un valore di -1,5 μm per registrare immagini con ingrandimento 30.000X. Se si incontra una soluzione spessa o se l'agente di contrasto non viene utilizzato nella preparazione del campione, utilizzare valori di defocus più elevati nell'intervallo da -2 a -4 μm.</li>
	<li>Per garantire che la soluzione sia contenuta nella camera microfluidica durante gli esperimenti, mettere a fuoco il fascio di elettroni fino a quando le bolle non si formano nel liquido all'interno del dispositivo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy.">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li><li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus.">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li><li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens.">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-negative+staining.">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li><li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li><li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy.">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li><li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy.">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li><li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell.">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li><li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere.">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li><li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores.">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction.">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination.">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li><li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Affinity+Grid:+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification.">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li></ol>

L'autrice, Madeline J. Dukes, è un dipendente della Protochips, Inc.

Nel nostro lavoro presentato, abbiamo utilizzato l'approccio di acquisizione dell'affinità per tether rotavirus DLL a una piattaforma microfluidica. Ciò ha permesso l'imaging in situ di complessi macromolecolari in un microambiente liquido. L'approccio di cattura è significativo rispetto ad altre tecniche di imaging microfluidico perché localizza campioni biologici nella finestra di imaging per negare grandi problemi diffusivi che sorgono durante la registrazione di immagini in liquido. Tuttavia, uno dei passaggi più critici del nostro protocollo prevede il trasferimento del biofilm lipidico sulla superficie del microchip. Se il monostrato lipidico non riesce a diffondersi uniformemente sulla griglia, ciò si tradurrà in un esperimento difettoso. Un'indicazione di un passaggio di trasferimento scadente è che gruppi virali poco o nessun sarà legato al chip fluidico. Una limitazione nella fase di trasferimento è la stabilità termica in relazione alla fluidità dello strato lipidico. Se la fase di trasferimento è inadeguata, come valutato dalla diffusione irregolare della goccia, gli strati lipidici devono incubare sul ghiaccio più a lungo o in una stanza fredda priva di vibrazioni. Inoltre, la piastra di Petri deve essere adeguatamente sigillata con Parafilm per mantenere la corretta umidità.
Un eccesso di complessi virali o proteine dell'adattatore nei campioni di microchip può portare a un eccessivo raggruppamento delle particelle. Questa è una limitazione nel protocollo che può essere facilmente gestita. Per ridurre al minimo l'effetto clustering, i fattori proteici possono essere incubati per un periodo di tempo più breve o il campione del virus deve essere ulteriormente diluito. Se viene rilevato un eccesso di proteine non specifiche, l'inclusione di imidazolo appena preparato (circa 50 mM) nella soluzione tampone può diminuire lo sfondo. L'uso di imidazolo fresco è un passo cruciale nel protocollo. Allo stesso modo, non sovraccaricare i chip con proteine purificate in quanto ciò non garantirà un legame specifico e si tradurrà in un esperimento difettoso. Le immagini conterranno un eccesso di proteine di fondo e non saranno adatte per le routine di elaborazione a valle. Un intervallo di concentrazione ottimale per le proteine purificate è di circa 0,01-0,1 mg/ml. Tuttavia, se questo intervallo non fornisce il livello previsto di particelle, la concentrazione del campione dovrebbe essere aumentata fino a raggiungere un livello ottimale. Un arricchimento delle particelle virali dovrebbe avvenire rispetto ai campioni di controllo negativi privi di adattatori molecolari, come gli anticorpi. Piccole quantità di legame non specifico nel controllo negativo possono verificarsi raramente, tuttavia, i microchip decorati con affinità dovrebbero sempre servire ad arricchire le particelle virali. Nel caso del rotavirus, attualmente non esiste un sistema genetico inverso per introdurre i Suoi tag nelle proteine capsidi come mezzo per catturare direttamente complessi virali su superfici decorate con Ni-NTA. I ribosomi con tag, tuttavia, sono stati reclutati con successo dai lisati batterici su chip elettronici decorati con Ni-NTA per esperimenti di imaging liquido16. Fornendo così prove, anche se limitate a questo punto, che le interazioni biologiche native si verifichino nelle cellule liquide mentre si trovano in una colonna TEM.
L'uso di detergenti, glicerolo e alti livelli di saccarosio deve essere evitato per l'imaging in situ. L'uso di questi reagenti creerà artefatti nelle immagini EM che includono un eccessivo gorgogliamento e funzionalità tenete nelle particelle, con conseguente scarsa qualità delle immagini. Se questi reagenti vengono utilizzati in preparati antivirus, il campione può essere dializzato in una soluzione tampone priva di questi componenti. I dispositivi Affinity Capture possono resistere a un certo grado di detergenti per un breve periodo di tempo, anche se questo deve essere determinato caso per caso. Si prega di fare riferimento all'elenco dei reagenti compatibili precedentementedescritti 22.
Per consentire routine di elaborazione delle immagini a valle, è possibile aggiungere una bassa concentrazione di reagente di contrasto alla camera microfluidica. Questo reagente non fissa campioni proteici, come le tradizionali procedure dicolorazione 17. Per assicurarsi che il liquido sia presente nella camera di imaging durante tutto il corso del tempo degli esperimenti, mettere a fuoco il fascio di elettroni fino a quando non si verifica la formazione di bolle (Figura 4). Questa è una semplice misura per indicare che i campioni rimangono idratati. I campioni liquidi incontrano gravi danni entro 2 minuti(Figura 4A)dall'esposizione continua del fascio di elettroni a 5 elettroni/Å2. L'esposizione prolungata continua del fascio di elettroni per 5 minuti(figura 4B)e oltre a questo dosaggio si tradurrà in un'eccessiva formazione di bolle nell'area di imaging.
La microscopia molecolare in situ utilizzata in combinazione con i dispositivi Affinity Capture consente l'esame di complessi biologici in soluzione utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Questi progressi tecnici sono resi possibili dall'uso di supporti per campioni microfluidici di nuova sviluppo. Tali dispositivi utilizzano sottili membrane di nitruro di silicio per formare una camera di imaging micro-scalata. Basandoci sul lavoro pionieristico di Parsons e colleghi7-10, forniamo una strategia utile per immaginiamo i singoli assiemi virali in soluzione. Il protocollo qui descritto spiega metodologie compatibili con le routine di elaborazione delle immagini a particella singola e i calcoli di ricostruzione 3D. Le applicazioni future che saranno il risultato della padronanza di queste tecniche possono includere l'imaging live-EM di macromolecole. Prevediamo che l'imaging in situ possa rivelare passaggi per l'assemblaggio virale, la regolazione della trascrizione o l'invasione delle cellule ospiti. In sintesi, l'uso di questi protocolli dovrebbe consentire ai ricercatori di studiare i processi dinamici in soluzione in modo completamente nuovo.

<a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx-doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Un obiettivo comune di biologi e ingegneri è quello di comprendere il funzionamento interno delle macchine molecolari. I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) sono strumenti ideali per visualizzare questi dettagli intricati a risoluzione quasi atomica1-2. Al fine di sostenere il sistema ad alto vuoto di un TEM, i campioni biologici sono tipicamente incorporati in sottili pellicole di ghiacciovitreo 3,zuccheri 4,sali di metallopesante 5o qualche combinazionedi essi 6. Di conseguenza, le immagini di campioni incorporati possono rivelare solo istantanee limitate di processi dinamici.
I primi tentativi di mantenere campioni biologici idratati in camere liquide ambientali furono intrapresi da Parsons e colleghi utilizzando stadi di pompaggio differenziali. I modelli di diffrazione elettronica dei cristalli di catalasi non macchiati sono stati registrati con successo con una risoluzione di 3 Å in uno statoidratato 7-8. Inoltre, i domini lipidici separati in fase potrebbero essere esaminati in membrane idratate di erytrocitiumani 9-10. Tuttavia, il movimento causato dalla diffusione del liquido e dalla sua interferenza con il fascio di elettroni, ha portato a una grave perdita di risoluzione e ulteriori esperimenti utilizzando campioni biologici non sono stati tentati fino a poco tempo fa.
Sono stati introdotti supporti di campioni microfluidici di nuova sviluppo che utilizzano microchip semiconduttori per formare una camera ambientale micro-scalata. Questi dispositivi possono mantenere i campioni in liquido mentre sono posizionati in una colonnaTEM 11-12. Questa svolta tecnica nell'imaging TEM ha permesso ai ricercatori di vedere, per la prima volta, eventi progressivi a livello molecolare13. Ci riferiamo a questa nuova modalità come"microscopia molecolare in situ" in quanto gli esperimenti possono ora essere eseguiti "all'interno" della colonnaEM 14-15. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di immaginiare gli assemblaggi biologici in liquido al fine di osservare i loro comportamenti dinamici a risoluzione nanometrica. La logica alla base della tecnica sviluppata è registrare osservazioni in tempo reale ed esaminare nuove proprietà dei macchinari biologici in soluzione. Questa metodologia espande l'uso dei TEM per scopi più ampi in biologia cellulare e molecolare12-16.
Nell'attuale articolo video, presentiamo un protocollo completo per assemblare e utilizzare un porta campioni microfluidici disponibile in commercio. Questi supporti specializzati utilizzano microchip di nitruro di silicio prodotti con distanziali integrati per formare una camera liquida che racchiude volumi minimi di soluzione. Finestre sottili e trasparenti vengono incise nei microchip per scopi di imaging12. Dimostriamo l'uso corretto di un supporto microfluidico per esaminare le particelle a doppio strato del rotavirus simiano (DSP) in liquido utilizzando un TEM. Per garantire che gli assemblaggi biologici, come i DSP, non si disffondono rapidamente su grandi distanze durante l'imaging, utilizziamo l'approccio Affinity Capture per li intempare sulla superficie della camera microfluidica16. Questo passaggio di cattura molecolare ha un grande vantaggio rispetto alle tecniche alternative per l'imaging di campioni biologici in liquido perché consente l'acquisizione di immagini che verranno utilizzate per le routine di elaborazione a valle. Questo passaggio di acquisizione utilizzato in combinazione con l'imaging microfluidico è unico per le nostreprocedure 17. I lettori che utilizzano applicazioni di biologia strutturale utilizzando camere di imaging TEM o microfluidiche possono considerare l'uso di tecniche di cattura dell'affinità quando le osservazioni dinamiche a livello molecolare sono l'obiettivo finale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="832">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:237px;">E-chips, spacer chip</td>
			<td style="width:183px;">Protochips, Inc.</td>
			<td style="width:245px;">EPB-52TBD</td>
			<td style="width:167px;">400 &#956;m x 50 &#956;m window</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:237px;">E-chip, top chip</td>
			<td style="width:183px;">Protochips, Inc.</td>
			<td style="width:245px;">EPT-45W</td>
			<td style="width:167px;">400 &#956;m x 50 &#956;m window</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Ni-NTA lipid</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:245px;">790404P</td>
			<td style="width:167px;">Powder form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">DLPC (12:0) lipid</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:245px;">850335P</td>
			<td style="width:167px;">Powder form</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Volumetric flasks&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:245px;">20-812A; 20-812C</td>
			<td style="width:167px;">1 ml; 5 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Hamilton Syringes</td>
			<td style="width:183px;">Hamilton Co.</td>
			<td style="width:245px;">80300, 80400</td>
			<td style="width:167px;">1-10 &#956;l; 1-25 &#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Whatman #1 filter paper</td>
			<td style="width:183px;">Whatman</td>
			<td style="width:245px;">1001 090</td>
			<td style="width:167px;">100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Glass Petri dishes</td>
			<td style="width:183px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:245px;">70165-101</td>
			<td style="width:167px;">100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Glass Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:245px;">14673-010</td>
			<td style="width:167px;">14673-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Glass culture tubes</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:245px;">47729-566</td>
			<td style="width:167px;">6 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Acetone</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:245px;">&#160;A11-1</td>
			<td style="width:167px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Methanol</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:245px;">&#160;A412-1</td>
			<td style="width:167px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:237px;">Chloroform&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Electron Microcopy Sciences</td>
			<td style="width:245px;">12550</td>
			<td style="width:167px;">100 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:237px;">His-tagged Protein A</td>
			<td style="width:183px;">Abcam, Inc.</td>
			<td style="width:245px;">ab52953</td>
			<td style="width:167px;">10 mg</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:237px;">Milli-Q water system</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore Corp.</td>
			<td style="width:245px;">Z00QSV001</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure Water</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:237px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:245px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:237px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:237px;">Poseidon In situ specimen holder</td>
			<td style="width:183px;">Protochips, Inc.</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>&#160;FEI compatible</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:237px;">FEI Spirit BioTwin TEM</td>
			<td style="width:183px;">FEI Co.</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>120 kV</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:237px;">Eagle 2k HS CCD camera</td>
			<td style="width:183px;">FEI Co.</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>10&#160;&#197;/pixel sampling at 30,000X</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:237px;">Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td style="width:183px;">Gatan, Inc.</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>Pump holder tip to 10-6&#160;range</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:237px;">PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td style="width:183px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:237px;">Isotemp heated stir plate</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td>Heat to 150 &#186;C for 1.5 hr</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ tem of biological assemblies in liquid

I ricercatori utilizzano regolarmente microscopi elettronici a trasmissione (TM) per esaminare entità biologiche e valutare nuovi materiali. Qui descriviamo un'applicazione aggiuntiva per questi strumenti: la visualizzazione di assemblaggi virali in un ambiente liquido. Questo metodo eccitante e nuovo di visualizzazione delle strutture biologiche utilizza un porta campioni a base microfluidica recentemente sviluppato. Il nostro video articolo dimostra come assemblare e utilizzare un supporto microfluidico per immagini campioni liquidi all'interno di un TEM. In particolare, utilizziamo il rotavirus simiano particelle a doppio strato (DSP) come sistema modello. Descriviamo anche passaggi per rivestire la superficie della camera liquida con biofilm di affinità che lether DLP alla finestra di visualizzazione. Questo ci consente di immaginiare gli assiemi in modo adatto per la determinazione della struttura 3D. Quindi, presentiamo un primo scorcio di particelle subvirali in un ambiente liquido nativo.

Le immagini rappresentative dei DSP in liquido che utilizzano chip elettronici scaricati in bagliore (Figura 3A) mostrano meno DSP in una determinata area di visualizzazione, presumibilmente a causa della diffusione, rispetto ai DSP arricchiti sui dispositivi Affinity Capture (Figura 3B). L'aggiunta di formato uranil nella camera di imaging migliora il contrasto del campione e quindi la visibilità dei singoli DSP in soluzione(Figura 3C,pannello superiore). Un migliore contrasto consente l'elaborazione delle immagini a valle, ad esempio la media delle particelle(Figura 3C, pannello inferiore) e le routine di ricostruzione 3D(Figura 3C, inserto) come descritto inprecedenza 17. In breve, per la ricostruzione 3D abbiamo selezionato 600 particelle di DSP utilizzando il pacchetto software SPIDER19. Particelle selezionate sono state perfezionate rispetto a un modello iniziale del rotavirus DLP20 che è stato filtrato con risoluzione 80 Å. Abbiamo utilizzato il pacchetto software RELION21 per calcolare una ricostruzione 3D con una risoluzione di circa 25 Å. La nostra mappa 3D è in buoni accordi con il modello iniziale e con una ricostruzione crio-EM indipendente che è stata calcolata utilizzando gli stessi parametri e il campione DLP17.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50936/Figure1.jpg" src="/files/ftp_upload/50936/Figure1.jpg" width="500px"> Figura 1. Preparazione di microchip di nitruro di silicio per l'imaging liquido. A)I microchip di nitruro di silicio vengono puliti immergendosi per 2 minuti in acetone seguito da 2 minuti in metanolo per rimuovere il fotoresist residuo utilizzato nel processo di fabbricazione. B)I campioni monostrato lipidici vengono preparati su gocce di acqua Milli-Q aggiunte a Parafilm in una piastra di Petriumida 17. C)I microchip puliti vengono posizionati sopra i monostrati e rimossi dopo una fase di incubazione di 1 minuto. D) Gli adattatorimolecolari (cioè la proteina A e gli anticorpi in soluzione) vengono aggiunti direttamente ai trucioli rivestiti monostrato e la soluzione in eccesso viene rimossa prima di aggiungere DSP. Il chip del campione bagnato viene quindi caricato nel supporto microfluidico.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50936/figure2.jpg" src="/files/ftp_upload/50936/figure2.jpg" width="500px"> Figura 2. Assemblaggio della camera liquida di un portabocca microfluidico. La punta della camera del campione viene assemblata aggiungendo raccordi ad anello O alla punta vuota (passaggi 1-2). Il truciolo del campione bagnato contenente distanziale integrato viene delicatamente posizionato nei raccordi lavorati all'interno della punta del supporto (passaggi 3-4). Un chip piatto scaricato incandescente viene posizionato sopra il chip del campione (passaggio 5). L'assieme viene quindi rivestito con una piastra metallica(passo 6)che viene tenuta in posizione da 3 viti in ottone (gradini 7-8).
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50936/figure3.jpg" src="/files/ftp_upload/50936/figure3.jpg" width="500px"> Figura 3. Risultati rappresentativi per le DSP in liquido. A) I microchip scaricati con bagliore legano pochissimi DSP in soluzione rispetto ai microchip decorati con affinità (B). Barre di scala, 2 μm. C)Immagine rappresentativa (pannello superiore) e ricostruzione 3D (inserto) di DSP in liquido contenente reagente di contrasto. Barra di scala, 150 nm. Il diametro della ricostruzione è di 80 nm. Le medie di classe delle DSP in liquido (pannello inferiore) rivelano caratteristiche ben definite lungo la loro superficie esterna. I singoli pannelli sono a 110 nm.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50936/Figure4.jpg" src="/files/ftp_upload/50936/Figure4.jpg" width="500px"> Figura 4. Risultati rappresentativi per la formazione di bolle in campioni liquidi nel TEM. Immagini di bolle formate in campioni liquidi dopo l'esposizione continua del fascio di elettroni a 5 elettroni/Å2 per circa 2 min(A)e 5 min(B). La barra di scala è di 100 nm.

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In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Qui descriviamo una procedura per l'immagine di complessi virali in liquido a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a trasmissione.

In situ TEM di assemblee biologiche in liquido

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

in-situ-tem-of-biological-assemblies-in-liquid

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

9.9K Views.  Protochips, Inc.. Qui descriviamo una procedura per l'immagine di complessi virali in liquido a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a trasmissione.

Video: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Ricerca

Bioingegneria

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantificazione di Global Funzione diastolica da Analisi basata su modellazione cinematica del flusso transmitralico tramite il formalismo di riempimento parametrizzate diastolica

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper and cystine, with either copper nanoparticles (CNPs) or copper sulfate contributing the metallic component. Synthesis is carried out in liquid under biological conditions (37 &#176;C) and the self-assembled composites form after 24 hr. Once formed, these composites are highly stable in both liquid media and in a dried form. The composites scale from the nano- to micro- range in length, and from a few microns to 25 nm in diameter. Field emission scanning electron microscopy with energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) demonstrated that sulfur was present in the NP-derived linear structures, while it was absent from the starting CNP material, thus confirming cystine as the source of sulfur in the final nanocomposites. During synthesis of these linear nano- and micro-composites, a diverse range of lengths of structures is formed in the synthesis vessel. Sonication of the liquid mixture after synthesis was demonstrated to assist in controlling average size of the structures by diminishing the average length with increased time of sonication. Since the formed structures are highly stable, do not agglomerate, and are formed in liquid phase, centrifugation may also be used to assist in concentrating and segregating formed composites.

Here we present a protocol to synthesize novel, high-aspect ratio biocomposites under biological conditions and in liquid media. The biocomposites scale from nanometers to micrometers in diameter and length, respectively. Copper nanoparticles (CNPs) and copper sulfate combined with cystine are the key components for the synthesis.

Generazione di scalabili, Metallic Tacchi-Aspect nanocompositi Rapporto in un Biologica Liquid Media

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

Alternando microgel ibrida Gelatina di campo magnetico-Responsive per Controlled Drug uscita

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...