Ringraziamo il Dott. Pina Colarusso e Live strumento imaging cellulare per la loro assistenza, con immagini e analisi di immagine, la signora Lailey per la sua assistenza tecnica, e 51 unità presso l&#39;Ospedale Foothills in Calgary, AB per la fornitura di cordoni ombelicali umani. Dr. KD Patel è un Innovates Alberta: Salute Scientist Solutions. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di funzionamento degli Istituti canadesi di ricerca Salute e contributi per investimenti fissi e delle infrastrutture da parte della Fondazione canadese per l&#39;innovazione e la scienza Alberta e Autorità di ricerca.

1. Isolamento e manutenzione di cellule endoteliali vascolari umane <ol><li> Procedure di biosicurezza di livello 2 deve essere utilizzato quando si lavora con sangue umano e dei tessuti. Utilizzando forbici tagliare il cordone dalla placenta e poi esaminate con attenzione il cavo di coaguli di sangue ei danni causati dalla chiusura il cavo durante il parto. Tagliare ed eliminare queste porzioni del midollo. </li><li> Preparare la soluzione fresca collagenasi a 1 mg / ml versando 50 ml di tampone cavo caldo in un tubo che contiene 50 mg di collagenasi. </li><li> Cambia in guanti sterili e aprire un vassoio contenente sterilizzati sterilizzato strumento cannule smussate, pinze, forbici, corda a tre vie stop-galli e garza in una cappa a flusso laminare. </li><li> Identificare le due arterie e il presente singola vena nel midollo. Le arterie sono più piccole e tendono ad essere strettamente ristretto, mentre la vena è grande e facile da incannulare. Per lavare il sangue dalla vena, inserire delicatamente una cannula con una bidirezionale rubinetto collegato ad esso inPer una estremità della vena e del luogo una fascetta intorno cannula per tenere saldamente in posizione. Perfusione buffer di cavo attraverso la vena. Ripetere fino flusso attraverso chiaro e poi serrare l&#39;estremità del cavo. </li><li> Collagenasi perfusione nella vena, chiudere il rubinetto, posizionare il cavo in un bicchiere contenente tampone caldo cavo e incubare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere il cavo e massaggiare delicatamente il cavo di sciogliere le cellule endoteliali dal lume della vena. Scolate la soluzione nella provetta contenente i media delle cellule endoteliali (ECM). Lavare con tampone cavo due volte per rimuovere le cellule rimanenti. Scolate la soluzione nel tubo stesso. </li><li> Centrifugare le cellule a 350 xg per 10 minuti per agglomerare le cellule endoteliali. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di ECM al pellet. Risospendere delicatamente le cellule in ECM, poi trasferire le cellule a un pallone T75 pre-rivestito con 0,2% di gelatina. Pre-rivestimento con gelatina è stato fatto per almeno 1 ora a 37 ° C. Crescere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Il giorno dopo, scuotere delicatamente il pallone rimuovere eventuali globuli rossi, quindi rimuovere il surnatante e lavare con una soluzione salina bilanciata di Hank calda (HBSS). Rimuovere HBSS e nutrire le cellule con 10 ml di ECM caldo. Esaminare le cellule con il microscopio per assicurare che i globuli rossi sono stati rimossi. Valutare il grado di confluenza e della morfologia delle cellule endoteliali. Le cellule endoteliali, in questa fase dovrebbe essere allungata senza alcun segno di vacuoli. </li><li> Continuare a cambiare il supporto ogni tre giorni finché le cellule raggiungano la confluenza, le cellule poi dividere con una soluzione 0,08% di tripsina contenente 1 mM EDTA. Piatto cellule endoteliali in piatti desiderati pre-rivestito con 0,2% di gelatina. Le celle dovrebbero raggiungere la confluenza in 3-6 giorni. </li><li> Quando si utilizza ibidi camere, pre-coat ogni camera con il 0,2% di gelatina. Rimuovere eccesso gelatina e fibronectina e quindi aggiungere 1,5 X 10 6 / ml di cellule endoteliali sospese in ECM nella camera. Modificare i media a giorni alterni fino al confluent. Le celle dovrebbero essere confluenti in 2-3 giorni a seconda del cavo. </li></ol> 2. Preparazione di neutrofili <ol><li> I neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico di volontari sani mediante centrifugazione densità. Un protocollo dettagliato con una dimostrazione visiva per l&#39;isolamento dei neutrofili può essere trovato nel numero precedente di questa rivista 6. Una volta isolato, neutrofili risospendere ad una concentrazione di 1x10 6 / mL in HBSS contenente 0,5% di albumina umana. </li></ol> 3. Impostazione della Camera Ibidi <ol><li> Coltivare cellule endoteliali in una gelatina rivestita camera ibidi. Esaminare ogni giorno con microscopio a contrasto di fase fino a quando diventano ben confluenti. </li><li> Stimolare le cellule endoteliali per aumentare l&#39;espressione di molecole di adesione e di attivazione. Ai fini di questo protocollo, le cellule endoteliali sono state stimolate con 10 ng / ml di TNF-α ricombinante per quattro ore a 37 ° C e 5% CO <sub&gt; 2 prima di impostare la camera ibidi per l&#39;imaging in condizioni di flusso. </li><li> Preparare il microscopio, e la pompa a siringa visivamente descritto da Wiese e colleghi 11 con una camera vuota ibidi. </li><li> Principali differenze tra questo protocollo e la procedura di Wiese comprendono pre-riempimento del tubo per evitare l&#39;esposizione delle cellule endoteliali in aria, mantenendo il tampone a 37 ° C con un bagno d&#39;acqua, utilizzando un tubo in PharMed di mantenere il buffer di perdere temperatura e con differenti obiettivi sul microscopio a seconda che l&#39;imaging con contrasto di fase o fluorescenza. </li><li> Una volta che il microscopio è impostato e il tubo è pieno di HBSS, chiudere tutti i rubinetti e togliere la camera vuota ibidi. </li><li> Collegare la camera contenente ibidi TNF-α stimolato le cellule endoteliali al tubo. </li></ol> 4. Reclutamento dei neutrofili e Trasmigrazione <ol><li> Visualizza il monostrato delle cellule endoteliali nel microscaprir con un obiettivo 10x contrasto di fase. </li><li> Impostare la pompa a siringa per ritirare ed iniziare il flusso di HBSS alla sollecitazione di taglio desiderata (tipicamente tra 0,5-2 dine / cm 2). </li><li> Sul lato di ingresso, passaggio da HBSS al neutrofili isolati (1x10 6 / mL), girando a tre vie rubinetto. </li><li> Iniziare la registrazione utilizzando una fotocamera CCD connesso ad un registratore DVD o collegato direttamente al computer. Avviare il timer quando neutrofili entrare nella camera. Perfusione neutrofili per quattro minuti. Un totale di 3 ml della sospensione neutrofili è sufficiente per un singolo esperimento. </li><li> Dopo quattro minuti, tornare a HBSS per prevenire l&#39;attacco di neutrofili nuovi. Se i dati per le interazioni totali, laminazione e ferma adesione sono desiderate, immagini 6 campi casuali per 10 secondi ciascuno utilizzando un obiettivo 10x contrasto di fase tra 4 e 5 minuti. </li><li> Passare a un obiettivo 40x e registrare un singolo campo di vista tra 5 e 10 minuti. A 10 minuti, raccoglieretra 5 e 10 campi casuali di vista. </li><li> Arrestare il flusso e passare alla camera successiva. </li></ol> 5. Imaging fluorescente in condizioni di flusso utilizzando una camera Ibidi <ol><li> Le cellule endoteliali sia etichette o neutrofili con una sonda fluorescente di interesse. Ad esempio, un anti-VE-caderina coniugato a Alexa-[547] può essere utilizzato per visualizzare giunzioni delle cellule endoteliali. </li><li> Montare camera ibidi su un microscopio con contrasto di interferenza differenziale (DIC) e le capacità fluorescenti. Usiamo un FluoView 1000 confocale (Olympus), con una camera climatica. Messa a fuoco con un obiettivo progettato per il lavoro DIC e fluorescenti. </li><li> Acquisire le immagini simultanee DIC e fluorescenza utilizzando il software fornito dal produttore mentre si segue l&#39;andamento temporale descritto nella sezione 4. </li></ol> 6. Analisi del reclutamento dei neutrofili <ol><li> Analisi di laminazione e interagire cellule è descritto da Wiese et al 11. </li&gt; <li> Per misurare la percentuale di neutrofili rotolamento sul monostrato endoteliale contare il numero di neutrofili che sono spostati più del diametro di cella in un periodo di 5 secondi. Dividere questo numero per il numero totale di leucociti in campo per determinare la percentuale di cellule di laminazione. Per estensione, le cellule rimanenti sono considerate saldamente aderente. </li><li> Misurare la velocità di rotazione dei neutrofili calcolando la distanza percorsa neutrofili in un determinato periodo di tempo e poi dividendolo per quel tempo in secondi. </li><li> Trasmigrazione è determinata contando il numero di neutrofili che hanno cambiato forma e migrato sotto il monostrato 10. Questi neutrofili sono identificati dal fatto che cambiano dall&#39;essere fase luminosa quando sopra del monostrato ad essere scuro fase quando sotto il monostrato 10. Il numero di cellule trasmigrato può essere espresso come percentuale delle cellule totali nel campo visivo o come insensibile primaer di cellule trasmigrato per unità di area. In questo sistema modello, il 50% di neutrofili trasmigrano dopo 10 minuti. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Le cellule endoteliali stimolate non supportano il reclutamento dei neutrofili. Al contrario, stimolando le cellule endoteliali con TNF-alfa si traduce in neutrofili rolling, adesione e la ferma. Un esempio di questi dati è mostrato nelle figure 1 e 2. Figura 1A mostra neutrofili interagiscono con TNF-α-stimolate cellule endoteliali. Queste interazioni possono essere quantificato, rivelando il numero totale dei neutrofili interagiscono con le cellule endoteliali, nonché il numero di neutrofili laminazione, saldamente aderente o trasmigrato (Figura 2). Trasmigrazione dei neutrofili può avvenire in giunzioni cellulari o attraverso le cellule endoteliali stesse. Per distinguere tra queste due condizioni, le cellule endoteliali vengono etichettati con un anti-VE-c<html> anticorpi adherin e trasmigrazione è stato segnato come si verificano paracellularly o transcellularly (Figura 1B e C). In questo modello, quasi tutti trasmigrazione è paracellulare 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Figura 1. DIC simultanea e imaging di fluorescenza in condizioni di flusso utilizzando una camera ibidi. (A) image DIC fresco isolato neutrofili umani che migrano tra le cellule umane endoteliali della vena ombelicale. La freccia gialla indica uno dei neutrofili aderente, la freccia bianca mostra uno dei neutrofili trasmigrando. (B) giunzioni delle cellule endoteliali sono state colorate con un anticorpo anti-VE-caderina coniugato con Alexa-[547] e immaginata. (C) mostra sovrapposizione del canale A e B, rivelando che la quasi totalità trasmigrando in questo modello è paracellulare. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Figura 2. Cellule endoteliali sono state stimolate lasciati o sono state stimolate con 10 ng / ml di TNF-α. Dopo 4 ore, una camera di flusso parallelo piastra è stata assemblata e neutrofili sono stati perfusi in 1 a dine / cm 2. (A) le interazioni neutrofili sono stati esaminati e misurati utilizzando il software ImageJ dal NIH. Le cellule interagenti totali sono stati caratterizzati come (B) al rotolamento, saldamente aderente o (C) trasmigrando. I dati rappresentano la media + SEM di tra 3 e 5 esperimenti. La differenza tra il controllo e TNF in pannelli A e C è significativa (p &lt;0,001).

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+rolling,+arrest,+and+transmigration+across+activated,+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b/CD18.">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells.">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li><li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials.">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

<html> I ricercatori hanno utilizzato di routine cellule endoteliali da diversi letti vascolari per studiare il reclutamento dei neutrofili e trasmigrazione. Esempi includono, ma non sono limitati a, derma cellule endoteliali microvascolari 12, fegato cellule endoteliali sinusoidali 13 e cellule endoteliali di vena ombelicale umano 10. Tra questi HUVEC acquisito vasta popolarità a causa della loro relativa facilità di isolamento e di disponibilità. HUVEC sono un potente modello in ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente e </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cord tampone </td><td></td><td></td><td> Composizione: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucosio in 1mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 tampone a pH 7,4 </td></tr><tr><td> Media cellule endoteliali (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 con sali aquila integrati con il 16% di siero umano contenente 100 unità di penicillina 100 mg di streptomicina e 0,3 mg di L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina glutammato streptomicina (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi camere </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> Prepro Tech </td><td> 300-01A </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di albumina umana 20% </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + e Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. Essi costituiscono una parte essenziale del sistema immune innato 1. Durante l&#39;infiammazione acuta, i neutrofili sono le prime cellule infiammatorie a migrare verso il luogo della ferita. Assunzione di neutrofili a un sito della lesione è un processo graduale che comprende in primo luogo, la dilatazione dei vasi sanguigni per aumentare il flusso di sangue, in secondo luogo, microvascolari cambiamenti strutturali e la fuga di proteine ​​del plasma dal sangue, in terzo luogo, rolling, adesione e la trasmigrazione dei neutrofili attraverso l&#39; accumulo di neutrofili e quarto al sito della lesione 2,3; endotelio. Una vasta gamma di in vivo e in vitro è evoluto per consentire lo studio di questi processi 4. Questo metodo si concentra sulla trasmigrazione neutrofili attraverso cellule endoteliali umane. Un metodo popolare per esaminare i processi molecolari coinvolti nella trasmigrazione dei neutrofili utilizza umana neutrophils interagiscono con le cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC) 5. L&#39;isolamento dei neutrofili è stato descritto visivamente altrove 6; così questo articolo mostrerà il metodo per l&#39;isolamento di HUVEC. Una volta isolate e coltivate a confluenza, le cellule endoteliali vengono attivate causando la sovraregolazione di molecole di adesione e di attivazione. Ad esempio, l&#39;attivazione di cellule endoteliali con citochine come TNF-a risultati aumentati E-selectina e IL-8 espressione 7. E-selectina media di cattura e di rotolamento dei neutrofili e IL-8 di attivazione media e ferma adesione dei neutrofili. Dopo l&#39;adesione dei neutrofili trasmigrare. Trasmigrazione può avvenire paracellularly (mediante giunzioni di cellule endoteliali) o transcellularly (attraverso la cellula endoteliale stesso). Nella maggior parte dei casi, queste interazioni avvengono in condizioni di flusso presenti nel sistema vascolare 7,8. Il parallelo camera di flusso piatto è un sistema largamente utilizzato, che mimicrofoni il taglio idrodinamico sollecitazioni trovato in vivo e permette lo studio del reclutamento dei neutrofili in condizioni di flusso in vitro 9,10. Diverse aziende producono parallele camere di flusso di targa e hanno ciascuno vantaggi e svantaggi. Se fluorescente immagini è necessario, vetro o un polimero otticamente simile deve essere utilizzato. Le cellule endoteliali non crescono bene su vetro. Presentiamo qui un metodo semplice e rapido per l&#39;imaging a contrasto di fase, DIC e fluorescente di trasmigrazione neutrofili con un basso volume di diapositiva canale ibidi fatto di un polimero che supporta l&#39;adesione e rapida crescita di cellule endoteliali e ha qualità ottiche comparabili a vetro. In questo metodo, le cellule endoteliali sono state coltivate e stimolata in μslide ibidi. I neutrofili sono stati introdotti in condizioni di flusso e la trasmigrazione è stata valutata. Imaging a fluorescenza delle giunzioni attivato in tempo reale la determinazione del grado di paracellulare rispettotrasmigrazione transcellulare.

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Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Views.  University of Calgary. Questo articolo descrive prima di una procedura per isolare cellule endoteliali umane da vena ombelicale e poi mostra come utilizzare queste cellule per esaminare la trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Utilizzando un basso volume camera di flusso realizzati da un polimero con le caratteristiche ottiche di vetro, live-cellula imaging a fluorescenza di popolazioni di cellule rare è anche possibile.

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

L&#39;uso di citometria a flusso per valutare lo stato della cromatina in cellule T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L&#39;isolamento e la citometria a flusso Analisi di Human endocervicale Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...