Ringraziamo il team di produzione del virus DKFZ e unità di sviluppo, in particolare Marco Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau e Mandy Roscher. Questo studio è stato in parte sostenuto da finanziamenti del Ministero federale dell&#39;Istruzione e della Ricerca (BMBF) e l&#39;Associazione Helmholtz nel quadro del Krebsforschungszentrum Deutsches / CANCEROPOLE du Grand-Est programma comune tumore Virologia Applicata.

Si noti che un laboratorio con un livello di biosicurezza 2 è necessario per la produzione di parvovirus ricombinanti (recPV). Il protocollo è suddiviso in due parti principali. La prima parte (produzione di recPV tramite trasfezione) è necessaria per produrre la quantità minima di recPVs che serve come inoculo nella seconda parte del protocollo (produzione di recPVs tramite infezione). Una volta che una piccola quantità di recPVs viene prodotta, la prima parte del protocollo può essere omesso, e il parvovirus ricombinante può essere amplificato solo tramite infezione fornire il gene che codifica per le proteine ​​del capside di parvovirus attraverso l&#39;adenovirus helper (vedi sotto). 1. Produzione di recPVs tramite Transfection 1,1 transfezione di DNA virale È possibile utilizzare qualsiasi metodo stabilito transfezione di DNA in questa sezione del protocollo sia basato su lipidi cationici o fosfato di calcio. Generalmente usiamo Fugene HD Transfection Reagent. Per controllare l&#39;efficienza di trasfezione, si consiglia di transfezione targhetta supplementare con un plasmide che esprime una maggiore proteina fluorescente verde (ad es pEGFP-N1, Clontech). La trasfezione è considerata efficace e ottimale per la produzione di virus quando almeno il 50% della popolazione cellulare risulta EGFP-positivi 24 ore dopo la trasfezione. <ol><li> 1 giorno prima della transfezione, semi di 2 milioni di cellule HEK293T in un piatto di 10 cm, per ottenere 50% di confluenza cellulare fino al giorno di trasfezione. Crescere le cellule in 10 ml di Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM) con l&#39;aggiunta del 10% siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 100 U per ml penicillina e 100 pg / ml di streptomicina. </li><li> Preparare virus processo miscela (1:2:1 rapporto molare) in una provetta 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 3 pg di vettore recPV ospitare il transgene di interesse (EI PhH-1-GFP 6). </li><li> 6 pg di vettore pCMV / VP 5 ospitante il capside unità parvovirus gene </li><li> 8 mcg of adenovirus helper derivato da plasmide pXX6 7. </li></ol></li><li> Diluire la miscela plasmidi con terreno privo di siero fino a 850 (concentrazione finale di 20 ng / pl) pl. </li><li> Aggiungi 42,5 ul Fugene HD (2.5:1 Fugene ul ratio: DNA microgrammi). Non toccare il lato del tubo quando si aggiunge Fugene al mezzo. </li><li> Vortex delicatamente per 5-10 secondi. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Aggiungere le miscele di transfezione goccia a goccia per le cellule. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente l&#39;impasto in tutto. </li></ol> 1,2 Virus produzione <ol><li> Incubare la piastra a 37 ° C con 92% di umidità e 5% CO 2 per 72 ore prima della raccolta. Durante questo periodo particelle parvovirus progenie sono formate dai plasmidi parvovirus. </li></ol> 1,3 Virus raccolta <ol><li> In una cappa coltura tissutale, raschiare le cellule nel loro media, aspirare e trasferire la sospensione dalla piastra in 15plastica ml provetta. </li><li> Centrifugare la provetta a 250 xg per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il 95% del supernatante. </li><li> Vortex delicatamente il tubo per risospendere il pellet nel supernatante residuo (circa 0,5 ml). </li><li> Congelare il tubo a -80 ° C. E &#39;possibile interrompere la produzione in questa fase, o per continuare con il protocollo. </li><li> Sbrinare la sospensione e portarlo a temperatura ambiente. </li><li> Congelare la sospensione in un bagno di azoto liquido e disgelo in acqua calda a 37 ° C. Agitare vigorosamente per 15 secondi e ripetere i cicli di gelo-disgelo altre due volte. </li><li> Centrifugare le provette a 16000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Il tubo in questa fase contiene la preparazione dell&#39;estratto grezzo virus. </li><li> Procedere con la titolazione virus (vedi sotto). Per la recPV porta il gene GFP, una produzione tipica dovrebbe dare 1-3 x 10 7 unità virali infettive corrispondenti a circa 1 -3 x 10 10 genoma virale contenente particelle. </li></ol> 1,4 Virus stoccaggio <ol><li> Per la conservazione a lungo termine congelare il tubo contenente l&#39;estratto grezzo virus a -80 ° C. E &#39;possibile utilizzare estratti grezzi virali come inoculo nella seconda parte del protocollo. </li></ol> 2. Produzione di recPVs tramite infezione Prima di iniziare con la produzione recPV via infezione, produrre e purificare adenovirus 5 che porta il parvovirus VP gene (VP Ad-helper, descritto in 5) secondo il protocollo standard 8. È inoltre necessario avere una minima quantità di recPVs trasportano il transgene di interesse (ad esempio, prodotta tramite trasfezione come descritto sopra). Di seguito, descriviamo la produzione recPV in 175 cm 2 pallone (T175) formato. Ulteriore amplificazione dello stock di virus prodotta in questo modo può essere condotta in 10 camere di coltura multistrato CellSTACK (Corning)con modifiche minime del protocollo proposto. 2,1 Infezione <ol><li> 1 giorno prima infezione, piatto 10 milioni di cellule NB324K in un pallone T175 di ottenere il 60-80% di confluenza cellulare al giorno di infezione. Preparare un secondo pallone contenente lo stesso numero di cellule come un controllo (cellule non infette). Ogni T175 dovrebbe avere 20 ml di Medium minimo (MEM) come un volume finale, supplementato con 5% siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 100U per Penicilin ml e 100 pg / ml di streptomicina. </li><li> La mattina successiva preparare miscela virus in una provetta di plastica 2 ml costituito da: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-helper 5 a molteplicità di infezione (MOI, unità infettive per cellula) = 10 (corrispondente a 1 x 10 8 unità infettive); </li><li> recPVs a MOI = 0,5 (corrispondente a 5 x 10 6 unità infettive). Completa a 1,5 ml con MEM. </li></ol></li><li> Applicare la miscela virus in un pallone T175. </li><li> Incubare lapallone per 2 ore a 37 ° C, 92% di umidità, 5% CO 2 agitando delicatamente ogni 15 min. </li><li> Incubare per ulteriori 20-24 ore a 37 ° C, 92% di umidità, 5% CO 2. </li><li> Sostituire il terreno di coltura con terreno fresco. </li></ol> 2,2 Virus produzione Incubare le fiasche a 37 ° C con 92% di umidità e 5% CO 2 per 48 ore. Come indicazione di efficiente produzione virale, chiari segni di citotossicità deve essere osservata nel pallone contenente virali cellule infettate, a partire da 36-48 ore dopo l&#39;infezione. 2,3 Virus raccolta <ol><li> In una cappa coltura tissutale, aspirare e trasferire il supernatante mezzo dal pallone in una provetta da centrifuga 50 ml. </li><li> Lavare le cellule due volte con 1,5 ml di PBS. </li><li> Tripsinizzare le cellule con 1,5 ml di 0,25% Trysin-EDTA. Aggiungere la sospensione cellulare al mezzo rimosso. </li><li> Centrifugare le cellule e il surnatante a 5000 xg per 5 min a carattere cameraperatura. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) al pellet e delicatamente vortice la provetta per risospendere le cellule. </li><li> Blocca la sospensione cellulare in un bagno di azoto liquido e disgelo in acqua calda a 37 ° C. Vortex la provetta vigorosamente per 15 secondi e ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento tre volte. </li><li> Trattare la sospensione cellulare con 50 U / ml Benzonase nucleasi per 30 min a 37 ° C per digerire il DNA genomico delle cellule e virali non-confezionati. </li><li> Centrifugare la provetta a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Il supernatante in questa fase contiene la preparazione dell&#39;estratto grezzo virus. Le rese di recPV-GFP prodotta seguendo il protocollo dovrebbe essere nell&#39;intervallo di 1-10 x 10 8 unità virali infettive. </li></ol> 2,4 Virus stoccaggio <ol><li> Per stoccaggio a breve termine (massimo 2 mesi), virus conservare a 4 ° C. </li><li> Per long conservazione a lungo termine (più di 2 mesi), virus conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. RecPV Purificazione <ol><li> Per la purificazione delle recPVs dai lisati di greggio, si consiglia di eseguire un gradiente discontinuo Iodixanolo secondo Zolotukhin et al. 9. Si consiglia di utilizzare un minimo di 5 ml di greggio estratto virale (ottenuto dalla produzione in cinque palloni T175) per la purificazione del virus efficiente. </li></ol> 4. Parvovirus titolazione ricombinante <ol><li> Eseguire la titolazione recPV come descritto nella El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Controlli di qualità <ol><li> Utilizzare il protocollo descritto in El-Andaloussi et al. 5 per verificare la presenza di virus replica indesiderati competenti (AN) che effettuano test parvovirus placca in cellule indicatrici NB324K. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un esempio di recPVs production tramite trasfezione in presenza o assenza di elementi genomiche adenovirus è mostrato in Figura 3. Le cellule sono state trasfettate con pCMV / VP (plasmide trasportante il gene che codifica per le proteine ​​del capside di parvovirus VP) insieme PhH-1-GFP (uno recPV ospitante il gene GFP) o PhH-1-luciferasi (uno recPV ospitante il gene della luciferasi di lucciola) , con (+ pXX6) o senza (-pXX6) pXX6 il plasmide (che porta il adenovirus E2A, E4 (ORF6) e VA geni RNA). Volume uguale di estratti cellulari grezzi sono stati applicati a NB324K cellule e trasduzione GFP o saggi di luciferasi sono state eseguite come riportato in El-Andaloussi et al. 5. Un netto aumento della produzione recPVs è stato ottenuto in presenza di pXX6 con produzione crescente da 0,3 unità GFP trasduzionali (TU) / cellulare ottenuta secondo protocolli convenzionali, circa 5 TU / cellulare ottenuta seguendo il metodo (Fig. 3A, B). Un aumento significativo (circa 24 volte) di recPV productisu stata osservata anche nel caso di PhH-1-luciferasi (Fig. 3C). Questi risultati indicano che il materiale genetico contenuto in pXX6 è in grado di incrementare la produzione parvovirus. Un esempio rappresentativo di produzione recPVs tramite infezione è mostrato in Figura 4. NB324K cellule sono state co-infettati con recPVs vari (come indicato in figura) e Ad-VP-helper (ospitare il gene che codifica per le proteine ​​del capside VP PV). Ad VP-helper produzione ulteriormente migliorato recPV fino a&gt; 70 TU per semi cellule (Fig. 4A), senza aumentare la comparsa di indesiderati replicazione particelle virali (Fig. 4B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Figura 1. Vettori base parvovirus autonomi. (A) Top: Il transgene sostituisce parte del VP geni codificanti ed è sotto il controllo del promotore P38 virale. I geni per NS1 / 2 sono ricontenute e la loro espressione è controllata dal promotore virale P4. Il genoma del vettore è fiancheggiato da ITR parvoviral, che contengono elementi cis-agenti che sono richieste per la replicazione e confezionamento del genoma ricombinante. Basso: Un plasmide che porta il gene sotto-VP o un eterologo (ad esempio CMV.), O autologo (es P38.) Promotore (Px), viene fornita in trans durante la produzione ricombinante parvovirus per compensare per la distruzione dei geni strutturali nel genoma ricombinante. ITR, ripetizione terminale rovesciato. Figura adattato da 4. (B) Rappresentazione schematica del protocollo classico utilizzato per la produzione di recPVs. HEK293T cellule sono transitoriamente trasfettate con DNA virale (vettore e plasmidi helper) e dopo tre giorni, le cellule vengono raccolte e virus raccolto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Figura 2. Produzione di recPVs con lal&#39;aiuto della Ad-VP. (A) mappe schematiche di genomi recPV e Ad-VP. Il recPV contiene un transgene eterologa che sostituisce parte della regione VP. L&#39;Ad-VP ospita il gene parvovirus VP. (B) Rappresentazione schematica del protocollo descritto in questo manoscritto. Cellule NB324K sono co-infettati con recPV e Ad-VP virus. Dopo tre giorni le cellule vengono raccolte e particelle recPV recuperato dal lisato cellulare. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Figura 3. Stimolazione della produzione di recPV da adenovirus-based plasmidi pXX6. Cellule HEK293T, seminate in 10 piatti cm, sono state trasfettate con pCMV / VP in combinazione con PhH-1-GFP (A e B) o PhH-1-luciferasi (C) per produrre recPVs. Contemporaneamente, le cellule sono state co-trasfettate con i plasmidi derivati ​​da adenovirus helper pXX6 o meno, come indicato. Tre giorni dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e lisate mediante tre cicli di congelamento e scongelamento. Volumi uguali di CRUDestratti di Virus e sono stati applicati a NBK cellule indicatrici, e saggi di trasduzione sono stati effettuati. (A) micrografie rappresentativi mostrano cellule GFP positive all&#39;interno NB324K monostrati confluenti. (B) Quantificazione dei saggi di trasduzione del GFP espressa in unità di trasduzione (TU) per cella semi . (C) quantificazione dell&#39;attività luciferasica espressa come unità luciferasi relative (RLU). Il saggio luciferasi è stata eseguita come descritto in El-Andaloussi et al. 5. Le colonne rappresentano i valori medi di tre repliche con barre di deviazione standard. Numero sulla parte superiore della colonna + pXX6, in (B e C), indica l&#39;incremento volte in titoli virali le recPV, ottenuto in presenza di pXX6 rispetto senza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Figura 4. Stimolazione della produzione di recPV mediante ricombinante Ad-VP virus helper. (A) cellule NB324K, erano infezioniTed purificato con Ad-VP virus helper a MOI di 10 (Ad-X unità / cell, titolato con Adeno-X Rapid titolo Kit), e poi superinfettati con una delle seguenti parvovirus ricombinante Chi-HH-1-EGFP 11 (0,1 TU / cell) o H-1-GFP (0,5 TU / cell) 5. Un giorno dopo l&#39;infezione, mezzo è stato cambiato e due giorni dopo, le cellule sono state raccolte e lisate tramite tre freeze-e-scongelamento. Estratti cellulari grezzi sono stati usati per determinare i titoli virali mediante saggio di trasduzione secondo El-Andaloussi et al. 5. TU, unità di trasduzione. (B) lotti virali prodotte in presenza di assenza di Ad-VP sono stati analizzati per il contenuto di particelle virali di replicazione (AN) mediante saggio di placca su cellule indicatrici NB324K.

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	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Abbiamo dimostrato che la produzione recPV può essere migliorata dalla presenza di elementi genomiche adenovirali. Abbiamo aumentato i rendimenti recPV da più di 10 volte (0,3-5 TU / cellula) fornendo genomico elemento adenovirus tramite trasfezione e da più di 100 volte co-infettando le cellule con Ad-VP-helper in combinazione con la recPV in rispetto ai protocolli convenzionali. Il protocollo qui descritto può essere ulteriormente ottimizzato determinando il tempo più appropriata per la fornitura di elementi genomiche dei adenovirus e la concentrazione ottimale di Ad-VP helper da utilizzare per l&#39;infezione. RecPVs transgeni con i più grandi (più di 1.600 basi) sono prodotte in modo meno efficiente. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che inserendo il transgene, elementi necessari per il confezionamento PV corretto DNA virale cis-agenti vengono rimossi. La dimensione ottimale del transgene che può essere inserito nel genoma PV senza compromettere la sua produzione è fino a 700 di bases 6. Anche il tipo del transgene inserito può influenzare la produzione di recPV (ad es. Inserimento di geni che codificano per le proteine ​​citotossici può causare una riduzione dei rendimenti recPV). Un altro aspetto importante da prendere in considerazione durante la produzione recPVs è la possibile comparsa di virus replica competenti (AN) che potrebbe essere formata spontaneamente attraverso la ricombinazione omologa tra il parvovirus ricombinante e VP contenenti plasmidi. Il protocollo attuale non aumentare il rischio di ricombinazione. Tuttavia un controllo di qualità AN deve essere eseguita di routine (ad es. Saggio con placca in cellule indicatrici NB324K 5) alla fine della produzione per assicurare che gli stock virali contengono solo una quantità trascurabile di RCV. Il protocollo descritto supera precedenti limitazioni nella scelta della linea cellulare di confezionamento utilizzato, in quanto rende possibile l&#39;utilizzo di linee cellulari che sono difficili da trasfettare (equindi non adatto basato su protocolli di trasfezione), ma sono buoni produttori di PV. es. Cellule NB324K 10 che nelle nostre mani più efficiente nella produzione di recPVs HEK293T (dati non mostrati). Uno screening di diverse linee cellulari è ora possibile applicare il nuovo protocollo, e potrebbe identificare le celle più efficienti per la produzione di recPV. Questo apre anche la strada a ulteriori esplorazioni del sistema di produzione su larga scala per esempio di parvovirus ricombinante. in bioreattori con cellule in sospensione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nucleasi </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Rapid titolo Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Parvovirus roditori (PV) come H-rat 1PV e MVM, sono piccoli icosaedrica, virus a singolo filamento di DNA. La loro genoma comprende due promotori P4 e P38 che regolano l&#39;espressione di proteine ​​non strutturali (NS1 e NS2) e capside (VP1 e VP2) rispettivamente 1. Attirano grande interesse come agenti antitumorali per le loro capacità e oncolitici oncosuppressive pur essendo non patogeno per gli esseri umani 2. NS1 è l&#39;effettore maggiore di 3 citotossicità virale. Per migliorare ulteriormente le attività antineoplastici naturali, derivati ​​da questi vettori sono stati generati sostituendo il gene che codifica per le proteine ​​del capside di un transgene terapeutico (ad esempio un polipeptide citotossico, citochine, chemochine, gene soppressore del tumore, ecc) 4. I parvovirus ricombinanti (recPVs) vettore mantiene le NS1 / 2 e le sequenze codificanti telomeri genoma PV che sono necessari per l&#39;amplificazione del DNA virale e confezionamento. ProduzionerecPVs verifica solo nelle cellule produttrici (generalmente HEK293T) mediante co-trasfezione delle cellule con un vettore secondo (pCMV-VP) che esprime il gene che codifica per le proteine ​​VP (Fig. 1) 4. I vettori recPV generati in questo modo sono replica difettosi. Anche se recPVs dimostrato di possedere attività oncotoxic avanzate rispetto ai virus parentali da cui sono stati generati, la loro produzione resta una sfida importante e ostacola fortemente l&#39;uso di questi agenti in applicazioni cliniche anti-cancro. Abbiamo trovato che l&#39;introduzione di un vettore Ad-5 derivata contenente il E2a, E4 (ORF6) ed i geni RNA VA (es pXX6 plasmide) in HEK293T migliorato la produzione di recPVs di oltre 10 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Sulla base di questa scoperta, abbiamo costruito un nuovo Ad-VP-helper che contiene gli elementi necessari genomici adenovirali per aumentare la produzione recPVs nonché la parvovirci VP gene unità 5. L&#39;uso di Ad-VP-helper, consente la produzione di racco-PV utilizzando un protocollo che si basa interamente su gradini infezione virale (al contrario di trasfezione plasmide), rendendo possibile l&#39;uso di linee cellulari che sono difficili da trasfettare (es NB324K) ( Fig. 2). Presentiamo un metodo che migliora notevolmente la quantità di virus ricombinante prodotto, riducendo sia i tempi e costi di produzione, senza compromettere la qualità del prodotto finale 5. Inoltre, la produzione su larga scala di recPV (in cellule in sospensione e bioreattori) è concepibile.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Qui si descrive un protocollo basato solo sulle infezione delle cellule, che migliora l&#39;efficienza della produzione di parvovirus ricombinante di oltre 100 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Questo protocollo si basa sull&#39;utilizzo di un adenovirus nuovo 5-helper base contenente la VP parvovirus unità di trascrizione (Ad-VP).

Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l&#39;aiuto delle Adenovirus sistemi derivati

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Views.  German Cancer Research Center (DKFZ). Qui si descrive un protocollo basato solo sulle infezione delle cellule, che migliora l'efficienza della produzione di parvovirus ricombinante di oltre 100 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di un adenovirus nuovo 5-helper base contenente la VP parvovirus unità di trascrizione (Ad-VP).

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Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Stimare i tassi di produzione del virus nei sistemi acquatici

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

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Immunologia e infezioni

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Produzione e titolazione di vettori virali ricombinanti adeno-associato

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Scalabile High Throughput Selection Da sintetici Biblioteche Antibody fagi-visualizzato

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Rilevamento e rimozione di nucleasi contaminazione durante la purificazione del prototipo ricombinanti Virus schiumoso integrasi

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...