Siamo grati al Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) terra e scienze biologiche (EBD) missione seme laboratorio diretto di ricerca e sviluppo (LDRD) fondo per il sostegno. Accesso strumentale è stata fornita attraverso una proposta di utente generale W. R. Wiley Ambientale Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL è una struttura di uso scientifico nazionale sponsorizzata dall'ufficio di biologico e ambientale ricerca (BER) a PNNL. Gli autori ringraziano il Dr. Yuanzhao Ding per prova leggere il manoscritto e fornire un feedback utile. PNNL è gestito da Battelle per il DOE sotto contratto DE-AC05-76RL01830.

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Dopo inoculando in ritardo-fase, è importante verificare il numero di giorni e la temperatura alla quale il biofilm dovrebbe crescere prima che sia sano e abbastanza spessa per imaging, come descritto al punto 3.1. Questa procedura riguarda in particolare la coltura di un S. oneidensis MR1 biofilm a temperatura ambiente; Tuttavia diverse temperature ambiente possono influenzare il tasso di crescita. Pertanto, è fondamentale utilizzare imaging ottico per capire se il biofilm è pronto prima di procedere all'analisi ToF-SIMS. Allo stesso modo, diversi ceppi di batteri richiedono diverse condizioni di crescita e lunghezza per ottenere uno spessore desiderabile per l'analisi. Mentre la curva di crescita in figura 1b raffigura fase log 200 dei batteri per essere h 12-32, e questo è stato usato a 24 h durante tutta la procedura, è importante notare che questa volta non può essere utilizzata come registro-fase per altri ceppi di batteri senza stabilire la curva di crescita in modo indipendente. Mentre la fase di log era tra 12 e 33 h di crescita per S. oneidensis, 24 h è stato scelto in quanto era nella parte di crescita dove ossigeno stava iniziando a limitare il tasso di crescita dell'organismo, verso la fine della fase di log. Esperimenti hanno mostrati che questo era le cellule di tempo ha cominciato a produrre nanowires, così innescato a forma di biofilm successo che potrebbe sopravvivere in ambienti a basso tenore di ossigeno. 3 , 13 di conseguenza, il tempo scelto di utilizzare i batteri durante la fase di log dovrebbe essere influenzato dalla ricerca esperienza e conoscenza acquisita dalla letteratura su studio sperimentale dei batteri in fase di studio. Inoltre, è necessario stabilire una curva di crescita separata per comprendere la fase di log per tutti i diversi ceppi di batteri che verranno utilizzati per la crescita di biofilm utilizzando questo approccio. Il tasso di crescita di 2 µ l/min è stato calcolato così come per non superare il massimo tasso di crescita di S. oneidensis MR-1 e il tempo totale è stato scelto per ottenere un biofilm maturo che non era invaso e incline allo scollegamento. Questi tassi possono essere regolati di conseguenza alla conoscenza di batteri diversi da utilizzare con il programma di installazione.
Alcune limitazioni all'utilizzo di SALVI per la crescita di biofilm includono biofouling all'interno del canale, nonché la probabilità di batteri per attaccare alle pareti del piatte del canale. Nonostante la crescita ad un tasso costante, raccomandato per essere 2 µ l/min all'interno di questo protocollo, biofouling ancora può verificarsi se il biofilm è permesso di crescere troppo a lungo. In tal caso e senza preavviso, il biofilm può staccare dalla finestra e uscire la SALVI per il contenimento di presa. Biofouling può verificarsi anche semplicemente aggiungendo forza meccanica (vale a dire, in movimento) la SALVI, che non possono essere evitati. Tuttavia, questo può essere tenuto sotto controllo da visualizzare l'allegato del biofilm alla finestra peccato prima analisi ToF-SIMS sotto un microscopio chiaro. Un'altra limitazione comprende la scorrevolezza del PDMS microchannel che può rendere difficile per alcuni batteri attaccare. Tuttavia, questo può essere cambiato nella progettazione della SALVI per ospitare creando bordi a costine per il canale, se allegato dei batteri è un problema. Infine, i conteggi delle cellule possono essere fatto al posto di letture di600 OD per determinazione di curva di crescita. Ad esempio, studi hanno dimostrato una correlazione diretta e coerenza della conta delle cellule a letture di600 OD. 21 perciò, OD600 si ritiene sufficiente a valutare la crescita di biofilm.
Limitazioni di questa tecnica sono pochi, come la SALVI funge essenzialmente da una piastra di coltura che ha tanta versatilità per l'utilizzo in molte applicazioni, come ad esempio condizioni aerobiche all'interno di un vano portaoggetti o qualsiasi camera ambientale temperatura controllata. Alcune piccole limitazioni includono incontrollabile camera condizioni quali umidità, temperatura, posizionamento vicino alla luce solare, che sono ancora possibile essere ospitati per, per condizioni di crescita ottimali di ogni batteri specifici. Inoltre, alcune di queste sfide tecniche possono essere superati con un incubatore con temperatura o caratteristiche di mediazione RH nel setup del biofilm.
SALVI è un'interfaccia di microfluidica vuoto-compatibile. In questo lavoro, un canale di microfluidica 200 x 300 µ l è stato utilizzato alla cultura biofilm seguito con SIMS ottica e liquido di imaging. Liquidi presentano una sfida tecnica per studiare utilizzando tecniche di base vuoto, perché sono volatili e difficili da mantenere in fase liquida nel vuoto. Così vuoto tecniche quali ToF-SIMS sono stati tradizionalmente limitati ai campioni solo asciutti e criogenici. 22 inoltre, SALVI può essere utilizzato per diversi imaging e spettroscopia utilizzando una varietà di tecniche di microscopia e spettroscopia. 4 , 9 il nostro gruppo ha lavorato per espandere continuamente varie applicazioni di SALVI in analisi in situ di liquidi e interfacce solido-liquido. 15 , 23 , 24 il nostro sforzo più recente ha efficacemente mostrato batteri allegato alla membrana del peccato. 9 dopo il pignoramento iniziale, continuo flusso di medie nel corso del tempo ha dimostrato di coltivare con successo un biofilm direttamente sulla finestra SIN della SALVI. Durante ToF-SIMS, il fascio di ioni primario viene utilizzato per bombardare fori di 2 µm di diametro. Questa dimensione è simile alla lunghezza delle cellule del biofilm collegato alla finestra di peccato, fornendo così un profilo chimico del biofilm nel suo microambiente naturalmente idratata. Questo è molto importante a causa della differenza di identità chimica di un biofilm, la presenza di EPS e ambiente di cluster di acqua quando si confrontano i biofilm nel suo stato idratato con campioni secchi. 9 senza l'uso di SALVI, ToF-SIMS potevano essere condotte solo su campioni asciutti e criogenici, fornendo mapping chimica che non riesce a catturare il profilo chimico di un campione nel suo stato naturale idrata.
Come illustrato nella Figura 1A, è importante mantenere la pompa a siringa sopra il tubo di gocciolamento per far sì che il tubo di gocciolamento devono essere perpendicolari al microchannel SALVI. Inoltre, le bolle saranno meno probabile di diventare intrappolati all'interno il tubo del dispositivo, se il tubo di uscita al PTFE (all'interno della bottiglia di presa) è inferiore rispetto al tubo di aspirazione (collegato alla camera di gocciolamento). Un altro passo fondamentale di coltivare batteri per la crescita di SALVI è prima ottenere una curva di crescita del ceppo particolari batteri che verrà utilizzato, come descritto nel punto 1.3. Questo può essere fatto da ottenere curve di crescita con misure di densità ottica. Una curva di crescita, come mostrato in Figura 1B, è importante per comprendere il lasso di tempo in cui i batteri sarà entro la log-in fase di crescita, quando si può presumere che i batteri sono più sani. Utilizzando batteri all'interno di questa fase della crescita facilita la creazione di un microambiente di biofilm sano e assicura che il biofilm crescerà al ritmo previsto. Il microchannel SALVI è sterilizzato a temperatura ambiente con etanolo al 70% e DI acqua, come non può essere sterilizzato nell'autoclave per la sterilizzazione prima dell'uso con ToF-SIMS. Questo è dovuto al fatto che in autoclave può danneggiare la finestra della SALVI e introdurre vapore acqueo al canale. Dopo diversi giorni di crescita, il microchannel dovrebbe essere controllato con microscopia di fluorescenza per convalidare batterica allegato. Un esempio può essere trovato nella Figura 1C, questa immagine è stata presa per mostrare un biofilm stagionato. Dovuto il percorso di flusso del mezzo, i batteri più favorevole si attacca e si sviluppa lungo i bordi del microchannel, come questa posizione è dove il flusso e le forze di taglio sono lowest.
In sintesi, SALVI è un metodo eccellente per cui a biofilm cultura e studio, utilizzando in situ chemical mapping, quanto consente di fornire il biofilm di vivere nel suo stato naturale idrata per lo spettrometro di massa imaging basati su vuoto. Questo approccio unico può fornire ulteriori informazioni su acqua cluster microambiente di un biofilm, anche per ottenere una comprensione più profonda dei suoi sottoprodotti EPS. Queste informazioni potrebbero essere utilizzate per comprendere attività biologiche di un biofilm e possono essere utilizzate in varie applicazioni come nella biomedicina, ingegneria biomedica, l'agricoltura e ricerca industriale e sviluppo.

Biofilm batterici sono comunità di superficie-associati che si sono evolute nel tempo come una difesa per i batteri di sopravvivere variando negativi stimoli fisici e meccanici, in cui le cellule sono in grado di allegare e sopravvivere in molti ambienti possibili. 1 , 2 i biofilm sono ampiamente studiati e hanno applicazioni in molti campi quali la biomedicina, ingegneria biomedica, l'agricoltura e ricerca industriale e sviluppo. 1 , 2 comprendere la mappatura chimica di queste comunità microbiche complesse, tra cui loro autoprodotti sostanze polimeriche extracellulari (EPS) e il loro ambiente di cluster di acqua locale, è essenziale per ottenere un'accurata e dettagliata rappresentazione della loro attività biologica. 2
Biofilm esistano e crescono all'interno di uno stato altamente idratato. Questo presenta una grande sfida nell'utilizzo di tecniche di analisi delle superfici basate su vuoto come spettrometria di massa di ioni secondari di tempo di volo (ToF-SIMS) dovuto la difficoltà nello studio liquidi volatili nel vuoto. Di conseguenza, tecniche di analisi delle superfici basate su vuoto sono stati limitati quasi esclusivamente a studiare campioni di biofilm al solo allo stato secco. Tuttavia, studiando un biofilm nel suo stato essiccato inibisce l'indagine accurata del suo microambiente biologico vero. Causa spesso drastici cambiamenti alla morfologia EPS integrità e biofilm, che è stata dimostrata dopo aver confrontato i risultati spettrali di massa secca biofilm agli studi in situ di liquido. 3 , 4 questo articolo presenta una soluzione per lo studio di biofilm nel loro naturale stato idratato impiegando l'uso del nostro sistema per l'analisi a liquido vuoto interfaccia (SALVI),5,6 un reattore microfluidici che contiene liquido sotto la sua membrana di nitruro (SiN) di silicio sottile in un microchannel di polidimetilsilossano (PMD), fornendo così accesso diretto per il fascio di ioni secondari sonda pur mantenendo l'integrità strutturale della matrice liquida all'interno di un vuoto camera. 7 , 8
S. oneidensis MR-1 mutato per esprimere proteine di fluorescenza verde (GFP) è stato scelto come organismo modello per questa illustrazione di procedura di biofilm grazie alla sua versatilità metabolica e di uso comune in microbiologia applicata ed ambientale, che è stato basato pesantemente sulla sua capacità uniche per la riduzione del metallo e trasferimento di elettroni extracellulare. 9 , 10 , 11 inoltre, la presenza di GFP ammessi per facile biofilm-spessore continuo monitoraggio mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un filtro di fluoresceina isotiocianato (FITC). Nostri studi precedenti hanno indicato la prova di questo batterio favorendo allegato alla finestra peccato utilizzando l'imaging di fluorescenza in operando per la crescita di biofilm ad uno spessore di fino a 100 micrometri. 4 , 12 mentre questa carta discuterà solo la conferma della presenza di biofilm attraverso microscopia di fluorescenza, la SALVI è compatibile con altri metodi di imaging ottici come super-resolution imaging di fluorescenza (cioè, illuminazione strutturata microscopia (SIM)9) e laser confocale microscopia (CLSM)4di imaging). Imaging ottico può servire per misurare lo spessore del biofilm e ottenere un'immagine 3D di, la forma del biofilm come appare, confermando il suo spessore ed il suo attaccamento alla finestra di peccato. 9 mentre GFP è stato utilizzato nell'analisi SIMS, s. oneidensis senza GFP è stato usato per la curva di crescita, come questa unica misura necessaria della densità ottica e non richiede alcuna formazione immagine fluorescente. Generalmente, la differenza tra la GFP taggati e senza tag specie nella curva di crescita è insignificante. Inoltre, mentre questo protocollo utilizza S. oneidensis MR-1 GFP come organismo modello per descrivere la procedura, questa procedura è stata progettata per qualsiasi ceppo batterico che può essere necessaria per la coltivazione all'interno di SALVI. Anche se, data la conoscenza del ceppo batterico necessario, alcune condizioni di crescita come tempo, temperatura e ossigeno ambiente potrebbero essere necessario essere modificati per accogliere il ceppo di batteri per essere utilizzato. Per mezzo di crescita, questa procedura utilizza il brodo di soia medio, Trittico "nanofili" (TSB) senza destrosio e tryptic soy agar (TSA) senza destrosio per la coltura. La composizione del mezzo "nanofili" è stato appositamente formulata per la crescita e per il monitoraggio delle estensioni della membrana e Periplasma di S. oneidensis che sembrano prendere la forma di piccoli fili e la composizione media è stata stabilito nella precedente ricerca. 13 , 14
Il nostro protocollo precedente su in situ liquido ToF-SIMS ha illustrato il beneficio che SALVI ha da offrire per immobilizzazione della proteina e l'attaccamento al peccato, come pure un protocollo dettagliato sulla riduzione dei dati e analisi ToF-SIMS. 12 piuttosto che ripetere passaggi di riduzione dei dati, questa carta servirà invece focalizzare l'approccio unico di impostazione e coltivando i biofilm all'interno nostro microchannel SALVI, come pure i passaggi imaging per rilevare la presenza di biofilm e spessore preventivo per l'analisi ToF-SIMS. Mentre biofilm sono stati precedentemente limitati solo asciugato campioni all'interno della camera di vuoto-base superficie tecniche analitiche, EPS e biofilm chimica mappatura dettagliata di biofilm live possa ora essere ottenuto in situ a causa di questa nuova funzionalità.

<table width="2446">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">ToF-SIMS</td>
			<td style="width:260px;">IONTOF</td>
			<td style="width:123px;">TOF.SIMS 5</td>
			<td style="width:1675px;">Resolution:&#62;10,000 m/&#916;m for mass resolution;&#62;4,000 m/&#916;m for high spatial resolution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td>
			<td style="width:260px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">-80&#176;C Freezer</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">4&#176;C Refrigerator</td>
			<td style="width:260px;">BioCold Scientific</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>COLDBOX1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:1675px;">Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:260px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:123px;">EW-74905-02</td>
			<td>Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Incubator</td>
			<td style="width:260px;">Barnstead International</td>
			<td style="width:123px;">LT1465X3</td>
			<td>Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;">Getinge</td>
			<td style="width:123px;">533LS</td>
			<td>Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4001-000</td>
			<td>GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1385</td>
			<td>1300 Series AZ Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:123px;">51302803</td>
			<td>Used to test the pH of the &#8220;nanowires&#8221; medium after finished and before autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">PEEK Union</td>
			<td style="width:260px;">Valco</td>
			<td style="width:123px;">ZU1TPK</td>
			<td>For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">5 Axes Sample Stage</td>
			<td style="width:260px;">IONTOF</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Barnstead Nanopure Water Purification System</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">D11921</td>
			<td>ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Pipette</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">21-377-821</td>
			<td>Range: 100 to 1,000 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Pipette Tip</td>
			<td style="width:260px;">Neptune</td>
			<td style="width:123px;">2112.96.BS</td>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Razor Blade Handle</td>
			<td style="width:260px;">Stanley</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309657</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309646</td>
			<td>5 mL; Used for making the drip chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">302830</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Disposable Pipette</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">13-678-11</td>
			<td>25 mL Fisherbrand&#8482; Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Electric Pipette Filler</td>
			<td style="width:260px;">Pipet-aid</td>
			<td style="width:123px;">P-57260</td>
			<td>Vacuum pressure electric serological pipette filler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Serum Bottle</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">33109-U</td>
			<td>Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Anaerobic Culture Tube</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89167-178</td>
			<td>Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Rubber Stopper</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">27235-U</td>
			<td>Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Aluminum Crimp Seal (without septum)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">27227-U</td>
			<td>Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Serum Bottle Aluminum Seal Crimper</td>
			<td style="width:260px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">224307</td>
			<td>30 mm crimper with standard seal.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">PTFE Tubing</td>
			<td style="width:260px;">Supelco</td>
			<td style="width:123px;">58697-U</td>
			<td>1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Disposable Cuvettes</td>
			<td style="width:260px;">GMBH</td>
			<td style="width:123px;">759085D</td>
			<td>1.5 Ml for use with spectrophotometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Needle</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">303015</td>
			<td>22G; used for serum bottle injection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Needle</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305120</td>
			<td>23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Shewanella oneidensis MR-1 with GFP</td>
			<td style="width:260px;">N/A</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, &#38; Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">&#160;S25310A</td>
			<td>95% Denatured</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">TSA</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">212305</td>
			<td>Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">PIPES Buffer</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P-1851</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S-5881</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Ammonium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A-5666</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P-4504</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S-9638</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">S271-3</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium, and used to make mineral solution used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium lactate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">L-1375</td>
			<td>60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S-5761</td>
			<td>Used to make ferric NTA solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">N-0253</td>
			<td>Used to make ferric NTA solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Iron (III) Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">451649</td>
			<td>Used to make ferric NTA solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">208094</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Manganese (II) Sulfate Monohydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M-7634</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">215422</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">223506</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Cobalt(II) Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">60818</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">229997</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C-8027</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237086</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">B-6768</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">331058</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Nickel(II) Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">339350</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Tungstate Dihydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">14304</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">47868</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F-7876</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Pyridoxine Hydrochloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P-9755</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Riboflavin (B2)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">47861</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Thiamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T-4625</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">N4126</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">21210</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Vitamin B12</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">V-2876</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">4-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A-9878</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Thioctic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T-1395</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ characterization of shewanella oneidensis mr1 biofilms by salvi and tof-sims

Biofilm batterici sono comunità di superficie-collegati che sono ampiamente studiata per capire la loro auto-prodotti sostanze polimeriche extracellulari (EPS) e i loro ruoli in microbiologia ambientale. Questo studio descrive un metodo per coltivare biofilm allegato al sistema per l'analisi all'interfaccia liquido di vuoto (SALVI) e raggiungere in situ chemical mapping di un biofilm vivente mediante spettrometria di massa di ioni secondari di tempo di volo (ToF-SIMS). Questo viene fatto attraverso la coltura di batteri sia all'esterno che all'interno del canale SALVI con la nostra installazione specializzata, nonché attraverso tecniche di imaging ottici per rilevare la presenza di biofilm e spessore prima analisi ToF-SIMS. I nostri risultati mostrano picchi caratteristici del biofilm Shewanella nel suo stato naturale idrata, evidenziando al suo ambiente cluster d'acqua localizzate, come pure di EPS frammenti, che sono drasticamente diversi di biofilm stesso disidratato stato. Questi risultati dimostrano la capacità di innovazione di SALVI che permette per l'imaging di biofilm in situ con uno strumento di imaging chimico basati su vuoto.

Questi risultati rappresentativi servono a mostrare come il profilo chimico del biofilm allegato può essere identificato e interpretato, come ottenuta attraverso ToF-SIMS. Dopo aver tracciato spettri di massa da acquisizione dati ToF-SIMS, brevemente evidenziato nella sezione procedure, identificazione del picco dovrebbe essere condotta al fine di assegnare le identità di ogni valore rispettivo m/z. Questo può essere fatto attraverso la revisione di una vasta letteratura sulla spettrometria di massa su batteri e frammenti chimici specifici che dovrebbero essere presenti all'interno i batteri studiati, come vari mazzi dell'acqua, acidi grassi e frammenti della proteina. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 questi risultati rappresentativi di mostrare solo gli spettri di massa negativi come ottengono il biofilm di S. oneidensis MR-1 e un campione di acqua DI. Interpretazione degli spettri positivi seguire una procedura simile.
Figura 1 A Mostra la configurazione schematica secondo questo protocollo quando coltivando un biofilm nel microchannel SALVI. In alto a sinistra, la siringa è attaccata ad una pompa siringa, che mantiene medie che scorre a una velocità costante in tutto il sistema di tubi di PTFE e all'interno il microchannel. Pompa a siringa viene posizionata sopra la camera di gocciolamento, che impedisce all'indietro contaminazione al serbatoio medio per prevenire motili organismi da nuoto a Monte. Il mezzo fluisce dal serbatoio di camera di gocciolamento direttamente nel tubo PTFE di SALVI, che passa attraverso il microchannel e attraverso il tubo di uscita di una bottiglia sigillata presa. Le linee tratteggiate scegliere dalla finestra peccato un'immagine di una maturata S. oneidensis cellule GFP MR-1 catturate da microscopia di fluorescenza, dettagliata al punto 3.1. Figura 1 B viene illustrato un esempio di una curva di crescita fissato utilizzando l'organismo modello per questo protocollo, S. oneidensis MR-1. Dalle fasi di crescita in questo grafico, si può concludere che il log-in fase di crescita si verifica tra 15-32 h in queste condizioni colturali specifici. Ulteriori informazioni da questo grafico mostrano che 0-15 h è la fase di ritardo di crescita, e 33-105 h rappresenta la fase stazionaria di crescita. Figura 1 C è un'immagine acquisita con microscopia di fluorescenza che mostra un esempio di un biofilm stagionato.
Figura 2 A Mostra gli spettri di massa negativi di un idrato S. oneidensis MR-1 biofilm all'interno del canale di microfluidica, come ottenuti da in situ liquido ToF-SIMS. Questo grafico mostra un esempio di confronto intervallo selezionato di massa (m/z 100-350) tra il biofilm di S.oneidensis MR-1 e DI acqua, quest'ultima è stata ottenuta come un controllo di sistema. Figura 2 B Visualizza un confronto di immagini 2D dei picchi di interesse nel biofilm MR-1 e DI acqua ottenuta da ToF-SIMS. Una volta interessanti valori m/z può essere identificato da studiare gli spettri di massa, identificazione del picco potenziale di valori m/z sono attribuite correttamente ai frammenti chimici, come sostenuto dall'indagine IonToF SIMS software biblioteca e letteratura. Picchi di interesse in Figura 2A includono mazzi dell'acqua (cioè, m/z 107 (H2O)5OH–, 125 (H2O)6OH–, 143 (H2O)7OH-, 161 (H2 O) OH8–, 179 (H2O)9OH–, 197 (H2O)10OH–, 215 (H2O)11OH–, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH–, 269 (H2O)14OH–, 287 (H2O)15OH–, 323 (H2O)17OH-, 341 (H2O)19OH–))9, come indicati da linee rosse sopra rispettivi picchi, quorum sensing hanno collegato i biomarcatori di composti (cioè, m/z 175 C10H9n.2–), sottoprodotti EPS (m/z 123 C2H4PO4-, 159 P 2 O8H–, 216 Cr2O7–, 285 octadecanoethiols, 325 composti polari, C12 polare composti)15,16,18e la catena dell'acido grasso frammenti (cioè m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, C16: 0 255 degli acidi grassi, acido linoleico 279, C18H31O2–, 325 C21H40O2 -, lipidi, 18-MEA associato tramite sollevatore tioesteri, acido stearico C18H35O2–, ioni di monoacylglyceryls di acido palmitico C19H17Oh6 di superficie di 341 -). 16 , 19
Poiché i biofilm è idratato, non è sorprendente che alcune vette visualizzati nell'esempio biofilm sono simili a quelli trovati in acqua deionizzata. Questi picchi di cluster di acqua sono contrassegnati con una linea rossa sopra ogni picco nella Figura 2A, inclusi i m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 e 341 e corrispondente a (H2O)5OH– (H2O) 6 OH– (H2O)7OH– (H2O)8OH– (H2O)9OH– (H2O)10OH– (H2 O)11OH– (H2O)12OH– (H2O)13OH– (H2O)14OH– (H2O)15OH- (H2O)17OH– (H2O)19OH-, rispettivamente. 9 come c'è prevalenza di molti mazzi di caratteristica dell'acqua in questo spettro di massa, questo risultati fornisce una forte evidenza dell'ambiente cluster chimico dell'acqua presente in un biofilm idratato. Inoltre, acqua non cluster relativi picchi osservati in due spettri possono essere attribuiti comunemente come picchi di interferenza, in genere da PDMS, un componente del canale microfluidico. Ad esempio, un picco di interferenza noti comuni da PDMS è il m/z 137 in modalità ioni negativi.
Quando confrontando il biofilm SIMS di massa spettri a quella dell'acqua DI, come mostrato in Figura 2A, non sono presenti nell'acqua DI alcuni picchi, eppure appaiono nel biofilm. Ad esempio, il picco a m/z 255 ([CH3(CH2)14COO]-, acido palmitico) è presente ad alta intensità nel biofilm campione, ma non è affatto nel campione DI acqua. Ciò suggerirebbe che la c di segnaliome da biofilm, molto probabilmente il biofilm e/o suoi EPS auto-generata. Molte vette interessanti sono stati identificati nella Figura 2A. Ad esempio, EPS relativi picchi includono m/z 123-, risultata C2H4PO4-, 159 (P2O8H–), 216 (Cr2O7–), 285 (octadecanoethiols) e 325 (composti polari, C 12 composti polari). 17 , 18 , 20 picchi associati con gli acidi grassi sono stati trovati per essere 127 ([C2H3(CH2)3COO]–), 255 ([CH3(CH2)14COO]-, acido palmitico), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, acido linoleico), 317 (C21H33O2–), 325 (C21H40O2–) e 341 (lipidi di superficie, 18-MEA associati tramite tioesteri sollevatore, acido stearico C18H35O2-, ioni di monoacylglyceryls di acido palmitico C19H17Oh6–). 16 , 19 infine, un chinolonico rilevamento segnale quorum relativo picco di C10H9n.2– è stata osservata a m/z 175.
Figura 2 B consente di visualizzare immagini 2D della distribuzione di quattro diversi ioni interessanti tra il biofilm di s. oneidensis MR-1 (riga superiore) e DI acqua (riga inferiore). Il valore di m/z 107 ((H2O)5OH–) Mostra un ammasso di acqua di significativa intensità all'interno i campioni, il valore di m/z 175 (C10H9n.2–) raffigura un quorum sensing relative al segnale, m/z 255 è un acido grasso ([CH3(CH2)14COO]-, acido palmitico), e m/z 341 (C21H41O2–) possono rappresentare entrambi i frammenti del lipido e mazzi a causa l'accuratezza di massa 1 amu dell'acqua. 9 regioni più luminose delle immagini 2D indicano un conteggio superiore dello ione molecolare presente nell'immagine. Come previsto, i segnali per il QS composto e lipidi erano molto maggiori in quantità all'interno del campione di biofilm. Mentre il segnale per il cluster di acqua (m/z 107) era più forte in tutto il campione di biofilm, era anche presente nel campione DI acqua, come previsto. Infine, il segnale a 341 m/z è stato trovato per essere omogenea all'interno del campione di biofilm, ma molto debolmente all'interno del campione di acqua DI. Mentre m/z 341 era un picco di cluster dell'acqua, era anche rappresentanza di parecchi diversi acidi grassi e lipidi di superficie. 16 cluster di presenza più forte all'interno del campione di biofilm dopo normalizzazione dei dati suggerisce che la presenza di frammenti di lipidi supera di gran lunga la presenza di acqua.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55944/55944fig1.jpg"> 
Figura 1 : Schema sperimentale. (A) consente di visualizzare lo schema sperimentale del biofilm setup come esso appare all'interno del laboratorio. A partire da in alto a sinistra, medie portate dalla siringa (1), che è collegato alla pompa a siringa (2), controllando il tasso al quale liquidi si muove attraverso. Le frecce indicano la direzione del flusso in tutto il sistema. La siringa (1) è collegata tramite un iniettore PEEK raccordo (3) alla tubazione di TFE (4). Medio scorre attraverso una camera di gocciolamento (5) per evitare la contaminazione e alla fine si muove attraverso la SALVI (6) al contenitore sigillato outlet (7). Pompa a siringa è posizionata su una superficie sopraelevata (9) tale che la camera di gocciolamento (5) può essere perpendicolare alla superficie del piatta (8) che la SALVI (6) è posto su. (B) crescita curva per Shewanella oneidensis MR-1 in mezzo "nanofili". Tempo 0-15 h rappresenta la fase di ritardo, tempo 15-33 h rappresenta la fase di log, tempo 33-105 h rappresenta la fase stazionaria e ora 105 h o rappresenta più fase di morte. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. (C), A immagine di un biofilm stagionato acquisito con microscopia di fluorescenza. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55944/55944fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55944/55944fig2.jpg"> 
Figura 2 : I confronti di ToF-SIMS negativo spettri dell'idrata Shewanella oneidensis biofilm e MR-1 medie il microchannel SALVI. Spettri di massa (A), il m/z SIMS del biofilm Shewanella oneidensis MR-1 medio e DI acqua. Quest'ultimo è stato utilizzato come controllo. Linee rosse indicano le posizioni dei picchi di cluster acqua caratteristica. (B) confronto delle immagini 2D dei picchi di interesse tra il biofilm e DI acqua. Da sinistra a destra, immagini visualizzare un cluster di acqua (m/z 107 (H2O)5OH–), un segnale di quorum sensing/ormone (m/z 175, C10H9n.2–), un acido grasso (m/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, acido palmitico) e frammenti di lipidi/EPS (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2–) di superficie. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55944/55944fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS

Questo articolo presenta un metodo per la coltivazione di un biofilm per in situ spettrometria totale di ione secondaria tempo di volo per la mappatura chimica allo stato idratato, attivata da un reattore di microfluidica, sistema per analisi presso l'interfaccia liquida di vuoto. Shewanella oneidensis MR-1 con proteine di fluorescenza verde è stato usato come modello.

In Situ Caratterizzazione di Shewanella oneidensis MR1 biofilm di SALVI e ToF-SIMS

Bacterial biofilms are surface-associated communities that are vastly studied to understand their self-produced extracellular polymeric substances (EPS) ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS

8.9K Views.  Pacific Northwest National Laboratory. Questo articolo presenta un metodo per la coltivazione di un biofilm per in situ spettrometria totale di ione secondaria tempo di volo per la mappatura chimica allo stato idratato, attivata da un reattore di microfluidica, sistema per analisi presso l'interfaccia liquida di vuoto. Shewanella oneidensis MR-1 con proteine di fluorescenza verde è stato usato come modello.

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In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using conventional synthesis techniques. Coupling soft landing with in situ characterization using secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS) enables analysis of well-defined surfaces under clean vacuum conditions. The capabilities of three soft-landing instruments constructed in our laboratory are illustrated for the representative system of surface-bound organometallics prepared by soft landing of mass-selected ruthenium tris(bipyridine) dications, [Ru(bpy)3]2+ (bpy = bipyridine), onto carboxylic acid terminated self-assembled monolayer surfaces on gold (COOH-SAMs). In situ time-of-flight (TOF)-SIMS provides insight into the reactivity of the soft-landed ions. In addition, the kinetics of charge reduction, neutralization and desorption occurring on the COOH-SAM both during and after ion soft landing are studied using in situ Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-SIMS measurements. In situ IRRAS experiments provide insight into how the structure of organic ligands surrounding metal centers is perturbed through immobilization of organometallic ions on COOH-SAM surfaces by soft landing. Collectively, the three instruments provide complementary information about the chemical composition, reactivity and structure of well-defined species supported on surfaces.

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of novel materials. Coupled with analysis by in situ secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS), soft landing provides unprecedented insights into the interactions of well-defined species with surfaces.

In Situ SIMS e IR Spettroscopia di superfici ben definite Preparato da atterraggio morbido di ioni Mass-selezionati

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Ricerca

Chimica

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Valutazione del Boro Doped Diamante elettrodi Qualità e applicazioni per<em&gt; In Situ</em&gt; Modifica del pH locale da acqua Elettrolisi

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

Sintesi e caratterizzazione di supramolecolari colloidi

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under physiologically relevant conditions.1 These measurements are performed on living biofilms in aqueous medium using source and drain electrodes patterned on a glass surface in a specialized configuration referred to as an interdigitated electrode (IDA) array. A biofilm is grown that extends across the gap connecting the source and drain. Potentials are applied to the electrodes (ES and ED) generating a source-drain current (ISD) through the biofilm between the electrodes. The dependency of electrical conductivity on gate potential (the average of the source and drain potentials, EG = [ED + ES]/2) is determined by systematically changing the gate potential and measuring the resulting source-drain current. The dependency of conductivity on gate potential provides mechanistic information about the extracellular electron transport process underlying the electrical conductivity of the specific biofilm under investigation. The electrochemical gating measurement method described here is based directly on that used by M. S. Wrighton2,3 and colleagues and R. W. Murray4,5,6 and colleagues in the 1980&#39;s to investigate thin film conductive polymers.

A protocol for measuring electrical conductivity of living microbial biofilms under physiologically relevant conditions is presented.

Caratterizzazione di trasporto dell'elettrone attraverso biofilm vivente

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

In Situ Characterization of Boehmite Particles in Water Using Liquid SEM

In situ imaging and elemental analysis of boehmite (AlOOH) particles in water is realized using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and Scanning Electron Microscopy (SEM). This paper describes the method and key steps in integrating the vacuum compatible SAVLI to SEM and obtaining secondary electron (SE) images of particles in liquid in high vacuum. Energy dispersive x-ray spectroscopy (EDX) is used to obtain elemental analysis of particles in liquid and control samples including deionized (DI) water only and an empty channel as well. Synthesized boehmite (AlOOH) particles suspended in liquid are used as a model in the liquid SEM illustration. The results demonstrate that the particles can be imaged in the SE mode with good resolution (i.e., 400 nm). The AlOOH EDX spectrum shows significant signal from the aluminum (Al) when compared with the DI water and the empty channel control. In situ liquid SEM is a powerful technique to study particles in liquid with many exciting applications. This procedure aims to provide technical know-how in order to conduct liquid SEM imaging and EDX analysis using SALVI and to reduce potential pitfalls when using this approach.

In Situ Characterization of Boehmite Particles in Water Using Liquid SEM

We present a procedure for real-time imaging and elemental composition analysis of boehmite particles in deionized water by in situ liquid Scanning Electron Microscopy.

In Situ Caratterizzazione delle particelle Boehmite in acqua usando liquido SEM

In situ imaging and elemental analysis of boehmite (AlOOH) particles in water is realized using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Segnale Nanosonda rapido aumento di sintesi di nanoparticelle di oro In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...