Questo studio è stato supportato da sovvenzioni NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 e R01GM096187.

1. Isolamento globuli rossi del sangue intero <ol><li> Preparare EAS-45 soluzioni. Pesare tutti gli ingredienti dalla tabella I e sciogliere in 100-200ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua per rendere la soluzione 1000ml e aggiustare il pH a 8,0. Filtro e aliquota da 50ml. Congelare a -20 ° C per la conservazione. </li></ol> Nota: Passo 1,2 dovrebbe essere eseguita da un medico addestrato ad esempio come infermiera, con un Institutional Review Board protocollo approvato. <ol start="2"><li> Disegna 3-5ml di sangue dalla vena cubitale mediana in una provetta da 10 ml contenente EDTA e delicatamente mescolare il sangue con EDTA immediatamente e accuratamente per evitare la coagulazione. </li><li> Processo di campione di sangue appena possibile. Tutti i passi seguenti, tranne centrifugazione deve essere effettuato sotto il cofano per mantenere la preparazione sterile. Trasferire il sangue in una provetta da centrifuga da 50 ml, aggiungere 10 ml di HISTOPAQUE freddo e sterile 1077 e centrifugare per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Ripetere due volte. </li><li> Aggiungere 10ml freddo e sterile PBS, centrifugare per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Ripetere 4 volte (totale di 5 volte). </li><li> Lavare con sterili EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) due volte. Negli ultimi globuli rossi spostare il lavaggio in una nuova provetta sterile 15ml. </li><li> Risospendere globuli rossi EAS-45 in10ml. </li></ol> 2. RBC biotinilazione <ol><li> Prendete il tubo con globuli rossi dal punto 1. Rimuovere tutti i surnatante dopo centrifugazione per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Mettere 10μl di GR pellet a ciascuno di fiale diverse e aggiungere corrispondente quantità di soluzione salina in ogni flaconcino (vedere tabella II, ad esempio di preparazione di sei differenti concentrazioni biotinilazione globuli rossi). </li><li> Fai fresca Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluizioni secondo la Tabella II. </li><li> Aggiungere 10μl di tampone borato 0.1M a ogni flacone. </li><li> Aggiungi quantità calcolata di biotina soluzione ad ogni flacone (vedi Tabella II come esempio) e vortice immediatamente. </li><li> Luogo ogni flacone RBCall&#39;interno di un tubo da 50 ml conica e incubare in rotatori per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare ogni flaconcino 3 volte con 800μl di EAS-45 per 2min @ 2000rpm. </li><li> Aggiungere 100μl di EAS-45 per ogni flacone e conservare a 4 ° C. In ogni 1ml della soluzione finale, ora dovrebbe essere ~ 1mln di globuli rossi. </li></ol> 3. Funzionalizzazione della biotina-linked * ligandi su globuli rossi <ol><li> Preparare 2mg/ml soluzione streptavidina secondo le istruzioni del produttore. Soluzione Aliqouted possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Mescolare una pari quantità di globuli rossi a partire dal punto 2.7 (10μl) con la soluzione streptavidina, vortice immediatamente e incubare in rotatori per 30min a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 volte con 500μl di EAS-45 per 2min @ 2000rpm. Aggiungi EAS-45 15μl / 1% BSA per la conservazione. </li><li> Mix pari quantità di globuli rossi a partire dal punto 3.3 (10μl) con la soluzione legante 20μg/ml, vortice immediatamente e incubare in rotatori per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare due volte con 500μl di EAS-45 / 1% di BSA per 2min @ 2000rpm. Aggiungere 15μl di EAS-45 / 1% di BSA per la conservazione. </li></ol> * Se la vostra proteina non ha alcun legame biotina è possibile utilizzare uno dei kit disponibili in commercio per biotinilazione proteine ​​(per esempio, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-biotinilazione Kit) o ​​utilizzare biotinilato anticorpi di cattura come un passo intermedio, come mostrato nel video. 4. Quantificazione delle densità del recettore e ligando <ol><li> Incubare ligando rivestite globuli rossi dal punto 3 e, in un altro flacone, recettore-cuscinetto cellule con concentrazioni di anticorpi monoclonali rispettivi saturando per 30 min a temperatura ambiente. Incubare a separare le cellule flaconcini con irrilevanti isotipo-abbinato anticorpi per il controllo. Se gli anticorpi primari non sono fluorescente, incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorescenza in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare i campioni preparati al punto 4.1 per cytometery flusso con corrispondente fluorescenti calcalibrazione di perline. Calcolare la densità come mostrato in fig. 1. </li></ol> 5. Preparazione per micropipetta e della camera di cellulari <ol><li> Tirare micropipette da tubi capillari utilizzando PN-30 Magnetic Narishige &#39;Puller microelettrodo orizzontale di vetro o Sutter Instruments Micropipetta Puller. </li><li> Usa micromanipolatore con microforge per regolare la punta della micropipetta tirato ad una dimensione desiderata (di solito gli intervalli di diametro richiesto dal 1-5 micron a seconda delle dimensioni delle cellule da utilizzare nello studio). </li><li> Preparare la camera cellula tagliando copertura in vetro Microscopio alle dimensioni desiderate. Tenuta la camera con l&#39;olio minerale da entrambi i lati per evitare l&#39;evaporazione medio di cambiare l&#39;osmolarità durante l&#39;esperimento. </li><li> Aggiungere le cellule recettore e ligando-cuscinetto alla camera. </li></ol> 6. Micropipetta adesione saggio di frequenza <ol><li> Aspirare le cellule interagiscono con pipette rispettivi e uso del computer programmati piezoelectr<html> traduttore ic a guidare l&#39;RBC dentro e fuori del contatto con la cellula altro con superficie di contatto controllata e tempo. Rilevare eventi adesione osservando allungamento RBC sulla separazione delle cellule. </li><li> Ripetere il contatto-ritiro ciclo 50-100 volte per un dato tempo di contatto. Registrare gli eventi osservati adesione con l&#39;aggiunta di &quot;1&quot; per l&#39;adesione o &quot;0&quot; per l&#39;adesione in una colonna del foglio di calcolo Excel. È possibile utilizzare un dispositivo di registrazione, ad esempio, media digitali o videocassetta, per le immagini microscopiche. </li><li> Registrare la frequenza di adesione in funzione del tempo di contatto della curva utilizzando almeno tre coppie di cellule diverse per ogni tempo di contatto per ottenere una media e SEM. </li><li> Registrare la curva non specifico per il controllo tramite globuli rossi rivestiti con leganti irrilevanti (ad esempio BSA) e / o il blocco dei ligandi o recettori utilizzando i loro anticorpi monoclonali specifici blocco funzionale. Frequenza di adesione specifiche in ogni punto il tempo di contatto può essere calcolato con la rimozione della frequenza di adesione aspecifica 1. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 7. Analisi dei dati <ol><li> Montare la frequenza specifica adesione P uno contro dati di contatto tempo t da un modello probabilistico (Equazione 1) che descrive un secondo ordine in avanti e di primo ordine inverso in un unico passaggio interazione tra una singola specie di recettori e una singola specie di ligandi 1 : <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" /> dove K a è la 2D affinità efficacia vincolante, k fuori è la off-rate, m r e m l sono rispettivamente il recettore e ligando densità misurata al punto 4, e A c è l&#39;area di contatto. La curva-fit ha due parametri, A c K a e k off, come A c e K a sono ammassati insieme e chiamato collettivamente come efficace affinità 2D. Il suo prodotto con la bassa velocità è l&#39;effettivo 2D-rate: una </em&gt; c = k su A c K una k x off. La specifica adesione frequenza P a è calcolato per differenza della frazione adesione aspecifica (P aspecifico) dalla totale adesione misurata (P misurata) 1,21: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" /></li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" /> Figura 1 Determinazione del β integrina α L 2 densità sito sui neutrofili. I neutrofili sono stati incubati con 1μg/ml di E-selectina-Ig per 10 minuti in modo che corrisponda alla condizione sperimentale utilizzato nelle figure 3,4 o senza E-selectina-Ig, e poi con le concentrazioni di saturazione (10μg/ml) PE-coniugato contro -CD11a umano monoclonale (clone HI111, vedi Tabella di specifichereagenti e attrezzature) o il mouse IgG1 irrilevante per il controllo, lavato, e analizzati immediatamente. I campioni sono stati continua a leggere BD citometro a flusso LSR con lo standard QuantiBRITE gocce di taratura PE. Pannello A mostra istogrammi di fluorescenza di perline di calibrazione (rosa) insieme a quelli di cellule trattate (colore blu) o non trattati E-selectina-Ig (colore verde). Specifiche CD11a colorazione mAb è mostrato in curva solida e irrilevante isotipo-matched colorazione anticorpo di controllo è mostrato in curva tratteggiata. Cellule trattate con E-selectina-Ig (presenza in tutte le fasi di lavaggio e nel tampone FACS) non ha influenzato la densità CD11a come si vede dal confronto con cellule non trattate. Pannello B mostra il processo di quantificazione densità. Log10 è stato calcolato per l&#39;intensità media fluorescente (FI) di ogni valore di picco di istogrammi di calibrazione quattro perle dal Pannello di A (cerchi rosa) e per il lotto-specifici per molecole di PE tallone (dal produttore). Una regressione lineare di molecole Log10 PE per tallone contro Log10 fluorescriferimento è stata tracciata. Per le cellule trattate E-selectina il Log10 FI (y) i valori pari 3,99 (blu cerchio pieno) e 2.23 (blu cerchio aperto) per specifici mAb e anticorpo di controllo, respectivly. Abbiamo risolto l&#39;equazione lineare per x (i valori sono rappresentati come cerchi verdi e blu sul pannello B) x = Log10 PE / cellulare e, come PE:. MAb rapporto era 1:1, il numero totale di β α L 2 sui neutrofili è stata calcolato come 9587. Densità superficiale è stata calcolata da 43 molecole / 2 micron, utilizzando 8.4μm come il diametro dei neutrofili 22. Densità di ICAM-1 è stata misurata analogamente da cytometery flusso utilizzando PE-anti-CD54 mAb umano, che è pari al 65 mol / micron 2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" /> Figura 2 Micropipetta sistema schemi. Il nostro sistema micropipetta è stato assemblato in casa e si compone di tre sottosistemi: un sottosistema di imaging per consentire di osservare, record e analizzare i movimenti della micropipetta aspirato di cellule, un sottosistema di micromanipolazione permettono di selezionare le celle dalla camera di cella, e un sottosistema di pressione permettono di aspirare le cellule in micropipette. Il pezzo centrale del sottosistema di imaging viene invertito microscopio (Olympus IMT-2 IMT2) con un 100x immersione in olio NA obiettivo 1,25. L&#39;immagine viene inviata a un videoregistratore attraverso un dispositivo coppia carica (CCD) della fotocamera. Un timer video è abbinato al sistema per tenere traccia del tempo. Ogni micropipetta può essere manipolato da una trasmissione meccanica montata sul microscopio e finemente posizionato con un tre assi micromanipolatore idraulico. Manipolatori meccanici da Newport potrebbe essere utilizzato come bene. Uno dei titolari micropipetta è montato su un traduttore piezoelettrico, il conducente del quale è controllato da un computer di LabView codice (disponibile su richiesta) e si traduce segnale attraverso una scheda DAQ attraverso un amplificatore di tensione (in casa) per l&#39;attuatore piezoelettrico. Questo è unllows uno per spostare la pipetta maniera precisa e ripetibile in un ciclo di test di adesione. Il sottosistema di regolazione della pressione viene utilizzato per controllare di aspirazione durante l&#39;esperimento. Una linea idraulica collega il titolare micropipetta ad un serbatoio del liquido. Un posizionatore multa meccanico permette l&#39;altezza del serbatoio in modo preciso manipolato. Micropipette vengono generati utilizzando KIMAX punto di fusione tubi in vetro borosilicato capillari (con diametro esterno di 1,0 ± 0,07 mm e un diametro interno di 0,7 ± 0,07 mm. In primo luogo, il micropipette da tubi capillari sono tirati con PN-30 Magnetic Narishige &#39;Puller microelettrodo orizzontale di vetro (Sutter Instruments Micropipetta Puller è un&#39;altra opzione estrattore). In secondo luogo, il sistema Microforge (costruita in casa) è usato per tagliare il micropipette di apertura dimensione desiderata. modelli commerciali di sistemi di Microforge sono disponibili pure. Per evitare vibrazioni della micropipette durante l&#39;esperimento, il microscOPE, insieme al micromanipolatori, è posto su un tavolo sospensioni pneumatiche. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" /> Figura 3 Esecuzione di frequenza F adesione per i specifici (A) e aspecifici (B) vincolanti a 1s (rosso) e 10s (blu), tempi di contatto misurato da cicli ripetuti test di aderenza tra RBC rivestito con ICAM-1 (A) o Higg (B ) con neutrofili umani che esprimono integrina α β L 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), dove i è l&#39;indice ciclo di prova, X i è uguale a &quot;1&quot; (adesione) o &quot;0&quot; (non adesione). F n (n = 50) è stata utilizzata come la migliore stima per la probabilità di adesione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" /> Figura 4 Cinetica diICAM-1 legame neutrofili β integrina α L 2 ( <img alt="Piazza" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" /> ). Probabilità adesione misurata come indicato nella figura 3, per tre coppie di cellule in ogni tempo di contatto è media e funzione del tempo di contatto. Il mezzo è stato HBSS camera con 1 mM ciascuno di Ca 2 + e Mg 2 +, più 1μg/ml dimerica di E-selectina-Ig di upregulate β L α 2 vincolanti. Per catturare ICAM-1-Ig di globuli rossi, un passaggio intermedio è stato aggiunto al incubare globuli rossi con anticorpo di cattura 10μg/ml (biotinilato di capra anti-umano degli anticorpi Fc, eBioscience) dopo la fase di incubazione streptavidina. Per controllare per non specifico vincolante due condizioni differenti sono stati utilizzati: 1) globuli rossi rivestiti con l&#39;anti-umano-Fc anticorpo di cattura e incubate con IgG umane invece di ICAM-1-Ig (O) e 2) neutrofili legame con i globuli rossi non rivestito con la la cattura degli anticorpi (Δ). 10μg/ml IgG è stato aggiunto al mezzo per ridurre al minimo vincolante di E-Selectina-Ig in soluzione al anticorpo di cattura sulla superficie dei globuli rossi. Legame aspecifico registrato come curva di IgG umane di controllo è stato utilizzato per ottenere una specifica curva di probabilità di adesione ( <img alt="Piazza" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" /> ) Con Eq. 2. Adattamento specifico probabilità curva dell&#39;aderenza con l&#39;eq. 1 (linea continua) ha restituito efficace affinità di legame A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 e k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> MW (g / mol) </th><th> Concentrazione (mM) </th><th> Importo (g) </th></tr><tr><td> Adenina </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-glucosio (destrosio) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio, bibasico (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Preparazione EAS-45 buffer (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg biotina-XHS in 550 ml di DMF </td><td> 0,1 M soluzione biotina </td></tr><tr><td> Diluizione 1:10 di 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0.01M biotina soluzione </td></tr><tr><td> Diluizione 1:100 di 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0.001M biotina soluzione </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Preparazione della soluzione di biotina. <table border="1"><tbody><tr><th> biotina concentrazione finale (mM) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBC pellet magazzino (microlitri) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (microlitri) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> Borato 0.1M tampone (microlitri) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.01M biotina soluzione (microlitri) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3,2 </td></tr><tr><td> 0.001M biotina soluzione (microlitri) </td><td> 0,8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Biotinilazione di globuli rossi.

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J. 96, 268-275 (2009).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain.">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li><li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1:+divalent+ion+effects.">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion.">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per utilizzare con successo l&#39;adesione saggio micropipetta frequenza si dovrebbe considerare diversi passaggi critici. Per prima cosa, assicurarsi di registrare l&#39;interazione specifica per il recettore-ligando sistema di interesse. Misure di controllo non specifici (cfr. fig. 3, 4) garantire la specificità. Idealmente, le probabilità di adesione non specifica deve essere inferiore a 0,05 per durate di tempo tutti i contatti e di avere una significativa differenza tra le probabilità di adesione specifici e non specifici per ogni punto del tempo. Diversi metodi potrebbero essere utilizzati per accoppiare i ligandi alla superficie globuli rossi. E &#39;stato dimostrato che il cloruro di cromo metodo di accoppiamento 17 ha dato un maggiore livello di legame aspecifico di biotina-streptavidina accoppiamento. In secondo luogo, una probabilità di adesione per l&#39;interazione specifica dovrebbe essere nella gamma media. Questo obbligo può essere adempiuto variando la densità dei recettori e ligandi (o ligandi solo su globuli rossi se recettori sono espressi costitutivamente in cellules la densità che è difficile da cambiare). A tal fine, quando si verifica un nuovo sistema con sconosciute recettore-ligando affinità di legame, preparare una serie di RBC biotinilato (vedi Tabella III come esempio) per testare una varietà di densità di ligando. Allo steady-state probabilità di adesione non deve essere superiore a 0,8 in media come cellula-cellula recettore variazione di densità di solito porta il livello di adesione di alcune cellule a 1 se la densità ligando media è troppo alta. Durante il test iniziale per la specificità, se alcune cellule hanno livelli di adesione di 0 o 1, la densità ligando deve essere regolata. Misure di controllo non specifico di solito seguono le misure specifiche e qui si vorrebbe avere probabilità di adesione il più vicino possibile allo zero. In terzo luogo, trovare l&#39;intervallo corretto per i tempi di contatto. Se il tempo di contatto è abbastanza lungo l&#39;exp (- k off t) termine Eq. 1 va a zero e l&#39;affinità efficace 2D può essere calcolata dal livello plateaudella curva di adesione 1: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq3.jpg" /> Il tasso di off-k determina la fase di transizione o la rapidità con la curva dell&#39;aderenza raggiunge un livello di plateau. Per stimare il tasso di off-richiede misure di precisione diversi punti ad un livello di plateau e punti abbastanza tempo nella fase di transizione. Contabilità per le tre fasi critiche di cui sopra uno otterrà curve legame simile a fig. 4. Il compito restante è quello di utilizzare un recettore-ligando modello di associazione cinetica di interpretare la curva misurata sperimentalmente vincolanti e per la stima dei parametri cinetici 2D dal raccordo la predizione del modello ai dati. Va notato che la Eq. 1 rappresenta un semplice modello di secondo ordine in avanti, di primo ordine inverso in un unico passaggio, cinetica reversibili tra un singolo recettore-ligando specie 1. Processi cinetici più complessi sono stati descritti, compresi °casi e di doppio recettore-ligando specie 3,4, a due stadi vincolanti senza 14 o con 19 interazioni trimolecular, l&#39;adesione e la cinetica limitata dalla formazione del sito attivo al posto del legame cinetica 10. In questi casi, i modelli matematici più coinvolti sono tenuti a raccontare la probabilità di adesione in funzione del tempo la curva di contatto e il recettore-ligando cinetica vincolanti. L&#39;interesse costante nella cinetica di interazione recettore-ligando deriva dall&#39;ipotesi fondamentale che i parametri di cinetica hanno un ruolo nel determinare gli eventi a valle di segnalazione all&#39;interno della cellula. Il test di adesione micropipetta frequenza qui presentato è uno dei metodi che permettono pochissime misure in situ delle due dimensioni (2D) cinetica di legame. Bidimensionale significa che entrambi i recettori e ligandi sono sulla superficie delle cellule, come naturalmente avviene in molte interazioni cellula-cellula all&#39;interno dell&#39;organismo. Le costanti 2D velocità cinetiche del recettore-lige vincolante fornire informazioni per quanto rapidamente le cellule si legano gli uni agli altri o alla matrice extracellulare, quanto tempo resta vincolato, e quanti legami si formerà. In confronto, nel Surface Plasmon Resonance (SPR) Metodo 23 una delle molecole che interagiscono sia in fase fluida, quindi chiamato tridimensionale (3D) vincolanti. Poiché entrambe le molecole che interagiscono sono purificati ed isolati dall&#39;ambiente cellulare, i parametri cinetici ottenuti nella misurazione 3D potrebbe essere drasticamente diversi da quelli ottenuti nelle misurazioni 2D anche per lo stesso recettore-ligando coppia 17. Il metodo di analisi di frequenza adesione cinetica 2D a vivere membrana cellulare e fornisce quindi l&#39;occasione per uno di analizzare la normativa biofisiche e biochimiche dell&#39;ambiente cellulare. Questi includono la membrana microtopology 5, ancora membrana 2, orientamento molecolare e lunghezza 6, 9 e rigidità vettore curvatura 20, forza impingement 20, e modulatori del citoscheletro e di organizzazione della membrana in cui le molecole interagiscono risiedono 15,17. Perché cross-giunzionale recettore-ligando interazione richiede il contatto fisico diretto tra due cellule e dei risultati in collegamento fisico tra due cellule, la cinetica di reazione chimica di interazione molecolare può essere analizzato da un saggio meccanico che mette in contatto le cellule e rileva vincolante per l&#39;effetto della forza. Anche se abbiamo esemplificato il saggio di frequenza adesione utilizzando una micropipetta-aspirato RBC come un sensore di adesione, le tecniche di altra forza può essere utilizzata, tra cui la microscopia a forza atomica 24, biomembrane forza sonda 8,17, pinzette ottiche 25, e la micropipetta integrato e cantilever 26. Altri test meccanicamente basata 2D sono stati sviluppati. Questi includono l&#39;analisi termica fluttuazione 8, centrifugazionezione saggio 27,28, rosette saggio 29, e la camera di test del flusso 30,31. La limitazione del dosaggio frequenza adesione è la natura lenta e alta intensità di lavoro del test a causa dei cicli ripetuti di serie con una singola coppia di cellule testato un contatto alla volta. Diventa difficile per il recettore-ligando interazioni con lenti off-tariffe perché i tempi di contatto lunghi sarebbe necessaria per la curva vincolante per raggiungere steady-state, rendendo l&#39;esperimento inhibitively lungo. Il trasduttore di forza costruita da una micropipetta aspirato RBC è in grado di rilevare piconewton livello di forze, che è un ordine di grandezza inferiore a quello tipico di una forza non covalenti recettore-ligando legame 1,32. Tuttavia, recettore-ligando dissociazione potrebbe verificarsi anche a zero forze. Ogni adesione debole che va porta inosservati ad una sottovalutazione del l&#39;affinità di legame e il tasso di 1. Tha frequenza metodo adesione presuppone che ogni test di adesione è identico e indipendente dagli altri. Tale requisito potrebbe essere violata come è stato dimostrato per alcuni sistemi 33, dove l&#39;adesione corrente aumentata o diminuita la probabilità di adesione prossima. Il codice Matlab per verificare se il requisito è soddisfatto per la sequenza di eventi ha registrato l&#39;adesione è disponibile su richiesta.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Catalogo # </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Diluire a 1x con acqua deionizzata prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> RBC isolamento </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HISTOPAQUE 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> RBC isolamento </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 preparazione </td></tr><tr><td> D-glucosio (destrosio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 preparazione </td></tr><tr><td> D-mannitolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 preparazione </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 preparazione </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio, bibasico (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 preparazione </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 preparazione </td></tr><tr><td> Biotina-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> RBC biotinilazione </td></tr><tr><td> Dimetilformammide (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> RBC biotinilazione </td></tr><tr><td> Borato Buffer (0,1 M) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 11455-90 </td><td> RBC biotinilazione </td></tr><tr><td> Streptavidina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligand funzionalizzazione </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligand funzionalizzazione </td></tr><tr><td> Quantibrite PE Perline </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Densità di quantificazione </td></tr><tr><td> Citometro a flusso </td><td> BD Immunocytometry Sistemi </td><td> BD LSR II </td><td> Densità di quanidentificazione </td></tr><tr><td> Tubo capillare 0,7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc. </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipetta tirando </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Camera di montaggio </td></tr><tr><td> Microscopio copertura in vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-G </td><td> Camera di montaggio </td></tr><tr><td> PE-α umano CD11a Clone HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reagente per Fig.1 </td></tr><tr><td> PE anti-CD54 umano </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reagente per Fig.1 </td></tr><tr><td> IgG1 Isotipo controllo PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reagente per Fig.1 </td></tr><tr><td> micromanipolatore idraulico </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipetta sistema </td></tr><tr><td> Manipolatore meccanico </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipetta sistema </td></tr><tr><td> traduttore piezoelettrico </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipetta sistema </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Versione 8.6 </td><td> Micropipetta sistema </td></tr><tr><td> Scheda DAQ </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipetta sistema </td></tr><tr><td> Tavolo ottico </td><td> Cinetica Sistemi </td><td> Serie 5200 </td><td> Micropipetta sistema </td></tr></tbody></table>

adhesion frequency assay for in situ kinetics analysis of cross-junctional molecular interactions at the cell-cell interface

Il test di adesione micropipetta è stato sviluppato nel 1998 per misurare bidimensionali (2D), recettore-ligando cinetica di legame 1. Il test utilizza un globulo rosso umano (RBC) come sensore di adesione e delle cellule che si presentano per una delle molecole interagenti. Impiega micromanipolazione per portare il RBC in contatto con un&#39;altra cellula che esprime l&#39;altra molecola che interagisce con zona controllata con precisione e tempo per consentire la formazione di legame. L&#39;evento viene rilevato come l&#39;adesione allungamento RBC su tirando le due celle di distanza. Controllando la densità dei ligandi immobilizzato sulla superficie dei globuli rossi, la probabilità di adesione è tenuto in mid-range compreso tra 0 e 1. La probabilità di adesione è stimata dalla frequenza di eventi adesione in una sequenza di cicli ripetuti contatti tra le due cellule per un dato tempo di contatto. Variando il tempo di contatto genera una curva vincolante. Montaggio di un modello probabilistico per recettore-ligando cinetica di reazione 1 al legamecurva restituisce l&#39;affinità 2D e off-rate. Il test è stato validato mediante interazioni dei recettori Fcy con IgG Fc 1-6, selectine con leganti glicoconiugato 6-9, integrine con leganti 10-13, homotypical vincolante caderina 14, recettore delle cellule T e corecettore con peptide-grandi complessi di istocompatibilità 15 - 19. Il metodo è stato utilizzato per quantificare regolamenti della cinetica 2D da fattori biofisici, come ad esempio la membrana microtopology 5, della membrana di ancoraggio 2, orientamento molecolare e lunghezza 6, rigidità vettore 9, curvatura 20, e la forza impingement 20, così come i fattori biochimici, come modulatori del microambiente citoscheletro e membrana in cui le molecole interagiscono risiedono e l&#39;organizzazione della superficie di queste molecole 15,17,19. Il metodo è stato utilizzato anche to studiare il legame simultaneo di doppio recettore-ligando specie 3,4, e le interazioni trimolecular 19 con un modello modificato 21. Il principale vantaggio del metodo è che permette lo studio dei recettori di membrana nel loro ambiente nativo. I risultati potrebbero essere molto diversi da quelli ottenuti con recettori purificati 17. Consente inoltre lo studio del recettore-ligando interazioni in un lasso di tempo inferiori al secondo con risoluzione temporale ben oltre i tipici metodi biochimici. Per illustrare l&#39;adesione metodo micropipetta frequenza, ci mostrano la misurazione cinetica della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) funzionalizzati su globuli rossi legame β integrina α L 2 sui neutrofili con dimerica E-selectina nella soluzione per attivare α β L 2.

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

14.9K Views.  Georgia Institute of Technology. Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

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Bioingegneria

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Colmare il Bio-Electronic Interface con Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinazione del tasso di trasporto di xenobiotici e nanomateriali attraverso la placenta con il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Umano Modello perfusione placentare

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Sviluppo di amelogenina-chitosano Hydrogel per<em&gt; In Vitro</em&gt; Smalto ricrescita con una interfaccia Dense

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Analisi meccanica dinamica ambientale per predire il comportamento di rammollimento di impianti neurali

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarray di bioparticelle per l'analisi chemiotattica e molecolare dello sciame neutrofilo umano in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...