Vorremmo ringraziare BK agosto presso la University of Wisconsin-Madison strumento microscopio elettronico per la microscopia elettronica. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).

1. Preparativi 1-4 <ol><li> Preparare 500 mL di tampone di media pendenza (GM) mescolando 50 mL di una sospensione saccarosio 2,5 M, 2,5 mL di una 1M Tris-HCl, pH7.5 stock, e 0,1 mL di una m 0,5 EDTA, pH 8,0 stock con millisecondi Q acqua al volume. Filtro sterilizzare la soluzione, aliquota e conservare congelati. </li><li> Preparare uno stock 1000x di tetrodotossina (TTX) facendo una soluzione 1 mM in milli-Q H 2 O. Aliquote di TTX possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Preparare Buffer 10x stimolazione facendo una soluzione di 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, e 800 mM NaCl in acqua Milli-Q. Magazzino può essere conservato a 4 ° C. </li><li> Pre-cool centrifughe a 4 ° C. </li><li> Preparare una soluzione stock di Isosmotic Percoll (SIP) con l&#39;aggiunta di 9 volumi di Percoll (18 ml) a 1 volume di 2,5 M saccarosio (2 ml) in milli-Q acqua e mescolare bene. </li><li> Preparare il 3, 10, 15, e gli strati pendenza del 23% sommando i rispettivi importi di SIP per GM buffer e mescolando ogni: </li></ol><img alt="Tabella 0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" /><ol start="7"><li> Versare strati gradiente pipettando 2 ml ciascuno dei 23, 15, 10, e il 3% Percoll isosmotic soluzioni in provette per centrifuga della Beckman con tappi utilizzando un Gilson Pipetman P1000. L&#39;interfaccia tra gli strati devono essere chiaramente individuabili senza miscelazione degli strati. Conservare i gradienti a 4 ° C per almeno 20 minuti prima dell&#39;uso. I gradienti possono essere memorizzati fino a 24 ore anche se l&#39;uso stesso giorno è raccomandato. [Personale di laboratorio inesperti possono praticare gradienti preparazione con l&#39;aggiunta di colorante blu per le soluzioni isomotic Percoll per la visualizzazione delle interfacce strato.] </li></ol> 2. Dissezione del mouse 1 <ol><li> Garantire che tutti allevamento del mouse e l&#39;eutanasia procedure sono eseguite in conformità con le linee guida NIH e Università. Euthanize cuccioli (età P13 a P21) per asfissia di anidride carbonica o con un metodo approvato nel protocollo animale. </li><li> Pin il mouse in una tavola dissezione e spruzzare la parte posteriore del collo e della testa con etanolo. Utilizzando un paio di forbici affilate tagliare il midollo spinale alla base del cranio, togliere la pelle dalla parte superiore del cranio, tagliare il cranio lateralmente tra l&#39;osso parietale e l&#39;osso interparietale o tra il cervello e le regioni della corteccia. Poi tagliare il cranio dalla base al naso (lungo la sutura sagittale), rimuovere con attenzione l&#39;osso parietale morbido tirando ogni emisfero di lato e togliere la corteccia con una spatola. Inserire la spatola nel cervello di sopra del cervelletto e poi raccogliere la corteccia e metterlo nella gelida tampone GM. Procedere immediatamente alla fase di omogeneizzazione. Non lasciate che le cortecce siedono in ghiacciato tampone per molto tempo come questo influenzerà negativamente la formazione di SN. </li></ol> 3. Preparazione dell&#39;omogeneizzato e SN 1-4 <ol><li> Sciacquare le cortecce in gelida tampone GM e trasferire due cortecce in un bicchiere Dounce omogeneizzatore contenente 5 ml di tampone a freddo GM. </li><li> Delicatamente omogeneizzato le cortecce con 5-10 colpi del pestello sciolti (pestello &quot;A&quot;), seguito da 5-10 colpi del pestello stretto (pestello &quot;B&quot;). Strokes dovrebbe essere rapido ma abbastanza lento non causare bolle d&#39;aria. Un&#39;immagine del omogenato dopo omogeneizzazione è in Schema 1. Il numero di colpi sarà variare a seconda del omogeneizzatore individuale e pestelli di accompagnamento. Al termine i gradienti dovrebbe dare una band forte SN, in caso contrario, regolare il numero di colpi. </li><li> Trasferire l&#39;omogeneizzato a 15 ml conica e centrifugare a 1000xg per 10 minuti a 4 ° C in un rotore oscillante (Allegra 6KR centrifuga) a pellet detriti cellulari e nuclei. Un&#39;immagine del omogeneizzato filato è in Schema 1. </li><li> Layer 2 mL del supernatante per gradiente di Percoll-saccarosio, cap i tubi, e centrifugare a 32500 xg per 5 minuti a 4 ° C in un rotore ad angolo fisso (Beckman J2-21 centrifuga, rotore JA-17) con opportuni adattatori ( Vedi Tabella Reagenti e apparecchiature). </li><li> Pipetta fuori e scartare la soluzione al di sopra della banda SN utilizzando una pipetta Pasteur di vetro. Pipetta fuori la band SN a livello di interfaccia% 15/23, trasferimento in un cono e memorizzare sul ghiaccio. Ogni pendenza o una corteccia produce 0,9-1,1 mL di SN. </li><li> Regolare la concentrazione di sale della SN con l&#39;aggiunta di un decimo del volume di tampone stimolazione 10x, aggiungere 1000x CaCl 2 ad una concentrazione finale di 12 nM, e aggiungere 1 magazzino mM TTX ad una concentrazione finale di 1 mM di sopprimere l&#39;eccitazione non specifici. (Aggiunta di CaCl 2 è facoltativo, se essa possa interferire con le applicazioni a valle SN). </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​del SN con il Micro BCA Protein Assay Kit. (Il test proteina Bradford non è raccomandato a causa di inferenza dalla Percoll.) </li><li> SN può essere utilizzato direttamente e velocemente per le proteine ​​traduzionizione degli studi. Per altre applicazioni SN lisato possono essere ripulite o concentrati con l&#39;SDS-PAGE Pierce Kit Sample Prep. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Quando il mouse corteccia è stata omogeneizzata e separato in discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti (Schema 1), 6 bande o le frazioni sono state osservate (Figura 1). E &#39;stato precedentemente mostrato per 3,5 corteccia cerebrale di ratto che i componenti delle bande ad alto peso molecolare sono state rotte membrana e mielina e che il materiale contenuto pellet mitocondri o organelli (Tabella 1). Il 23% / 15% di interfaccia (Band 5) conteneva il SN arricchito. La band al 23% / 15% di interfaccia, contenenti SN intatto, è stato rimosso ed esaminato al microscopio elettronico (EM), come descritto in precedenza. 2,6 EM ha mostrato la presenza di vescicole sinaptiche intatto e la conservazione di elementi presinaptici e postsinaptici (Figura 2). Isolamento dei vani di pre-e post-sinaptici è importante per l&#39;esame di segnalazione e di sintesi delle proteine, che si verifica in entrambi i comparti. 7-13 Il gradiente di Percoll-saccarosio è una purificazione grezzo quindi abbiamo visto minori cellulare, contaminazione nucleare e degli organelli nella frazione SN, ma la separazione è stata buona. Quando esaminati da Western Blot, le frazioni di Percoll contenuti i marcatori proteici previsto con un aumento di purezza sinaptica nella banda SN (Figura 3, Tabella 2). Marcatori sinaptica e neuronale sono stati mantenuti nella banda arricchita SN (Band 5), ma l&#39;abbondanza di altri marcatori è risultata significativamente ridotta. In particolare, la presenza di GFAP, un marker per le cellule astrociti e neoplastiche di origine gliale, e Lamin-B1, un marcatore nucleare, sono state trascurabili, mentre gli indicatori strutturali e synaptic sono state mantenute o migliorate. Inoltre, vi era la conservazione dei marcatori per organelli, come i mitocondri e Golgi, che svolgono un ruolo nella sintesi proteica. Le rese per la band SN erano 250-500 ng di proteine ​​per microlitri, come determinato dal dosaggio delle proteine ​​BCA. L&#39;attività della Scuola Normale Superiore è stata determinata dalla quantità di de novo sintesi proteica presente come monitorato da [35S]-Met incorporazione (Figura 4) 2. Translazionali attività basale era 1,56 volte maggiore quando SN sono state stimolate con 50 microM glutamate/10 mM glicina (Glu) o 5,12 volte quando viene attivato con l&#39;inibitore juglone Pin1. Inibizione Pin1 è noto per provocare la sintesi proteica aumentata. 2 Per confermare che l&#39;aumento di [35S]-Met incorporazione era dovuto a de novo sintesi proteica, abbiamo aggiunto 40 anisomycin mM, un inibitore della sintesi delle proteine, e ha visto una notevole diminuzione incorporazione in presenza e in assenza di Glu rispetto ai livelli basali. Inoltre, dopo l&#39;aggiunta del 2% Triton X-100, che interrompe l&#39;integrità del SN, la traduzione basale è stata ridotta del 75%. 2 Inoltre, nell&#39;esaminare le bande (B4-B6) che ha mostrato l&#39;arricchimento marcatore più sinaptica, il SN o Band 5 ha avuto il maggiore attività per la sintesi proteica de novo (Figura 5). Così, il discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti rapidamente produrre una molto attivi e arricchito banda SN che può essere utilizzato per lo studio di traduzione delle proteine. Il discontinuo di Percoll-saccarosio procedura di gradiente è più vantaggioso rispetto ad altri metodi, perché i danni meccanici è causato da condizioni più severe. Rispetto al metodo di filtraggio, in cui cancellato omogenato corticale viene fatta passare attraverso una serie di filtri che riducono nelle dimensioni, 3,14-15 il metodo Percoll forme più SN con maggiore attività. Come si vede in figura 6, quando un aliquota di SN preparato con il metodo di filtraggio è stata approvata nel corso di un gradiente di Percoll-saccarosio ci sono SN molto meno a livello di interfaccia 15/23% e una maggiore quantità di membrane rotte. Quando de novo sintesi delle proteine ​​è stata misurata mediante incorporazione S35-ha incontrato, il SN preparato con il metodo di filtraggio erano molto meno attivi (Figura 7). Per massimizzare l&#39;attività traslazionale usiamo topi che sono tra l&#39;età P14 e P18. SN possono essere preparati da topi adulti, ma abbiamo osservato un significativo aumento dell&#39;attività traslazionale con SN preparati da giovani topi (Figura 8). <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" /> Tabella 1. Componenti della band dal gradiente discontinuo di Percoll-frazionamento della corteccia del mouse omogeneizzato. 3,5 <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" /> Tabella 2. Sintesi delle analisi bullone occidentale dei costituenti gradiente discontinuo di Percoll-saccarosio band. Concentrazioni di proteine ​​relativa per ciascuna delle frazioni isolate banda utilizzando un Percol discontinuol-gradiente di saccarosio sono stati determinati mediante Western blot. Nessun proteina presente (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), o&gt; 0,8 volte (+++) = maggiore di proteina presente nel supernatante (S, centrifugati corteccia omogenato), rappresentante di n 3. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" /> Schema 1: Schema di un preparato SN utilizzando un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente di densità corteccia cerebrale del mouse sono stati sezionati, omogeneizzati, e centrifugati a bassa velocità per rimuovere non omogeneizzato tessuti, cellule, organelli integrali come nuclei e membrane.. Il gradiente discontinuo deve avere chiaramente definiti strati. L&#39;immagine inserto mostra un esempio degli strati, che sono stati tinti di azzurro ha scopi puramente illustrativi per visualizzare gli strati. Il supernatante è stratificato sulla cima di un discontinuo gradiente di Percoll-saccarosio e centrifugati a velocità media. La band SN è poi recuperato dal gradiente ed è pronto all&#39;uso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" /> Figura 1. Frazionamento omogenato in un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente. Topo corteccia è stata omogeneizzata e separati su un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente dando luogo a 6 bande o frazioni. L&#39;, attivo puro SN (*) sono stati trovati in banda 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" /> Figura 2. Preparati SN dare un mix eterogeneo di SN che conservano elementi presinaptici e postsinaptici. Un microscopio elettronico di una preparazione SN preparato da C57BL / 6 topi (età P13 a P21) è stata eseguita come descritto in precedenza e mostra SN con conservato elementi presinaptici e postsinaptici 2. , 6 punti Red frecce per post-sinaptico densità. Barra di scala è di 1 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi Western blot di preparati SN ha dimostrato che i marcatori sinaptica e neuronale sono stati mantenuti nel SN purificato (banda 5), ma l&#39;abbondanza di altri marcatori è risultata significativamente ridotta. Immunoblot di surnatante (S, centrifugati omogenato corticale) e Bande 1-6 di uno discontinuo gradiente di Percoll-saccarosio sono stati sondati per la β-actina (strutturale, controllo di carico), GFAP (astrociti), GP73 (Golgi), HSC70 (citoplasmatica e nucleare), Lamin-B1 (nucleare), Prohibitin (mitocondriale), PSD95 (densità postsinaptica ), SNAP25 (sinapsi), sinaptofisina (sinapsi) e β3-tubulina (neurone-specifico). Le bande sono state visualizzate con un 860 Phosphorimager Tempesta, rappresentante di n = 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" /> Figura 4. SN sono attivi e mostrano de novo sintesi proteica tramite [35S]-Met incorporazione. SN sono stati pre-equilibrati a 37 ° C per 10 min. Poi i SN sono stati pre-trattati o non trattati per 15 min con 40 anisomycin mM o 1 juglone mM a 37 ° C seguita da aggiunta di [35S]-Met, 20 l espresso Label Pro Mix S35 Etichetta Facile, più o meno Glu a 37 ° C per 30 min. I campioni sono stati preparati con la SDS-PAGE Pierce Kit Sample Prep, eseguito su un gel di poliacrilammide al 15%, asciugato e quantificato utilizzando una dinamica molecolare Tempesta 860 phosphorimager, rappresentante di n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" /> Figura 5. Banda 5 dal discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente contenuti i massimi livelli di de novo sintesi proteica. Bande 4, 5 e 6 e il surnatante (S, centrifugati omogenato corticale) sono stati pre-equilibrati a 37 ° C per 10 min. Poi, [35S]-Met, Check Mix Label Pro S35 Tag Facile, è stata aggiunta, più o meno Glu a 37 ° C per 30 min. I campioni sono stati preparati con la SDS-PAGE Pierce Kit Sample Prep, eseguito su un gel di poliacrilammide al 15%, asciugato e quantificato utilizzando una dinamica molecolare Tempesta 860 phosphorimager, rappresentante di n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" /> Figura 6. SN preparato da un metodo di filtraggio contenere le membrane più rotto e SN meno tutto quello SN preparato dal discontinuo di Percoll-saccarosio metodo del gradiente. SN sono stati preparati da corteccia omogeneizzato passando attraverso una serie di filtri con il diminuire delle dimensioni dei pori, come descritto in precedenza. 3,14-15 Un&#39;aliquota del SN preparato con il metodo di filtraggio è stato centrifugato per un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente e rispetto ad un importo equivalente di materiale con il discontinuo di Percoll-saccarosio metodo del gradiente. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" /> Figura 7. SN preparato da un metodo di filtraggio contengono meno proteine ​​de novo sintesi delle attività di SN preparato from il discontinuo di Percoll-saccarosio metodo del gradiente. SN sono stati preparati da corteccia omogeneizzato passando attraverso una serie di filtri con il diminuire delle dimensioni dei pori come descritto in precedenza, 3,14-15 e dal discontinuo di Percoll-saccarosio metodi di gradiente. SN di entrambe le preparazioni sono state pre-equilibrati a 37 ° C per 10 min. Poi, [35S]-Met, Check Mix Label Pro S35 Tag Facile, è stata aggiunta, più o meno Glu a 37 ° C per 30 min. I campioni sono stati preparati con la SDS-PAGE Pierce Kit Sample Prep, eseguito su un gel di poliacrilammide al 15%, asciugato e quantificato utilizzando una dinamica molecolare Tempesta 860 phosphorimager, rappresentante di n = 3, ± SEM. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" /> Figura 8. SN più giovani topi (P14) hanno una maggiore attività traslazionale rispetto ai vecchi topi (P85). SN sono state preparate da diversi topi anziani con il discontinuo di Percoll-saccarosio metodo del gradiente, preequilibrated a 37 ° C per 10 minuti, trattati o non trattati con Glu nel presenza di [35S]-Met (Express Label Pro Mix S35 Etichetta facile) per 30 min, scatto congelato, e poi ripulite con la SDS-PAGE Kit Sample Prep Pierce. I SN sono state poi eseguite su un SDS-poliacrilammide gel 12%, asciugato e ripreso su un Molecular Dynamics Tempesta 860 phosphorimager, rappresentante di n = 3, ± SEM. SN da P14 topi sono stati almeno 3 volte più attivo del P85 topi.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il discontinuo di Percoll-saccarosio preparazione pendenza qui descritto è un processo rapido, metodo affidabile per isolare attivo SN, che può essere utilizzato in una varietà di esperimenti di trasmissione sinaptica. Questo metodo del gradiente, che si basa sul metodo sviluppato da Dunkley et al. 3,4 è una procedura di frazionamento subcellulare del cervello che isola pre e post-sinaptici di membrana derivata vescicole che sono associati tra loro. Senza ulteriore purificazione queste SN sono compatibili con una varietà di tecniche di biologia molecolare, tra cui immunoprecipitazione, western blotting, citometria a flusso, il monitoraggio de novo sintesi proteica tramite [35S]-Met incorporazione, microscopia elettronica, e una serie di saggi di attività enzimatica compresi isomerasi e chinasi attività di test. Il discontinuo di Percoll-saccarosio procedura gradiente è relativamente semplice, tuttavia, è la chiave per mantenere soluzioni e materiale cerebrale a 4 ° C per tutta la preparazione e di pre-chill le pendenze. Anche se l&#39;omogeneizzato viene mantenuta gelida in ogni momento per minimizzare proteolisi, per una migliore resa con una maggiore attività è meglio non lasciare che le cortecce sedersi sul ghiaccio in un tampone di GM troppo tempo prima di omogeneizzazione. La formazione di SN è migliore quando le cortecce vengono risciacquati e poi rapidamente omogeneizzato. L&#39;omogenato, tuttavia, possono essere tenuti in ghiaccio prima della centrifugazione iniziale senza effetti negativi. La velocità è un problema una volta che la corteccia sono state raccolte, così l&#39;isolamento di SN dovrebbe essere completato nel più breve tempo possibile. Anche se SN può mantenere alta attività per 1-2 ore, periodi prolungati di tempo tra i passaggi si tradurrà in diminuzione dell&#39;attività. L&#39;età dei topi usati per la preparazione SN è anche una questione chiave. E &#39;stato dimostrato in precedenza che ci sia un declino correlato all&#39;età nella plasticità sinaptica nei roditori. 16-19 Abbiamo visto lo stesso effetto in SN. Anche se i topi anziani può essere usato per fare traduzionali attivo SN, abbiamo trovato che i giovani topi (P14) hanno una maggiore attività traslazionale poi topi più anziani (P85). Ci sono diverse varianti e combinazioni di filtrazione, centrifugazione 5,14-15,20-23, 24-27 e 26-29 gradiente metodi che sono stati utilizzati per preparare SN e ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi. Metodi di filtrazione e la centrifugazione può provocare danni meccanici al SN. I metodi che hanno utilizzato differenti filtri di dimensioni dei pori portato ad una maggiore percentuale di membrane rotte e resa SN molto meno. Abbiamo provato il metodo del filtro, 5,14-15 che passa l&#39;omogeneizzato attraverso una serie di filtri con la diminuzione della dimensione dei pori e ha scoperto che i SN preparato con il metodo di filtraggio erano significativamente meno attive. I metodi di centrifugazione anche provocare danni meccanici dovuti alla prolungata gira ad alta velocità che pellet o compattare il SN in fondo a tubi e richiede risospensione. Percoll impiega più miti condizioni che evitino di filtraggio o cubettatura il SN, che può schiacciare o lisi del SN. SN procedure che utilizzano Ficoll 28,30-32 o molarità alta di saccarosio 4,31 anche tradursi in SN danneggiati o meno attiva, disturbi della funzione biologica e cambiamenti morfologici. 31-32 Ficoll può provocare l&#39;aggregazione delle cellule indesiderate a pH fisiologico e dà gradienti osmotici con concentrazioni crescenti. 31-32 Per mantenere condizioni isoosmotic, le pendenze devono essere compensate con un gradiente di sale. 31 SN preparati con alte concentrazioni di saccarosio (1,4-0,8 M) comportano SN più piccoli e meno attivi 4. Il discontinuo di Percoll-saccarosio metodo supera molti dei problemi coinvolti con altri media e le procedure di centrifugazione. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è l&#39;uso di Percoll, che ha una bassa viscosità, osmolarità e relativamente bassa tossicità verso le cellule ei loro componenti, rendendo così più adatto per gli esperimenti gradiente di densità rispetto alle alternative. 4,29 Inoltre, può Percoll essere preparati con saccarosio per mantenere l&#39;osmolarità necessaria per mantenere l&#39;integrità SN. 4 Utilizzo discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti riduce il tempo di centrifugazione 30-45 min a 5 minuti, prolungando così la durata della vita utile della SN, che hanno una durata limitata per l&#39;attività . Un altro vantaggio dei gradienti Percoll è il rendimento più elevato e l&#39;attività di SN rispetto ai metodi che utilizzano i filtri per formare SN. Abbiamo corso il SN dal metodo del filtro su un gradiente di Percoll-saccarosio. Abbiamo trovato una band appena percepibile SN e l&#39;abbondanza di alto peso molecolare membrane rotto sul gradiente. Inoltre, l&#39;attività traslazionale del SN preparato con il metodo Percoll è stato significativamente superiore con il metodo del filtro. Nel complesso, Percoll è preferibile ad altri metodi, perché impiega più miti condizioni che evitino di filtraggio e la cubettatura resultin SNg in una maggiore ritenzione di attività sinaptica e la formazione di vescicole meglio. Il vantaggio del nostro metodo oltre Dunkley, et al, 3,4 è che un vetro, vetro Dounce omogeneizzatore è stato utilizzato nel presente documento in contrasto con il motore in Teflon guidato, vetro omogeneizzatore che gli allegati terminale danni più postsinaptiche e conduce agli elementi postsinaptici di essere esposto a i media e pochissimi essere racchiuso da membrana è ancora intatta. Lavoro significativo è focalizzata sulla sintesi proteica nel post-sinaptica densità di 11-13, ma poco è stato fatto per studiare la sintesi delle proteine ​​nei compartimenti presinaptico. Tuttavia, vi è evidenza che la sintesi proteica avviene nei terminali presinaptici. 7-10 Come si può vedere nel microscopio elettronico della SN, allegati pre-e post-sinaptici esiste nella preparazione SN che li rende un sistema ideale per gli studi successivi di attività traslazionale in entrambi i comparti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Micro BCA Protein Assay Kit </td><td> Perforare </td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Pescatore </td><td> C79-500 </td><td></td></tr><tr><td> Gas CO 2 </td><td> Airgas (UW-MDS) </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td> EtOH </td><td> Pescatore </td><td> A407SK-4 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Pescatore </td><td> A142-212 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Pescatore </td><td> P285-500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS-PAGE kit di preparazione del campione </td><td> Perforare </td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Pescatore </td><td> BP328-500 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 PHO 4 </td><td> Pescatore </td><td> S381-500 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrodotossina </td><td> Sigma </td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td> Esprimere Label Pro Mix S35 Tag Facile </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th> Attrezzatura </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Strumenti di dissezione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dounce omogeneizzatore, 7 ml (vetro viene fornito con due pestelli etichetta &quot;A&quot; e &quot;B&quot;) </td><td> Wheaton </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000 Gilson Pipetman </td><td> Gilson </td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td> Allegra 6KR Centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3,8 rotore, rotore oscillante </td><td> Beckman Coulter </td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td> Beckman J2-21 Centrifuga </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Beckman tubi con tappi </td><td> Beckman </td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td> Bianco adattatori murata </td><td> Beckman </td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td> Blu adattatori murata </td><td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA-17 Rotor, Rotore ad angolo fisso </td><td> Beckman </td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella di anticorpi utilizzati per Western blot: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome di anticorpi </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Specie Host </th><th> Fattore di diluizione </th></tr><tr><td> β-Actina </td><td> Sigma </td><td> A5441 </td><td> mouse </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-65343 </td><td> mouse </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-134509 </td><td> coniglio </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-7298 </td><td> mouse </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-6261 </td><td> capra </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-28259 </td><td> coniglio </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td> Millipore </td><td> MAB1596 </td><td> mouse </td><td> 5 mcg / mL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td> AbCam </td><td> ab5666-100 </td><td> coniglio </td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> Sinaptofisina </td><td> Millipore </td><td> MAB368 </td><td> mouse </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β-3-tubulina </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-80016 </td><td> mouse </td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient

Synaptoneurosomes (SN) si ottengono dopo omogeneizzazione e frazionamento della corteccia cerebrale del mouse. Sono risigillati vescicole o terminali isolati che rompere con terminali dell&#39;assone quando il tessuto corticale è omogeneizzato. La SN mantengono caratteristiche di pre-e post-sinaptici, che li rende utili per lo studio della trasmissione sinaptica. Essi conservano le macchine molecolari utilizzati nella segnalazione neuronale e sono capaci di captazione, stoccaggio, e il rilascio di neurotrasmettitori. La produzione e l&#39;isolamento di SN attivo può essere problematico media usando come Ficoll, che possono essere citotossici e richiedono estese a causa di centrifugazione ad alta densità, e la filtrazione e metodi di centrifugazione, che può portare a bassa attività a causa di danni meccanici del SN. Tuttavia, l&#39;uso discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti di densità per isolare SN offre un metodo rapido per produrre buone rese di SN traduzionali attivo. Il Percoll-saccarosio metodo del gradiente è veloce e gentile come impiega condizioni isotoniche, ha un minor numero di giri centrifugazione e più brevi ed evita le fasi di centrifugazione che SN pellet e provocare danni meccanici.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Un metodo per preparare traduzionali attivo, synaptoneurosomes intatto (SN) da topo corteccia cerebrale è descritto. Il metodo utilizza un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente di densità che permette per la preparazione veloce di SN attivo.

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.4K Views.  University of Wisconsin. Un metodo per preparare traduzionali attivo, synaptoneurosomes intatto (SN) da topo corteccia cerebrale è descritto. Il metodo utilizza un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente di densità che permette per la preparazione veloce di SN attivo.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell&#39;orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine ​​densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

Indagare la funzione di Deep corticale e strutture sottocorticali Usando stereotassica Elettroencefalografia: gli insegnamenti della corteccia cingolata anteriore

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...