Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 y R01GM096187.

1. Los glóbulos rojos aislados de la sangre entera <ol><li> Prepare EAS-45 soluciones. Sopesar todos los ingredientes de la Tabla I y se disuelven en 100-200ml de agua DI. Agregar agua hasta 1000 ml solución y ajustar el pH a 8.0. Filtro y alícuotas de 50 ml. Congelar a -20 ° C para su almacenamiento. </li></ol> Nota: El paso 1.2 debe ser realizada por un técnico profesional de la medicina como una enfermera, con una Junta de Revisión Institucional protocolo aprobado. <ol start="2"><li> Dibuja 3 de 5 ml de sangre de la vena cubital mediana en un tubo de 10 ml que contiene EDTA y mezcle suavemente la sangre con EDTA inmediatamente ya fondo para evitar la coagulación. </li><li> Proceso de muestra de sangre tan pronto como sea posible. Todos los pasos siguientes, excepto la centrifugación se debe hacer bajo el capó para mantener la preparación estéril. Transferencia de la sangre a un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 10 ml de Histopaque frío y estéril 1077 y centrifugar durante 5 min @ 1000 rpm, 4 º C. Repita dos veces. </li><li> Añadir 10ml fría y estéril PBS, durante 5 minutos @ 1000 rpm, 4 º C. Eliminar el sobrenadante. Repite 4 veces (un total de 5 veces). </li><li> Lavar con agua estéril EAS-45 (5 min @ 1000 rpm, 4 ° C) dos veces. Durante los últimos glóbulos rojos se mueven de lavado a un nuevo tubo de 15 ml estéril. </li><li> Resuspender los eritrocitos in10ml EAS-45. </li></ol> 2. Los glóbulos rojos biotinilación <ol><li> Tome el tubo con los glóbulos rojos en el paso 1. Eliminar todas las sobrenadante tras centrifugación durante 5 min @ 1000 rpm, 4 º C. Ponga 10μl de los glóbulos rojos de pellets a cada uno de varios viales y agregue la cantidad correspondiente de PBS a cada vial (ver Tabla II, por ejemplo, de la preparación de seis concentraciones diferentes biotinilación glóbulos rojos). </li><li> Hacer nuevas Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluciones de acuerdo a la Tabla II. </li><li> Añadir 10μl de tampón borato 0,1 M a cada vial. </li><li> Agregue la cantidad calculada de la solución de biotina a cada vial (ver Tabla II como ejemplo) y agitar inmediatamente. </li><li> Coloque cada vial RBCdentro de un tubo cónico de 50 ml y se incuba durante 30 minutos en rotador a temperatura ambiente. </li><li> Lavar el vial 3 veces con 800μl de EAS-45 @ 2000 rpm durante 2 minutos. </li><li> Agregar 100μl de EAS-45 a cada vial y almacenar a 4 ° C. En cada 1μl de la solución final debería ser ahora ~ 1mln de los glóbulos rojos. </li></ol> 3. Funcionalización de la * biotina ligada a ligandos en los glóbulos rojos <ol><li> Prepare una solución de estreptavidina 2mg/ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aliqouted solución puede conservarse a -20 ° C. </li><li> Mezcle la misma cantidad de glóbulos rojos en el paso 2.7 (10μl) con una solución de estreptavidina, vortex e incubar inmediatamente en el rotador de 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 veces con 500μl de EAS-45 @ 2000 rpm durante 2 minutos. Añadir 15μl EAS-45 / 1% de BSA para el almacenamiento. </li><li> Mezcle la misma cantidad de glóbulos rojos en el paso 3.3 (10μl) con una solución de ligando 20μg/ml, vortex e incubar inmediatamente en el rotador de 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar dos veces con 500μl de EAS-45 / 1% BSA durante 2 minutos @ 2000rpm. Añadir 15μl de EAS-45 / 1% de BSA para el almacenamiento. </li></ol> * Si la proteína no tiene ningún vínculo con biotina puede utilizar uno de los kits disponibles en el mercado de biotinilación de proteínas (por ejemplo, Thermo Scientific 21955 # EZ-Link Micro-NHS-peg4 biotinilación Kit) o ​​el uso de anticuerpos con biotina captura como un paso intermedio, como se muestra en el video. 4. La cuantificación de la densidad de receptores y ligandos <ol><li> Incubar ligando recubierto de glóbulos rojos en el paso 3 y, en otro vial, teniendo los receptores de las células con concentraciones de saturación de mAbs respectivos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar en las células de viales separados de irrelevante isotipo de anticuerpos para el control. Si los anticuerpos primarios no están marcados con fluorescencia, se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Analizar las muestras preparadas en el paso 4.1 por cytometery flujo con sus correspondientes cal fluorescentesibration cuentas. Calcular las densidades, como se muestra en la fig. 1. </li></ol> 5. Preparación para la micropipeta y la cámara de celular <ol><li> Tire de micropipetas de tubos capilares con PN-30 Extractor magnético Narishige &#39;microelectrodos de vidrio horizontal o Sutter Micropipeta Instrumentos de extractores. </li><li> Use micromanipulador con microforge para ajustar la punta de la micropipeta tiró al tamaño deseado (por lo general los rangos de diámetro requerido de 1-5μm según el tamaño de las células para ser utilizadas en el estudio). </li><li> Prepare la cámara de la célula mediante la reducción de la cubierta de vidrio para microscopio con el tamaño deseado. Sellar la cámara utilizando el aceite mineral de ambas partes para evitar la evaporación del medio para cambiar la osmolaridad durante el experimento. </li><li> Añadir las células del receptor-ligando y teniendo a la cámara. </li></ol> 6. Adherencia micropipeta frecuencia de ensayo <ol><li> Aspirar las células interactuando por pipetas respectivos y el uso de computadoras programadas piezoelectr<html> Traductor IC para conducir los glóbulos rojos dentro y fuera de contacto con la célula con otra área de contacto controlado y tiempo. Detectar eventos de adhesión mediante la observación de la elongación de glóbulos rojos en caso de separación de células. </li><li> Repita el ciclo de contacto-retracción 50-100 veces por un tiempo de contacto determinado. Registrar los eventos observados adhesión mediante la adición de &quot;1&quot; para la adhesión o &quot;0&quot; para no adherencia en una columna de hoja de cálculo Excel. Usted puede usar un dispositivo de grabación, por ejemplo, medios digitales o de video, las imágenes microscópicas. </li><li> Registro de la frecuencia de adherencia en relación con la curva de tiempo de contacto con al menos tres pares de células diferentes para cada tiempo de contacto para obtener una media y SEM. </li><li> Registro de la curva de unión no específica para el control mediante el uso de los glóbulos rojos recubiertos con ligandos irrelevantes (por ejemplo, BSA) y / o el bloqueo de los ligandos o receptores con sus AcMo específicos bloqueo funcional. Frecuencia de adhesión específicas en cada punto de tiempo de contacto se puede calcular mediante la eliminación de la frecuencia de adherencia no específica 1. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 7. Análisis de datos <ol><li> Ajustar la frecuencia de adhesión específicas P a los datos de contacto en comparación con el tiempo t por un modelo probabilístico (Ecuación 1) que describe una segunda orden de avance y de primer orden inverso, de un solo paso la interacción entre una especie y de los receptores de una sola especie de ligandos 1 : <img alt="La ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" /> donde K es una afinidad de unión del 2D efectiva, k es el de fuera de ritmo, m r e l m son los receptores respectivos y la densidad de ligando medido en el paso 4, y A c es el área de contacto. La curva de ajuste tiene dos parámetros, A c K a y de k, como una C y una K se agrupan y llamados colectivamente como la afinidad 2D eficaz. Su producto con el off-rate es la efectiva 2D en clase: A </em&gt; c = k en A c K a K x fuera. La adhesión de frecuencia específica P a se calcula mediante la resta de la fracción de la adhesión no específica (P inespecífica) a partir de la adhesión total medido (P medido) 1,21: <img alt="La ecuación 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" /></li></ol> 8. Los resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" /> Figura 1 Determinación de la integrina α β L 2 densidad de sitios en los neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron primero con 1μg/ml de E-selectina-Ig de 10 minutos para que coincida con las condiciones experimentales utilizadas en las figuras 3,4 o sin la E-selectina-Ig, y luego, con concentraciones de saturación (10μg/ml) de PE-conjugado anti -CD11a humanos MAB (clon HI111, consulte la Tabla de determinadosreactivos y equipos) o ratón IgG1 irrelevante para el control, se lavan, y se analizó inmediatamente. Las muestras fueron leídas en el citómetro de flujo BD LSR con el estándar de bolas de calibración QuantiBRITE PE. El panel A muestra los histogramas de fluorescencia de bolas de calibración (rosa), junto con los de E-selectina-Ig células tratadas (color azul) o sin tratamiento (color verde). Específicas CD11a tinción AcM se muestra en las curvas sólidas e irrelevante tinción isotipo del anticuerpo de control se muestra en las curvas de puntos. Las células tratadas con E-selectina-Ig (presencia en todas las etapas de lavado y en tampón FACS) no afectó la densidad de CD11a como se ve desde la comparación con las células no tratadas. El panel B muestra el proceso de cuantificación de la densidad. Log10 se ha calculado para la media de intensidad de fluorescencia (FI) de cada valor máximo de cuatro bolas de calibración de los histogramas de Grupo A (círculos de color rosa) y por la gran cantidad de moléculas específicas-PE por bolas (del fabricante). Una regresión lineal de moléculas de Log10 PE por bolas contra Log10 fluoresccia se trazó. Por E-selectina células tratadas la Log10 FI (y) los valores de la igualdad de 3,99 (círculo de color azul) y 2,23 (círculo azul abierto) para el AcMo específico y el anticuerpo control, respectivly. Hemos resuelto la ecuación lineal de x (los valores se representan como círculos de color verde y azul en el panel B) x = Log10 PE / celular y, como PE:. AcM relación fue de 1:1, el número total de α β 2 L de neutrófilos fue calcula como 9587. Densidad de la superficie se calculó en 43 moléculas / m 2, con 8.4μm como el diámetro de neutrófilos 22. Densidad de ICAM-1 se midió de manera similar por cytometery de flujo utilizando PE-anti-CD54 humano MAB, lo que equivalía a 65 mol / m 2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" /> Figura 2 Micropipeta los diagramas del sistema. Nuestro sistema de micropipeta se reunió en la casa y se compone de tres subsistemas: el subsistema de formación de imágenes para permitir que uno observa, record y analizar los movimientos de la célula micropipeta de aspiración, un subsistema de micromanipulación para permitir una para seleccionar las celdas de la cámara de celular, y un subsistema de la presión para permitir que uno de aspirar las células en las micropipetas. La pieza central del subsistema de imagen tiene su microscopio invertido (Olympus IMT-2 IMT2), con una inmersión en aceite de 100x objetivo 1,25 NA. La imagen se envía a una grabadora de vídeo a través de un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD). Un contador de tiempo de video se acopla al sistema para mantener la noción del tiempo. Cada micropipeta puede ser manipulado por un accionamiento mecánico montado en el microscopio y finalmente coloca con un micromanipulador hidráulico de tres ejes. Manipuladores mecánicos de Newport podría ser utilizado también. Uno de los titulares de micropipeta se monta en un traductor piezoeléctrico, el conductor de la cual es controlada por un código de computadora LabView (bajo petición) y la traduce en señales a través de una tarjeta DAQ a través de un amplificador de voltaje (en casa) en el actuador piezoeléctrico. Este es unllows uno para mover la pipeta de precisión y repetible en un ciclo de prueba de adhesión. El subsistema de regulación de presión se utiliza para el control de aspiración durante el experimento. Una tubería hidráulica se conecta el titular micropipeta a un depósito de líquido. Un posicionador de mecánica fina permite que la altura del embalse que precisamente manipulada. Micropipetas se generan con Kimax punto de fusión tubos de vidrio de borosilicato capilar (con diámetro exterior de 1,0 ± 0,07 mm y un diámetro interior de 0,7 ± 0,07 mm. En primer lugar, las micropipetas de tubos capilares se extraen utilizando PN-30 Extractor magnético Narishige &#39;microelectrodos de vidrio Horizontal (Sutter Instrumentos Micropipeta Extractor es otra opción de asistente de cámara). Segundo sistema, Microforge (construido en la casa) se utiliza para cortar las micropipetas para la apertura de tamaño deseado. Los modelos comerciales de los sistemas de Microforge están disponibles también. Para evitar la vibración de las micropipetas durante el experimento, el microscope, junto con el micromanipulador, se coloca en una mesa de suspensión de aire. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" /> Figura 3 Ejecución F adhesión frecuencia i específicos (A) e inespecíficos (B) que se une a 1s (rojo) y 10 (azul) mide los tiempos de contacto de los ciclos repetidos de adhesión de prueba entre los glóbulos rojos recubiertos con ICAM-1 (A) o Higg (B ) con los neutrófilos humanos que expresan la integrina α β L 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), donde i es el índice del ciclo de prueba, X i es igual a &quot;1&quot; (adherencia) o &quot;0&quot; (no adherencia). F n (n = 50) fue utilizado como la mejor estimación de la probabilidad de adherencia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" /> Figura 4 Cinética deICAM-1 a la integrina α β neutrófilos L 2 ( <img alt="Plaza" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" /> ). Probabilidad de adherencia medido como se muestra en la Figura 3 para tres pares de células en cada tiempo de contacto promedio es y representa frente al tiempo de contacto. El medio de la cámara se HBSS con 1 mM de cada uno de Ca 2 + y Mg 2 +, además de 1μg/ml dimérica E-selectina-Ig para regular al alza β α L 2 vinculante. Para la captura de ICAM-1-Ig en los glóbulos rojos, un paso intermedio se añadió para la incubación de los glóbulos rojos con anticuerpos de captura 10μg/ml (biotinilado de cabra anti-Fc de anticuerpos humanos, eBioscience) después de la etapa de incubación estreptavidina. Para controlar la unión inespecífica dos condiciones se utilizaron diferentes: 1) los glóbulos rojos recubiertos con el anticuerpo de captura anti-humano-Fc y se incubaron con IgG humana en lugar de ICAM-1-Ig (O) y 2) los neutrófilos unión a los glóbulos rojos no cubiertas con la captura de anticuerpos (Δ). 10μg/ml IgG humana fue introducido en el medio para minimizar la unión de la E-Selectina-Ig en la solución a la captura de anticuerpos en la superficie de glóbulos rojos. La unión no específica registrada como la IgG humana curva de control se utilizó para obtener una curva de adherencia probabilidad específica (en <img alt="Plaza" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" /> ) Usando la ecuación. 2. Montaje de adhesión específicas curva de probabilidad con la ecuación. 1 (línea continua) volvió afinidad de unión efectiva una K c a = 1,4 • 10 -4 μm4 y k off = 0.3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> MW (g / mol) </th><th> Concentración (mM) </th><th> Cantidad (g) </th></tr><tr><td> Adenina </td><td> 135.13 </td><td> 2 </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> D-glucosa (dextrosa) </td><td> 180.16 </td><td> 110 </td><td> 19.82 </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> 182.17 </td><td> 55 </td><td> 10.02 </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio (NaCl) </td><td> 58.44 </td><td>50 </td><td> 2.92 </td></tr><tr><td> El fosfato de sodio, dibásico (Na HPO ) </td><td> 141.95 </td><td> 20 </td><td> 2.84 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 146.15 </td><td> 10 </td><td> 1.46 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Preparación EAS-45 buffer (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg de biotina-XHS en 550 l de DMF </td><td> 0,1 M biotina solución </td></tr><tr><td> Dilución de 1:10 de la biotina 0,1 w / DMF </td><td> 0,01 M biotina solución </td></tr><tr><td> Dilución 1:100 de 0,1 biotina w / DMF </td><td> 0,001 M biotina solución </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Preparación de la solución de biotina. <table border="1"><tbody><tr><th> biotina concentración final (M) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> Los glóbulos rojos de pellets de valores (l) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (l) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M tampón de borato (l) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 M biotina solución (l) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> 0,001 M biotina solución (l) </td><td> 0.8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Biotinilación de los glóbulos rojos.

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J. 77, 3394-3406 (1999).</li><li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+modeling+of+rosette+formation.">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li><li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge.">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li><li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear.">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li><li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments.">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li><li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion.">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Para utilizar con éxito la adhesión micropipeta ensayo de frecuencia se deben considerar varios pasos críticos. En primer lugar, asegúrese de registrar la interacción específica para el sistema de receptor-ligando de interés. Medidas no específicas de control (ver fig. 3, 4) garantizar la especificidad. Idealmente, las probabilidades no específicos de adhesión debe ser inferior a 0,05 para todas las duraciones de tiempo de contacto y tener una diferencia significativa entre las probabilidades de adhesión específicas y no específicas para cada momento. Diferentes métodos podrían ser utilizados para acoplar los ligandos a la superficie los glóbulos rojos. Se ha demostrado que el cloruro de cromo método de acoplamiento 17 dio un mayor nivel de la unión no específica de biotina-estreptavidina acoplamiento. En segundo lugar, una probabilidad de adherencia para la interacción específica debe estar en el rango medio. Este requisito puede cumplirse mediante la variación de la densidad de receptores y ligandos (o ligandos sólo en los glóbulos rojos si los receptores se expresan constitutivamente en célulass la densidad de los cuales es difícil de cambiar). Para ello, cuando se prueba un nuevo sistema con desconocidos ligando-receptor afinidad de unión, preparar una serie de glóbulos rojos con biotina (véase la Tabla III como ejemplo) para probar una variedad de densidades de ligando. La probabilidad de adherencia en estado estable no debe ser superior a 0,8 en promedio, como la célula a célula del receptor de variación de la densidad por lo general trae el nivel de adhesión de algunas células a 1 si la densidad media ligando es demasiado alto. Durante las pruebas iniciales de la especificidad, si algunas células tienen niveles de adhesión de 0 o 1, la densidad de ligando necesita ser ajustado. Medidas de control no específicos suelen seguir las medidas específicas y aquí a uno le gustaría tener la probabilidad de adherencia lo más cerca posible a cero. En tercer lugar, encontrar el intervalo correcto de los tiempos de contacto. Si el tiempo de contacto es suficiente la exp (- k fuera t) término de la ecuación. Uno llega a cero y la afinidad 2D efectiva puede ser calculada a partir del nivel de la mesetade la curva de adherencia 1: <img alt="La ecuación 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq3.jpg" /> El k fuera de descuento sobre la tarifa que determina la fase de transición o qué tan rápido la curva de adherencia llega a un nivel de meseta. Para estimar la tasa fuera de la precisión requiere mediciones de varios puntos a un nivel de meseta, así como los puntos de tiempo suficiente en la fase de transición. Contabilización de los tres pasos críticos descritos anteriormente se obtendrán curvas de unión similar a la figura. 4. La tarea pendiente es utilizar un modelo de receptor-ligando cinética de unión de interpretar la curva de medidas experimentalmente vinculantes y de estimación de parámetros cinéticos 2D de ajuste del modelo de predicción a los datos. Cabe señalar que la ecuación. 1 representa un modelo más simple de segundo orden hacia adelante, de primer orden inverso, de un solo paso, la cinética reversible entre un único ligando del receptor de las especies 1. Los procesos cinéticos más complejos se han descrito, incluso ºlos casos de doble e ligando del receptor de la misma especie 3,4, en dos etapas obligatorias sin 14 o con 19 interacciones trimolecular, y la cinética de una adherencia limitada por la formación del sitio activo en lugar de bonos cinética 10. En estos casos, los modelos matemáticos más involucrados están obligados a relacionar la probabilidad de adhesión frente a la curva de tiempo de contacto y la cinética de ligando de unión al receptor. El interés sostenido en la cinética de la interacción receptor-ligando se deriva de la hipótesis fundamental de que los parámetros de la cinética de desempeñar un papel en la determinación de los eventos de señalización hacia abajo dentro de la célula. La adhesión micropipeta ensayo frecuencia se presenta aquí es uno de los pocos métodos que permiten realizar mediciones in situ de las dos dimensiones (2D) cinética de unión. Dos dimensiones significa que los dos receptores y ligandos en la superficie celular, como ocurre naturalmente en muchas interacciones célula-célula en el interior del organismo. Las constantes cinéticas 2D de los receptores de LIGy obligatorio proporcionar información para la rapidez con que las células se unen entre sí o con la matriz extracelular, el tiempo que permanecen vinculados, y cómo muchos bonos se forma. En comparación, en la resonancia de plasmones superficiales (SPR) método 23 una de las moléculas que interactúan en la fase líquida, por lo que llamó tres dimensiones (3D) de la unión. Debido a que tanto las moléculas que interactúan, son purificadas y aisladas del ambiente celular, los parámetros cinéticos obtenidos en la medición 3D podría ser drásticamente diferentes de los obtenidos en las mediciones en 2D incluso para el mismo receptor-ligando par 17. El método de análisis de frecuencia de adhesión cinética 2D sobre la vida membrana celular y por lo tanto ofrece una oportunidad para que una de analizar las regulaciones biofísicas y bioquímicas del medio ambiente celular. Estos incluyen la membrana microtopology 5, anclaje de membrana 2, la orientación molecular y la longitud de 6, 9 y rigidez portador Curvatura 20, la fuerza de choque 20, y moduladores de la organización del citoesqueleto y la membrana donde las moléculas interactúan residen 15,17. Debido a la unión cruzada del receptor-ligando interacción requiere contacto físico directo entre dos células y los resultados en la vinculación física entre dos células, la cinética de la reacción química de la interacción molecular puede ser analizada mediante un ensayo mecánico que pone en contacto las células y detecta por el efecto vinculante de la fuerza. A pesar de que ejemplifica el ensayo de adherencia con una frecuencia de RBC micropipeta de aspiración como un sensor de adhesión, otras técnicas de la fuerza se puede utilizar, incluyendo microscopía de fuerza atómica 24, biomembrana fuerza sonda 8,17, 25 pinzas ópticas, y la micropipeta integrado y en voladizo 26. Otros ensayos mecánicos en 2D basado en se han desarrollado. Estos incluyen el ensayo de fluctuación térmica 8 de centrifugaciónción del ensayo 27,28, rosetas ensayo de 29, y el ensayo de cámara de flujo 30,31. La limitación de la frecuencia de ensayo de adherencia es la lentitud y mucha mano de obra de la prueba debido a los repetidos ciclos de serie con un solo par de células de la prueba un contacto a la vez. Se hace difícil para las interacciones ligando-receptor con lento de las tasas por largos tiempos de contacto que se requeriría para la curva de unión para alcanzar el estado estacionario, por lo que el experimento inhibitively largo. El transductor de fuerza construida por un RBC micropipeta de aspiración es capaz de detectar el nivel de picoNewton las fuerzas, que es un orden de magnitud menor que la resistencia típica de un covalente ligando-receptor de bonos 1,32. Sin embargo, ligando-receptor disociación puede ocurrir incluso en el cero fuerzas. Cualquier débil adhesión que se lleva sin ser detectado a una subestimación de la afinidad de unión y en la tarifa 1. Tque el método de adhesión frecuencia se supone que cada prueba de adherencia es idéntica e independiente de los demás. Este requisito puede ser violada como se ha demostrado en algunos sistemas de 33 años, donde la adhesión actual de aumento o disminución de la probabilidad de que la adhesión al lado. El código de Matlab para comprobar si se cumple el requisito de la secuencia de los acontecimientos registrados adhesión está disponible bajo petición.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Catálogo # </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Diluir a 1X con agua desionizada antes de su uso </td></tr><tr><td> Vacutainer con EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Los glóbulos rojos de aislamiento </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Los glóbulos rojos de aislamiento </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 preparación </td></tr><tr><td> D-glucosa (dextrosa) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 preparación </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 preparación </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 preparación </td></tr><tr><td> El fosfato de sodio, dibásico (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 preparación </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 preparación </td></tr><tr><td> Biotina-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> Los glóbulos rojos biotinilación </td></tr><tr><td> Dimetilformamida (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> Los glóbulos rojos biotinilación </td></tr><tr><td> Tampón de borato (0,1 M) </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 11455-90 </td><td> Los glóbulos rojos biotinilación </td></tr><tr><td> Estreptavidina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligando funcionalización </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligando funcionalización </td></tr><tr><td> Quantibrite PE Cuentas </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Densidad de cuantificación </td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD Immunocytometry Sistemas </td><td> BD LSR II </td><td> Densidad quancación </td></tr><tr><td> Tubo Capilar 0.7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc. </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipeta tirando </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Cámara de la Asamblea </td></tr><tr><td> Tapa de vidrio para microscopio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 a 544-G </td><td> Cámara de la Asamblea </td></tr><tr><td> PE-α humana CD11a Clon HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reactivo para la figura 1 </td></tr><tr><td> PE anti-CD54 humano </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reactivo para la figura 1 </td></tr><tr><td> Mouse IgG1 control de isotipo PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reactivo para la figura 1 </td></tr><tr><td> micromanipulador hidráulico </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Manipulador mecánico </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-M, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> traductor piezoeléctrico </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> La versión 8.6 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> DAQ </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipeta sistema </td></tr><tr><td> Mesa óptica </td><td> Cinética de los sistemas de </td><td> 5200 Series </td><td> Micropipeta sistema </td></tr></tbody></table>

adhesion frequency assay for in situ kinetics analysis of cross-junctional molecular interactions at the cell-cell interface

El ensayo de adhesión micropipeta fue desarrollado en 1998 para medir dos dimensiones (2D) ligando del receptor de la cinética de unión 1. El ensayo utiliza un glóbulo rojo humano (RBC) como sensor de la adhesión y la célula presentadora de una de las moléculas que interactúan. Emplea a micromanipulación para que la RBC en contacto con otra célula que expresa la molécula interactúa con otras área controlada con precisión y el tiempo para permitir la formación de enlaces. El acto de adhesión se detecta como la elongación de glóbulos rojos a tirar de las dos células separadas. Mediante el control de la densidad de los ligandos inmovilizados en la superficie de glóbulos rojos, la probabilidad de que la adhesión se mantiene en el rango medio entre 0 y 1. La probabilidad de adherencia se estima a partir de la frecuencia de los fenómenos de adhesión en una secuencia de ciclos repetidos contactos entre las dos células de un tiempo de contacto determinado. Variando el tiempo de contacto genera una curva de unión. Ajuste de un modelo probabilístico para la reacción del receptor-ligando una cinética de la unióncurva de rendimientos de la afinidad en 2D y descuento sobre la tarifa. El ensayo ha sido validado con las interacciones de los receptores Fc gamma con IgG Fc 1-6, selectinas con ligandos glicoconjugados 6-9, las integrinas con ligandos 10-13, homotypical vinculante cadherina 14, receptor de células T y co-receptor con complejos de histocompatibilidad péptido principales 15 - 19. El método se ha utilizado para cuantificar las regulaciones de la cinética en 2D, los factores biofísicos, tales como la membrana microtopology 5, la membrana de anclaje 2, la orientación molecular y longitud 6, rigidez portador 9, la curvatura de 20, y la fuerza de compresión 20, así como los factores bioquímicos, como moduladores del microambiente del citoesqueleto y la membrana donde las moléculas interactúan y viven de la organización superficie de estas moléculas 15,17,19. El método también se ha utilizado to estudiar la unión simultánea de dos ligando del receptor de la misma especie 3,4, y las interacciones trimolecular 19 utilizando un modelo modificado 21. La principal ventaja del método es que permite el estudio de los receptores de membrana en su ambiente nativo. Los resultados podrían ser muy diferentes de los obtenidos con receptores purificada 17. También permite el estudio de las interacciones ligando-receptor en un plazo de tiempo inferiores a un segundo con una resolución temporal más allá de los métodos bioquímicos típicos. Para ilustrar el método de adherencia micropipeta frecuencia, se muestra la medición cinética de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) en los glóbulos rojos funcionalizados la unión a la integrina α β 2 L de neutrófilos con dimérica E-selectina en la solución para activar α β L 2.

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.

Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

14.9K vistas.  Georgia Institute of Technology. Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Investigación

Bioingeniería

Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission. 
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.

This article describes a biofabrication approach: deposition of stimuli-responsive polysaccharides in the presence of biased electrodes to create biocompatible films which can be functionalized with cells or proteins. We demonstrate a bench-top strategy for the generation of the films as well as their basic uses for creating interactive biofunctionalized surfaces for lab-on-a-chip applications.

Reducción de la interfaz de Bio-electrónica con Biofabrication

Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Desarrollo de amelogenina-quitosano hidrogel para<em&gt; In Vitro</em&gt; Esmalte Recrecimiento con una interfaz Dense

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medición de TCR-pMHC Encuadernación<em&gt; In Situ</em&gt; Usando un ensayo de microscopía basada en FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Una nanoemulsión tripéptido-estabilizado del ácido oleico

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ambiental análisis mecánico dinámico para predecir el comportamiento de ablandamiento de los implantes neurales

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocolo de inyección lipídica para mediciones de cristalografía en serie en el sincrotrón australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...