Gli autori desiderano ringraziare Andre Han e Yen Lawrence per l&#39;assistenza tecnica, ed i membri del laboratorio Jenkins aiuto per lo sviluppo di questo protocollo.

1. Isolamento delle cellule da tessuto linfoide <ol><li> Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen / strep, gentamicina, 2 mM L-glutammina, 55 mM 2-mercaptoetanolo) o altro equivalente mezzo di cellule T, un piatto di coltura di 60 millimetri contenente un piccolo quadrato di nylon 100 micron maglia e posto sul ghiaccio. </li><li> Eutanasia mouse. </li><li> Rimuovere la milza e come molti nodi linfatici facilmente accessibili possibile. Queste dovrebbero includere almeno le inguinali, ascellari, brachiale, linfonodi cervicali, e mesenterici. Metterli sulla parte superiore della maglia di nylon in piatto di coltura. </li><li> Utilizzando la cima piatta di una provetta da microcentrifuga 1,5 chiuso ml, schiacciare delicatamente il tessuto linfoide sulla maglia di nylon per liberare linfociti. Aggiungere un altro 1 ml di cEHAA e pipettare su e giù per lavorare le cellule in una sospensione. Trasferire le cellule attraverso un altro pezzo di maglia di nylon posizionato sopra di un tubo da centrifuga 15 ml polipropilene. Sciacquare il piatto e la rete con un altro 1 ml di ghiaccio freddo cEHAA, pooling i volumi nel tubo stesso. Ripetere per ottenere un volume finale di sospensione di cellule di 4 ml. </li><li> Aggiungere tampone freddo sorter (PBS + 2% FBS, azide 0,05%) ad un volume finale di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente il supernatante, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet cellulare in Fc block (sorter tampone + 2.4G2 anticorpo) ad un volume finale pari a circa due volte quella della stessa pellet. Ad esempio, i milza e linfonodi di un mouse ingenua solitamente produce un pellet di cellule di circa 100 pl. In questo caso, aggiungere 100 microlitri di blocco Fc per portare il volume a 200 pl. Se un elevato grado di aggregazione delle cellule si è verificato, rimuovere con attenzione il gruppo della cella a questo punto con una punta della pipetta. </li></ol> 2. Tetramero colorazione <ol><li> Aggiungere o PE-APC-etichettati pMHC tetramero ad una concentrazione finale di 10 nM (o concentrazione empiricamente ottimizzata). </li><li> Mix e incubazionete per 1 ora a temperatura ambiente (o tempo empiricamente ottimizzata e temperatura). </li><li> Aggiungere tampone freddo sorter ad un volume di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. I campioni in ghiaccio oa 4 ° C da ora. </li><li> Aspirare accuratamente il supernatante, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet di cellule in tampone sorter ad un volume finale di 200 microlitri. Per l&#39;arricchimento tetramero doppia, risospendere ad un volume finale di 150 microlitri. </li></ol> 3. Arricchimento magnetica <ol><li> Aggiungere 50 ml di microsfere Miltenyi anti-PE o anti-APC. Per arricchimento tetramero matrimoniale, aggiungere 50 microlitri di entrambi. </li><li> Mescolare e incubare per 20 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere tampone freddo sorter ad un volume di 15 ml e centrifugare la provetta per 5 minuti a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> In attesa, impostare una colonna Miltenyi LS magnetico su un magnete MidiMACS o QuadroMACS. Posizionare un tubo di polipropilene aperta 15 ml centrifuga su unaaccumulare direttamente sotto la colonna. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone sorter alla sommità della colonna, permettendo di scarico nel tubo 15 ml. </li><li> Inserire un quadrato di nylon 100 micron maglie sulla sommità della colonna. </li><li> Quando le cellule hanno finito la filatura, aspirare accuratamente il supernatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone sorter. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare attraverso la rete di nylon sulla parte superiore della colonna. </li><li> Quando la sospensione cellulare viene scaricata completamente nella colonna, lavare il tubo originale con altro 3 ml di tampone sorter e trasferire il buffer attraverso la rete di nylon nella colonna, risciacquo la maglia del processo. Gettare la rete di nylon. </li><li> Quando il buffer è svuotato completamente nella colonna, aggiungere un altro 3 ml di tampone sorter alla colonna. </li><li> Ripetere il passaggio 10 per un totale di 3 x 3 ml lavaggi. </li><li> Rimuovere la colonna dal magnete e sistemarla su un nuovo tubo da centrifuga 15 ml in polipropilene. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone sorter di tegli colonna. </li><li> Inserire immediatamente lo stantuffo nella parte superiore della colonna e un movimento continuo, spingere lo stantuffo fino in fondo, costringendo il buffer la colonna nel tubo. </li><li> Centrifugare le provette contenenti la frazione eluita associato e l&#39;deflusso frazione non legata per 5 min a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente il supernatante dalla frazione legata, assicurandosi senza goccioline di liquido vengono lasciati sui lati del tubo. Risospendere il pellet di cellule in tampone sorter ad un volume finale di 95 microlitri esattamente. Aspirare e risospendere la frazione non legata ad un volume finale di 2 ml. </li></ol> 4. Citometria a Flusso <ol><li> Per ciascuna frazione, rimuovere 5 microlitri ed aggiungere 200 ml di perline di conteggio (regolato ad una concentrazione di 200.000 / ml in tampone sorter) in una provetta 5 ml FACS. Mettere da parte a 4 ° C per una successiva analisi. Per risparmiare tempo, perline possono essere pre-aliquotati per provette etichettate prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Preparare amaster mix di anticorpi per colorare marcatori di superficie sulle cellule (Tabella 1). Per risparmiare tempo, questo può essere fatto prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Per la frazione legata, aggiungere una dose di cocktail di anticorpi direttamente al 90 ~ microlitri di cellule nel tubo. Se l&#39;analisi della frazione non legata è desiderato, trasferire 90 microlitri di cellule in una provetta da 5 ml FACS e aggiungere una dose di cocktail di anticorpi. </li><li> Impostare un gruppo di monocolore controlli di compensazione per il citofluorimetro. Per ciascun fluorocromo da utilizzare, miscelare 50 microlitri di cellule non legate frazione rimanenti in un tubo 5 ml FACS con 1 pl di anticorpo anti-CD4 coniugato al fluorocromo corrispondente. Ricordate di impostare un controllo senza macchia pure. </li><li> Vortex e incubare tutti i campioni per 30 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone sorter a ciascuna provetta e centrifugare per 5 min a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Per la frazione legata, aspirare accuratamente il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di buf sorterfer. Trasferire le cellule in una provetta 1,2 ml FACS. Sciacquare il tubo con un altro 200 microlitri di tampone sorter e la piscina nella stessa provetta. Se ciuffi cellulari sono evidenti, passare le cellule attraverso un filtro 50 micron. </li><li> Per la frazione libera e controlli di compensazione, decantare o aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di tampone sorter. </li><li> Impostare il citofluorimetro utilizzando il solo colore controlli di compensazione. Selezionare side scatter-larghezza (SSC-W) come parametro aggiuntivo da registrare. </li><li> Analizzare i campioni colorarle con una sequenza di porte inclusione successive per identificare CD4 + o CD8 + cellule T, come illustrato nelle figure 1 e 2. Per le frazioni legate, raccogliere le cellule il più possibile fino ad un massimo di 2.000.000 di eventi totali. Per le frazioni non legate, raccogliere 1.000.000 eventi totali. Mantenere la velocità di acquisizione pari o inferiore a 3.000 eventi al secondo. </li><li> Utilizzando le impostazioni della macchina stessa, analizzare i campioni di conteggio tallone. Raccogliere 10.000 eventi totali. &lt;/ Li&gt; <li> Salvare tutti i dati come file FCS. </li></ol> 5. Analisi dei dati <ol><li> Analizzare FCS file di dati per i campioni di conteggio tallone utilizzando il software FlowJo. Diagramma a dispersione in avanti da FITC e impostare una porta era infatti proprio dietro le perle di conteggio (vedi figure 1 e 2). Determinare il numero totale di conteggio perline rilevate in ciascun campione. Sottrarre dal numero totale di eventi raccolti per determinare il numero di eventi cellulari raccolti. </li><li> Calcolare il numero totale di tutte le celle in ogni campione utilizzando le equazioni descritte nel riquadro 1. </li><li> Analizzare FCS file di dati per i campioni colorati frazione legati e non legati. Impostare una sequenza di porte inclusione successive per identificare + linfoide, side-scatter-larghezza lo, dump-, CD3 +, CD4 + o CD8 +, tetramero + cellule T in ogni campione come illustrato nelle figure 1 e 2. </li><li> Moltiplicare il numero totale di cellule nel campione dalle frequenze di ciascuna delle porte di inclusione utilizzati per definire CD4 + tetramero+ O CD8 + cellule tetramero + per calcolare il numero totale di epitopo-specifiche cellule T (Box 1). </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il pMHC tetramero metodo basato arricchimento delle cellule presentata da questo protocollo è un potente strumento per lo studio delle cellule T epitopo-specifici di cellule T endogene repertori. L&#39;utilizzo di tetrameri pMHC consente il rilevamento di epitopo-specifiche cellule T basati direttamente sulla capacità dei loro TCR per legare ligandi affini pMHC. L&#39;arricchimento fornisce un livello di sensibilità in modo tale che le popolazioni estremamente rari di antigene-specifiche cellule T può essere rilevata da repertori endogene di cellule T senza alcuna manipolazione del loro patrimonio genetico o frequenza precursore. Come risultato, questa tecnica consente al ricercatore di monitorare direttamente endogeni antigene-specifiche popolazioni di cellule T da sistemi sperimentali in vivo rispetto ai loro livelli naive attraverso tutte le fasi della risposta immunitaria. Questo protocollo è stato ottimizzato per l&#39;utilizzo di pMHC classe II (pMHCII) tetrameri per arricchire epitopo-specifiche cellule T CD4 + dal organo linfoide secondarios di topi. Tuttavia, la tecnica è applicabile anche a pMHC classe I (pMHCI) tetrameri e cellule T CD8 + 9. Diversamente CD4, CD8 il corecettore gioca un ruolo significativo nella stabilizzazione TCR-MHC interazioni, e questo può avere implicazioni pratiche per colorazione pMHCI tetramero 10. Più in particolare, l&#39;uso di anticorpi CD8 dovrebbe essere limitato a cloni che non compromettono CD8-tetramero vincolante, e dovrebbero essere aggiunti alle cellule dopo la colorazione tetramero. Infatti, alcuni pMHCI tetrameri sono stati progettati con mutati MHCI-CD8 siti di legame per attenuare il legame non specifico di cellule T CD8 + 11,12. Tetramero concentrazione, tempo di incubazione, e la temperatura di incubazione può influenzare notevolmente l&#39;efficienza della colorazione tetramero e le condizioni dovrebbero essere ottimizzate per ottenere la migliore combinazione di segnale ad alta tetramero, segnale di fondo basso, interiorizzazione tetramero basso e modifiche minime fisiologia cellulare. Idealmente, queste condizioni dovrebbe be determinata empiricamente per ogni reagente unico. Nelle nostre mani, tuttavia, una concentrazione finale di 10 nM e una incubazione di 1 ora a temperatura ambiente fornisce buone condizioni generiche per la maggior parte dei tetrameri pMHCI o pMHCII. In generale, tetrameri pMHCI sembrano macchiare più facilmente di tetrameri pMHCII, colorazione e spesso può essere eseguita a 4 ° C per un minimo di 30 min. La scala di questa procedura è adatto per l&#39;analisi di quasi tutti gli organi linfoidi secondari di un topo in un singolo campione. Pertanto, ciascun campione rappresenta un&#39;analisi esaustiva di tutta la circolazione periferica repertorio T di un mouse. Epitopi specifici per le cellule T possono essere arricchiti anche da altri tessuti pertinenti, tra cui il timo 13,14. Quando thymii 4-5 settimane topi vecchi sono analizzati, timociti singolo epitopo-specifici positivi possono essere rilevati a numeri simili a quelli periferici di cellule T naive. Epitopo-specifici doppio positive timociti,tuttavia, sono molto difficili da rilevare a causa della loro bassi livelli di espressione TCR. Questo protocollo può anche essere adattato per rilevare umani epitopo CD4-specifici + o CD8 + cellule T nel sangue o di altri tessuti 15-17. La frequenza di epitopo-specifiche cellule T è circa la stessa tra topo e uomo 17, quindi l&#39;analisi di 50 - 100 ml di sangue produrrebbe numeri simili di cellule T epitopo-specifici come la milza riunite e linfonodi di un mouse 18. Una sfida importante per l&#39;analisi citofluorimetrica delle cellule in seguito a base di arricchimento tetramero è distinguere gli eventi cellulari veri da sfondo. Ciò è dovuto al fatto che molte cellule autofluorescenti sono anche non specificamente arricchito durante il processo. Se non con cautela gated, queste cellule autofluorescenti può apparire come tetramero falsi-positivi cellule e buttare fuori l&#39;accuratezza dell&#39;analisi, in particolare nel caso di rare cellule T naive populations. Il nostro protocollo impiega una strategia in due fasi gating in cui CD3 + eventi sono prima gated dalla stirpe discarica + eventi, e quindi CD4 + eventi sono gated lontano da eventi CD8 +. Nel processo, cellule autofluorescenti, che tendono a giacere lungo la diagonale centro di ogni trama FACS, sono fuori gated dell&#39;analisi in due fasi iterative. L&#39;efficace rimozione degli eventi autofluorescenti arriva al costo di molti colori fluorescenti, quindi ti consigliamo l&#39;utilizzo di citofluorimetri in grado di almeno 6 parametri fluorescenti. Tetrameri più pMHC sono coniugati a PE e APC grazie alla luminosità di questi fluorocromi, e anti-PE e anti-APC microsfere magnetiche sono facilmente disponibili per consentire arricchimento con loro. Tuttavia, altri fluorocromi possono anche essere utilizzati purché corrispondenti microsfere magnetiche sono disponibili. Infatti, tetrameri multipli con differenti fluorocromi etichette possono essere utilizzati insieme con il corrispondente anticorpo coniugato microbeads per arricchire simultaneamente più epitopo-specifiche popolazioni di cellule T dallo stesso campione. Abbiamo delineato una base molto anticorpo-fluorocromo configurazione che è ottimizzato per l&#39;uso di PE-e-APC etichettati tetrameri (Tabella 1), ma molte altre combinazioni possibili sono efficaci per aumentare la flessibilità nello studio di marcatori fenotipici. CD8 + popolazioni di cellule T può essere utilizzato come controllo interno negativo, in quanto non deve legarsi ligandi pMHCII (e viceversa per epitopo specifico CD8 + arricchimento delle cellule T). La frequenza del tetramero + CD8 + in un campione fornisce una buona valutazione del livello di colorazione di fondo tetramero, sebbene leali tetramero-positive cellule T CD8 + con cross-ristretta specificità di epitopi pMHCII possono esistere a frequenze molto piccole 19. Di tanto in tanto durante le risposte immunitarie molto forti, queste cellule possono esistere a frequenze espanse. Se lo si desidera, TCR transgenico cellule T ingegnoh o senza specificità di epitopo corrispondente può essere utilizzato come ulteriori controlli positivi e negativi. Si noti che, per ragioni sconosciute, alcune cellule transgeniche TCR e ibridomi non si colorano bene con le loro tetrameri pertinenti. Il nostro protocollo prevede l&#39;utilizzo di perline fluorescenti conteggio per assistere nel calcolo del numero di cellule. Mentre la conta delle cellule può essere ottenuto manualmente con un emocitometro, troviamo che l&#39;uso di perline in conteggio risultati sperimentali precisione molto maggiore, specialmente quando sono coinvolti più investigatori. A causa dei piccoli numeri e volumi di cellule che sono trattati in questo protocollo, la riduzione al minimo di errore sperimentale dovrebbe essere una priorità. Colorazione tetramero è compatibile con la fissazione delle cellule e permeabilizzazione, e diversi studi hanno analizzato con successo citochine intracellulari e del fattore di trascrizione di espressione nelle cellule in seguito tetramero a base di arricchimento delle cellule 20,21.Tuttavia, i passaggi aggiuntivi di contribuire alla perdita di cellule addizionali nei campioni.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Fornitore</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE o APC coniugato pMHC tetramero (o multimero)</td&gt;<td&gt; Realizzato da investigatore, ottenuto dal nucleo NIH tetramero, o acquistati da fonti commerciali</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microsfere coniugate magnetici</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microsfere coniugate magnetici</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colonne LS magnetici</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS o QuadroMACS magnete</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 o 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cell conteggio perline</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

Una necessità di base per i ricercatori che studiano immunità adattativa con modelli sperimentali in vivo è la capacità di identificare cellule T in base al loro recettore antigene sulla cellula T (TCR) specificità. Molti metodi indiretti sono disponibili in cui una popolazione di cellule T bulk è stimolata in vitro con un antigene specifico epitopo-specifici e le cellule T sono identificati mediante la misurazione di una risposta funzionale come proliferazione, produzione di citochine, o l&#39;espressione di marcatori di attivazione 1. Tuttavia, questi metodi solo identificare epitopi specifici per cellule T presentano una delle tante possibili funzioni, e non sono sufficientemente sensibili per rilevare le cellule T epitopo-specifici a frequenze precursori naive. Un&#39;alternativa popolare è il modello transgenico trasferimento TCR adottiva, in cui le cellule T monoclonali da un topo transgenico TCR sono seminati in istocompatibili host per creare una vasta popolazione precursore di epitopo-specifiche cellule T che possono essere facilly cingolato con l&#39;uso di un anticorpo marcatore congenic 2,3. Mentre potente, questo metodo soffre di artefatti sperimentali associate alla frequenza fisiologica di cellule T con specificità per un singolo epitopo 4,5. Inoltre, questo sistema non può essere usato per studiare l&#39;eterogeneità funzionale di epitopo-specifici cloni di cellule T all&#39;interno di una popolazione policlonale. Il modo ideale per studiare l&#39;immunità adattativa dovrebbe coinvolgere il rilevamento diretto di cellule T epitopo-specifici del repertorio endogeno delle cellule T utilizzando un metodo che distingue la specificità TCR esclusivamente dal suo legame con l&#39;affine peptide: MHC (pMHC) complessi. L&#39;utilizzo di tetrameri pMHC e citometria di flusso realizza questo 6, ma è limitata alla rilevazione di popolazioni ad alta frequenza di epitopo-specifiche cellule T solo trovati seguente indotta da antigene espansione clonale. In questo protocollo, si descrive un metodo che coordina l&#39;uso di tetrameri pMHC e magnetecnologia delle celle tic arricchimento abilitare il rilevamento di frequenza estremamente bassa epitopo-specifiche cellule T di topo tessuti linfoidi 3,7. Con questa tecnica, si può globalmente intera traccia epitopo-specifiche popolazioni di cellule T endogene in topi in tutte le fasi della risposta immunitaria.

La figura 1 illustra rappresentante trame citometria a flusso di milza pMHCII tetramero arricchito e campioni di linfonodi di topi naive, mentre la figura 2 mostra i dati rappresentativi per topi precedentemente immunizzati con il peptide corrispondente + CFA. Gating seriale rimuove eventi indesiderati autofluorescenti e altre dall&#39;analisi di CD4 + popolazioni di cellule T. Il CD8 + popolazione di cellule T serve come controllo interno negativo utile per la colorazione pMHCII tetramero di cellule T CD4 +. Si noti che le frazioni associate dal arricchimento di solito contengono una percentuale significativamente maggiore di cellule autofluorescenti che le frazioni non associate, rendendo più difficile gating. Numero assoluto di epitopo-specifici cellule T in un campione sono calcolati moltiplicando il numero totale di tutte le celle nella frazione legata del campione arricchito, come determinato dall&#39;analisi conteggio tallone, con la proporzione di queste cellule che sono + tetramero, come determinazioneNed dall&#39;analisi colorazione delle cellule (Box 1). Per il mouse naive in figura 1, la concentrazione di tutte le celle nella frazione legata del campione è (4411/5589) (200.000) (0.200/0.005) = 6,31 x 10 6 / ml. Il numero totale di tutte le cellule nel campione è (6,31 x 10 6 / ml) (0,095) = 6,00 x 10 5. Infine, il numero totale di epitopo-specifiche cellule T CD4 + è (6,00 x 10 5) (41,5%) (96,6%) (10,2%) (62,3%) (0,64%) = 98. Per il topo immunizzato in figura 2, la concentrazione di tutte le celle nella frazione legata del campione è (6410/3590) (200.000) (0.200/0.005) = 1,43 x 10 7 / ml. Il numero totale di tutte le cellule nel campione è (1,43 x 10 7 / ml) (0,095) = 1,36 x 10 6. Infine, il numero totale di epitopo-specifiche cellule T CD4 + è (1,36 x 10 6) (40,9%) (93,9%) (9,54%) (72,0%) (42,7%) = 1,53 x 10 4 &lt;/ Strong&gt;. L&#39;efficienza diminuisce di arricchimento, come il numero di epitopo-specifiche cellule T aumenta 8, così tetramero cellule + può essere visto nella frazione libera di campioni contenenti alte frequenze epitopo-cellule T specifiche. In tali casi, il numero di epitopi specifici per cellule T presenti nella frazione non legata può essere calcolata separatamente e aggiunti al numero trovato nella frazione legata. Pertanto, in figura 2, la concentrazione di tutte le celle della frazione non legata del campione è (9031/969) (200.000) (0.200/0.005) = 7,46 x 10 7 / ml, il numero totale di tutte le cellule è (7,46 x 10 7 / ml) (2,0) = 1,49 x 10 8, e il numero totale di epitopo-specifiche cellule T CD4 + è (1,49 x 10 8) (62,7%) (96,4%) (44,5%) (54,7%) (0,0409 %) = 8,97 x 10 3. Aggiungendo i numeri nelle frazioni legati e non legati, ci sono 1,53 x 10 4 + 8,97 x 10 3 = 2.43 x10 4 totali epitopo-specifiche cellule T CD4 + in tutto il campione. Infatti, se epitopo specifico per l&#39;espansione delle cellule è sufficientemente robusto, il processo di arricchimento può essere saltato. <table border="1"><tbody><tr><td> Fluorocromo </td><td> Anticorpo </td></tr><tr><td> Pacific Blue </td><td> dump (B220, CD11b, CD11c, F4/80) </td></tr><tr><td> Pacific Arancione </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> PE </td><td> pMHC tetramero o marcatore fenotipico </td></tr><tr><td> PerCP </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> APC </td><td> pMHC tetramero o marcatore fenotipico </td></tr><tr><td> AlexaFluor 700 </td><td> CD44 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Consigliata colorazione strategia anticorpo <img alt="Figura 1" fo<html> : Content-width = &quot;6in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4420/4420fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4420/4420fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Analisi citofluorimetrica di epitopo-specifiche cellule T CD4 + in topi naive seguenti pMHCII tetramero a base di arricchimento. Grafici rappresentativi sono riportati per i legati (A) e non legato (B) frazioni. Una serie di porte sono impostati per selezionare linfoide-scatter +, side-scatter-widthlo, dump-, CD3 + eventi. Di questi, CD4 + o CD8 + eventi sono gated per l&#39;analisi di epitopo-specifici cellule T o colorazione di fondo. Aliquote di cellule non marcate dal legato (C) e non legato (D) frazione sono stati miscelati con perline fluorescenti conteggio e analizzati separatamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4420/4420fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . oad/4420/4420fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Analisi citofluorimetrica di epitopo-specifiche cellule T CD4 + in topi immunizzati-peptide seguenti pMHCII tetramero-based arricchimento. Grafici rappresentativi sono riportati per i legati (A) e non legato (B) frazioni. Una serie di porte sono impostati per selezionare linfoide-scatter +, side-scatter-widthlo, dump-, CD3 + eventi. Di questi, CD4 + o CD8 + eventi sono gated per l&#39;analisi di epitopo-specifici cellule T o colorazione di fondo. Aliquote di cellule non marcate dal legato (C) e non legato (D) frazione sono stati miscelati con perline fluorescenti conteggio e analizzati separatamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4420/4420fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Box 1. Calcolo di epitopi specifici per numero di cellule T Numero assoluto di epitopo-specifiche cellule T sono più calcolati con l&#39;ausilio di perline fluorescenti conteggio. Un&#39;aliquota di macchiacellule da ciascun campione è mescolato con un volume definito di conteggio perline fissati ad una concentrazione nota e quindi analizzate mediante citometria a flusso. La concentrazione di cellule nel campione può essere dedotta da un confronto della frequenza con la concentrazione nota di perline fluorescenti conteggio. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4420/4420eq1.jpg" /> Il numero totale di cellule nel campione viene calcolato moltiplicando la concentrazione cellulare con il volume totale del campione. <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/4420/4420eq2.jpg" /> Il numero totale di cellule T epitopo-specifici nel campione è semplicemente il numero totale di tutte le cellule del campione moltiplicata per la percentuale di cellule che sono tetramero-positive. <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/4420/4420eq3.jpg" />

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Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Questo protocollo descrive l&#39;uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse da<em&gt; In vivo</em&gt; Sistemi sperimentali.

Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Questo protocollo descrive l'uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse da In vivo Sistemi sperimentali.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolamento di Double Negative Cellule T αβ dal rene

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivazione di cellule T<em&gt; In Vitro</em&gt; Da cellule staminali embrionali di topo

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellule T Capture batteri da Transinfection da cellule dendritiche

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...