Agradecemos a equipe da produção do vírus DKFZ e unidade de desenvolvimento, em particular, Marcus Müller, Münstermann Silvia, Liebetrau Barbara, e Roscher Mandy. Este estudo foi parcialmente financiado por doações do Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF) e da Associação Helmholtz, no âmbito do Krebsforschungszentrum Deutsches / Cancéropôle du Grand-Est Programa conjunta em Tumor Applied Virology.

Note-se que um laboratório com um nível de segurança biológica 2 é necessário para a produção de parvovírus recombinantes (recPV). O protocolo está subdividido em duas partes principais. A primeira parte (produção de recPV através de transfecção) é necessária para produzir a quantidade mínima de recPVs que serve como inoculo na segunda parte do protocolo (produção de recPVs via infecção). Uma vez que uma pequena quantidade de recPVs é produzido, a primeira parte do protocolo pode ser omitido, e do parvovírus recombinante pode ser amplificado apenas através de infecção proporcionando o gene que codifica para as proteínas da cápside parvovírus através do auxiliar de adenovírus (ver abaixo). 1. Produção de recPVs via transfecção 1,1 transfecção de ADN viral É possível utilizar qualquer método de transfecção de ADN estabelecido nesta secção do protocolo ou baseados em lípidos catiónicos ou fosfato de cálcio. Nós usamos geralmente Fugene HD Reagente de transfecção. Para controlar a eficiência de transfecção, é recomendável para transfecção de chapa adicional com um plasmídeo expressando proteína verde fluorescente melhorado (por exemplo, pEGFP-N1, Clontech). A transfecção é considerada eficiente e ideal para a produção de vírus, quando pelo menos 50% da população de células resulta EGFP-positivas 24 horas após a transfecção. <ol><li> 1 dia antes da transfecção, semente de 2 milhões de células HEK293T numa placa de 10 cm, para se obter 50% de confluência celular, no dia da transfecção. Crescer as células em 10 ml de Dulbecco modificado por Eagle Médium (DMEM) com adição de 10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U por ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Preparar vírus de tomada de mistura (01:02:01 razão molar) num tubo de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 3 ug de recPV vector portador do transgene de interesse (EI PhH-1-GFP 6). </li><li> 6 mg de vetor pCMV / VP 5 abrigar o parvovírus unidade gene do capsídeo </li><li> 8 mg of ajudante de adenovirus derivado do plasmídeo pXX6 7. </li></ol></li><li> Dilui-se a mistura plasmídeos com meio isento de soro até 850 (concentração final de 20 ng / ul) uL. </li><li> Adicionar 42,5 ul Fugene HD (2,5:1 Fugene ul ratio: DNA mg). Não toque lateral do tubo ao adicionar Fugene ao meio. </li><li> Vortex delicadamente por 5-10 segundos. </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Adicionar as misturas de transfecção, gota a gota às células. Agitar a placa suavemente para distribuir a mistura por toda parte. </li></ol> 1,2 produção de vírus <ol><li> Incubar a placa a 37 ° C com uma humidade de 92% e 5% de CO2 durante 72 horas antes da colheita. Durante este período de partículas parvovírus progenitura são formados a partir dos plasmídeos parvovírus. </li></ol> 1,3 colheita Virus <ol><li> Em um capuz de cultura de tecidos, raspar as células dentro de seu meio, aspirar e transferir a suspensão a partir da placa em um 15ml de plástico do tubo. </li><li> Centrifugar o tubo a 250 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover 95% do sobrenadante. </li><li> Vortex suavemente o tubo para ressuspender o sedimento para o sobrenadante remanescente (cerca de 0,5 ml). </li><li> Congelar o tubo à temperatura de -80 ° C. É possível parar a produção nesta fase ou para continuar com o protocolo. </li><li> Descongelar a suspensão e trazê-lo à temperatura ambiente. </li><li> Congelar a suspensão num banho de azoto líquido e descongelação em água morna a 37 ° C. Vortex os tubos vigorosamente durante 15 seg e repetir os ciclos de congelação-descongelação mais duas vezes. </li><li> Centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Recolher o sobrenadante para um tubo fresco. O tubo nesta fase contém a preparação extracto bruto de vírus. </li><li> Prosseguir com a titulação do vírus (ver abaixo). Para a recPV que transporta o gene GFP, uma produção típica deve dar 1-3 x 10 7 unidades infecciosas virais correspondentes a cerca de 1 -3 x 10 10 genoma viral contendo partículas. </li></ol> 1,4 armazenamento Virus <ol><li> Para armazenamento a longo prazo congelar o tubo contendo o extracto de vírus em bruto a -80 ° C. É possível utilizar bruto extractos virais como inoculo na segunda parte do protocolo. </li></ol> 2. Produção de recPVs via infecção Antes de começar com a produção recPV via infecção, produzir e purificar adenovírus 5 carregando o parvovírus VP gene (Ad-VP ajudante, descrito em 5) de acordo com o protocolo padrão 8. É também necessário dispor de uma quantidade mínima de recPVs que transportam o transgene de interesse (eg, produzido através de transfecção, como descrito acima). Abaixo, descrevemos a produção em 175 recPV frasco cm 2 (T175) formato. Amplificação adicional da reserva de vírus produzido desta forma pode ser conduzida em 10 câmaras CellSTACK multicamadas de cultura (Corning)com pequenos ajustes do protocolo proposto. 2,1 Infecção <ol><li> 1 dia antes da infecção, placa de 10 milhões de células NB324K em um balão T175 para se obter 60-80% de confluência celular, no dia da infecção. Preparar um segundo frasco que contém o mesmo número de células como um controlo (não-infectadas células). Cada T175 deve ter 20 ml de Meio Essencial Mínimo (MEM), como um volume final, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100U por ml penicilina e estreptomicina 100 ug / ml. </li><li> Na manhã seguinte preparar mistura vírus em um tubo de plástico de 2 ml que consiste em: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-helper 5 a multiplicidade de infecção (MOI, unidades infecciosas / célula) = 10 (correspondendo a 1 x 10 8 unidades infecciosas); </li><li> recPVs a uma moi = 0,5 (correspondente a 5 x 10 6 unidades infecciosas). Completar a 1,5 ml com MEM. </li></ol></li><li> Aplicar a mistura em um vírus inteiro do balão T175. </li><li> Incubar abalão durante 2 horas a 37 ° C, humidade 92%, 5% de CO 2 agitando suavemente a cada 15 min. </li><li> Incubar durante mais 20-24 horas a 37 ° C, humidade 92%, 5% de CO 2. </li><li> Substitua o meio cultural por meio fresco. </li></ol> 2,2 produção de vírus Incubar os frascos a 37 ° C com uma humidade de 92% e 5% de CO 2 durante 48 horas. Como indicação da produção virai eficiente, sinais claros de citotoxicidade deve ser observado no balão contendo virais células infectadas, começando 36-48 horas após a infecção. 2,3 colheita Virus <ol><li> Em um capuz de cultura de tecidos, aspirar e transferir o sobrenadante médio a partir do balão para um tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Lave as células duas vezes com 1,5 ml de PBS. </li><li> Trypsinize as células com 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Adicionar a suspensão de célula para o meio removido. </li><li> Centrifugar as células eo sobrenadante a 5000 xg durante 5 min a têmpera quartotura. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão TE (1 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM, pH 8,7) para o pellet celular e suavemente vórtice do tubo para ressuspender as células. </li><li> Congelar a suspensão de células em um banho de azoto líquido e descongelação em água morna a 37 ° C. Vórtice do tubo vigorosamente durante 15 seg e repetir o ciclo de congelamento-descongelamento três vezes. </li><li> Tratar a suspensão de células com 50 U / ml Benzonase Nuclease durante 30 min a 37 ° C, a fim de digerir a genómico da célula e não embalados DNAs virais. </li><li> Centrifugar o tubo a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Recolher o sobrenadante para um tubo fresco. O sobrenadante, nesta fase, contém a preparação extracto bruto de vírus. Rendimentos típicos de recPV-GFP produzidos seguindo este protocolo deve estar no intervalo de 1-10 x 10 8 unidades infecciosas virais. </li></ol> 2,4 armazenamento Virus <ol><li> Para armazenamento a curto prazo (máximo de 2 meses), vírus da loja a 4 ° C. </li><li> Para long armazenagem a longo prazo (mais de 2 meses), vírus da loja a -80 ° C. </li></ol> 3. Purificação RecPV <ol><li> Para a purificação de recPVs a partir dos lisados ​​brutos, é recomendável para executar um gradiente descontínuo de acordo com a iodixanol Zolotukhin et ai. 9. Sugerimos utilizando um mínimo de 5 ml de extracto de viral em bruto (obtido a partir de produção em cinco frascos T175) para a purificação do vírus eficiente. </li></ol> 4. Titulação Parvovirus recombinante <ol><li> Realizar titulação recPV como descrito no et al El-Andaloussi. 5 </li></ol> 5. Controles de Qualidade <ol><li> Use o protocolo descrito no et al El-Andaloussi. 5 para verificar a presença de vírus de replicação indesejáveis ​​competentes (RCV) que realizam ensaios de placa de parvovírus em células indicadoras NB324K. </li></ol> 6. Os resultados representativos Um exemplo de recPVs productioN através de transfecção na presença ou ausência de elementos genómicos de adenovirus é mostrado na Figura 3. As células foram transfectadas com pCMV / VP (plasmídeo portador do gene que codifica para as proteínas da cápside parvovírus VP), juntamente com PhH-1-GFP (um recPV abrigando o gene GFP) ou PhH-1-luciferase (um recPV abrigando o gene da luciferase do pirilampo) , com (+ pXX6) ou sem (-pXX6) a pXX6 plasmídeo (carregando o adenovírus E2A, E4 (ORF6) e os genes ARN VA). Volume igual de extractos celulares brutos foram aplicados a NB324K células e de transdução de GFP ou ensaios de luciferase foram realizados como relatado em et al El-Andaloussi. 5. Um aumento claro na produção recPVs foi obtida na presença de pXX6 com o aumento da produção de 0,3 unidades de transdução de GFP (TU) / célula obtido de acordo com protocolos convencionais para cerca de 5 TU / célula obtido seguindo o nosso método (Fig. 3A, B). Um aumento significativo (cerca de 24 vezes) de recPV Production foi também observada no caso de PhH-1-luciferase (Fig. 3C). Estes resultados indicam que o material genético contido no pXX6 é capaz de aumentar a produção de parvovírus. Um exemplo representativo de produção recPVs via infecção é mostrado na Figura 4. Células NB324K foram co-infectadas com vários recPVs (como indicado na figura) e Ad-VP-helper (abrigando o gene que codifica para as proteínas da cápside de PV VP). Ad-VP auxiliar ainda reforçada produção recPV até&gt; 70 TU por seeded célula (Fig. 4A), sem aumentar a ocorrência de replicação competente indesejáveis ​​partículas virais (Fig. 4B). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Figura 1. Vectores com base em parvovírus autónomas. (A) superior: O transgene substitui parte dos genes que codificam VP-e está sob o controlo do promotor viral P38. Os genes para NS1 / 2 são resustentado e sua expressão é controlada pelo promotor viral P4. O genoma do vector é flanqueado por ITRs o parvovírus, que contêm cis-acting elementos que são necessários para a replicação e empacotamento do genoma recombinante. Conclusão: Um plasmídeo portador do gene VP-sob qualquer uma heterólogo (por exemplo, por CMV.), Ou autólogo promotor (por exemplo P38.) (PX), é fornecido em trans, durante a produção recombinante parvovírus, a fim de compensar as perturbações dos genes estruturais no genoma recombinante. ITR, repetição terminal invertida. Figura adaptada de 4. (B) vista esquemática do protocolo clássico utilizado para a produção de recPVs. HEK293T células são transfectadas transitoriamente com o DNA viral (vector e plasmídeos auxiliares) e depois de três dias, as células são recolhidas e vírus colhido. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Figura 2. Produção de recPVs com oajuda da Ad-VP. (A) mapas esquemáticos de genomas recPV e Ad-VP. O recPV contém um transgene heterólogo que substitui parte da região VP. O Ad-VP abriga o parvovírus gene VP. (B) Representação esquemática do protocolo descrito no presente manuscrito. NB324K células são co-infectados com recPV e Ad-VP vírus. Depois de três dias as células são colhidas e partículas recPV recuperado a partir de lisados ​​de células. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Figura 3. A estimulação da produção recPV por adenovírus baseados plasmídeos pXX6. Células HEK293T, semeado em 10 pratos cm, foram transfectadas com pCMV / VP em combinação com PhH-1-GFP (A e B) ou PhH-1-luciferase (C) para produzir recPVs. Simultaneamente, as células foram co-transfectadas com os plasmídeos derivados de adenovirus auxiliar pXX6 ou não, como indicado. Três dias após a transfecção, as células foram colhidas e lisadas por três ciclos de congelamento e descongelamento. Volumes iguais de crudextractos vírus de e foram aplicadas a NBK células indicadoras, e ensaios de transdução foram realizadas. (A) micrografias representativos mostrando células GFP positivas dentro monocamadas confluentes. NB324K (B) Quantificação dos ensaios de transdução de GFP expressa em unidade de transdução (TU) por célula seeded . (C) Quantificação da actividade de luciferase expressos como unidades relativas de luciferase (RLU). O ensaio de luciferase foi realizada como descrito em et al El-Andaloussi. 5. Colunas representam os valores médios de três repetições com barras de desvio padrão. Número no topo da coluna + pXX6, em (B e C), indica o aumento vezes nos títulos de vírus recPV, obtida na presença de pXX6 versus sem. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Figura 4. Estimulação da produção de recPV por meio de recombinante vírus auxiliar Ad-VP. (A) células NB324K, foram infecçãoted com purificado vírus auxiliar Ad-VP a uma moi de 10 (Ad-X unidade / célula, titulado com adeno-X rápida Titer Kit) e, em seguida superinfected com um dos seguintes parvovírus recombinante Chi-HH-1-EGFP 11 (0,1 TU / célula) ou H-1-GFP (0,5 TU / célula) 5. Um dia pós-infecção, o meio foi mudado e dois dias mais tarde, as células foram recolhidas e lisadas através de três congelamento-descongelamento e ciclos. Extractos celulares brutos foram usados ​​para determinar os títulos de vírus por ensaio de transdução de acordo com et al El-Andaloussi. 5. TU, a unidade de transdução. (B) lotes virais produzidas na presença ou ausência de Ad-VP foram analisadas para o seu conteúdo de replicação competente partículas virais (VN) por ensaio de placa sobre células indicadoras NB324K.

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	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Nós mostramos que a produção de recPV pode ser aumentada pela presença de elementos genómicos adenovirais. Temos aumentou os rendimentos recPV por mais de 10 vezes (0,3-5 TU / célula), fornecendo elemento genómico adenovírus através de transfecção e por mais de 100 vezes o co-infectando as células com Ad-VP-helper em combinação com o recPV em comparação com protocolos convencionais. O protocolo descrito aqui pode ser ainda mais optimizado através da determinação do tempo mais apropriado para a entrega dos elementos genómicos de adenovirus e da concentração óptima de Ad-VP auxiliar para ser utilizada para a infecção. RecPVs com transgenes maiores (mais de 1.600 bases) são menos eficientemente produzido. Isto é provavelmente devido ao facto de que, ao inserir o transgene, cis-acting elementos necessários para PV embalagem de DNA adequada viral são removidos. O tamanho óptimo do transgene, que pode ser inserido no genoma PV sem afectar a sua produção é de até 700 base des 6. Além disso, o tipo do transgene inserido pode afectar recPV produção (por exemplo. Inserção de genes que codificam para proteínas citotóxicas pode resultar em rendimentos mais baixos recPV). Outro aspecto importante a ter em consideração durante a produção recPVs é a possível ocorrência de replicação de vírus competentes (VN), que poderia ser formada espontaneamente através de recombinação homóloga entre o parvovírus recombinante e VP contendo plasmídeos. O presente protocolo não aumenta o risco de recombinação. No entanto um controlo de qualidade VN deve ser realizada rotineiramente (por exemplo. Ensaio de placa em células indicadoras NB324K 5) no final da produção, a fim de assegurar que as reservas virais contêm apenas uma quantidade insignificante de RCVs. O protocolo descrito supera as limitações anteriores na escolha da linha celular de empacotamento utilizado, uma vez que torna possível a utilização de linhas celulares que são difíceis de transfectar (eportanto, não é adequado com protocolos baseados em transfecção), mas são bons produtores de PVs. por exemplo. Células NB324K 10 que nas nossas mãos foram mais eficientes na produção recPVs do que HEK293T (dados não mostrados). A seleção de linhagens celulares diferentes, é agora possível a aplicação do novo protocolo, e pode identificar as células mais eficientes para a produção recPV. Isso também abre caminho para uma maior exploração do sistema de produção em larga escala por exemplo de parvovírus recombinante. em biorreactores com células em suspensão.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Soro Bovino Fetal </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X rápida Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Parvovírus roedores (PV), como ratos H-1PV e MVM, são pequenas Icosaédricos, solteiros encalhados vírus, o DNA. Seu genoma inclui dois promotores P4 e P38 que regulam a expressão de proteínas não estruturais (NS1 e NS2) e da cápside (VP1 e VP2), respectivamente 1. Eles atraem grande interesse como agentes anticâncer para suas habilidades e oncolíticos oncosuppressive enquanto ser não-patogênica para humanos 2. NS1 é o efectora principal de 3 a citotoxicidade virai. A fim de melhorar ainda mais as suas actividades naturais antineoplásicos, derivados a partir destes vectores foram gerados através da substituição do gene que codifica para as proteínas da cápside com um transgene terapêutico (por exemplo, um polipéptido citotóxica, citocina, quimiocina gene do tumor, supressor etc) 4. Os parvovírus recombinantes (recPVs) vector retém as sequências de NS1 / 2 de codificação e os telómeros genoma PV que sejam necessários para amplificação de DNA viral e embalagem. Produção derecPVs ocorre apenas nas células produtoras (geralmente HEK293T), por co-transfecção das células com um vector segundo (pCMV-VP) que expressa o gene que codifica para as proteínas VP (Fig. 1) 4. Os vectores recPV geradas desta maneira são replicação defeituosa. Embora recPVs provou possuir actividades melhoradas oncotoxic com respeito aos vírus parental a partir da qual eles foram gerados, a sua produção continua a ser um importante desafio e fortemente dificulta a utilização destes agentes anti-cancerígenos, em aplicações clínicas. Encontrámos que a introdução de um vector Ad-5 derivada contendo o E2a, E4 (ORF6) e os genes ARN VA (por exemplo, pXX6 plasmídeo) em HEK293T melhorou a produção de recPVs por mais de 10 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Com base nesta constatação, nós construímos um novo Ad-VP-helper que contém os elementos genómicos adenovirais necessárias para aumentar a produção recPVs, bem como a parvovirnos VP unidade gene 5. A utilização de Ad-VP-helper, permite a produção de rec-PVs usando um protocolo que depende inteiramente de passos infecção viral (em oposição a transfecção de plasmídeo), tornando possível a utilização de linhas celulares que são difíceis de transfectar (por exemplo, NB324K) ( Fig. 2). Apresentamos um método que melhora grandemente a quantidade de vírus recombinante produzida, reduzindo tanto o tempo de produção e custos, sem afectar a qualidade do produto final 5. Além disso, a produção em larga escala de recPV (em células em suspensão e biorreatores) é agora concebível.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).

Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K visualizações.  German Cancer Research Center (DKFZ). Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).

Vídeo: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Estimar as taxas de produção de vírus em Sistemas Aquáticos

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Imunologia e Infecção

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Produção recombinante Retroviral e infecção de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...