Questo lavoro è finanziato dal National Institutes of Health di Grant R01-EB 008836 e R01 HL083895 (sia per LEN). Si potrebbe ringraziare Daryl Smith, il Vetraio Università, per rendere il bioreattori per la nostra ricerca.

Autoclave Assemblare e autoclave i tubi per il sistema di flusso e dei componenti bioreattore (bioreattore stesso e il coperchio tappo in silicone), come indicato in Figura 1 e Figura 2. Tubo di alimentazione ha un connettore maschio da un lato e una fine aperta sull&#39;altro lato. Tre segmenti di tubo corto vengono inseriti attraverso un tappo in silicone per lo scambio di gas. 1. Cucire PGA Mesh <ol><li> Tagliare PGA mesh per 1,1 centimetri x ~ fogli da 8 cm (a seconda della dimensione bioreattore). </li><li> Tubi di silicone pulito (3 mm di diametro interno) con acqua distillata (dH20) e asciugare prima dell&#39;uso. </li><li> Usa Dexon 6,0 sutura a cucire PGA mesh attorno al tubo di silicone pulito a partire da tre nodi chirurgica seguita da singoli punti di sutura. </li></ol> 2. PGA Ponteggi Trattamento delle superfici <ol><li> Dip ponteggi PGA in NaOH 1M per 1-2min e registrare il tempo di trattamento e l&#39;uso stesso tempo per tutti i ponteggi PGA. </li><li> Sciacquare ponteggi PGA nei bagni dH2O per 2 minuti 3 volte. </li><li> Pat PGA ponteggi a secco con Kimwipes tra ogni tuffo nella dH O 2 bagni. </li><li> Secco PGA ponteggi sotto il cofano di coltura tissutale asciugare all&#39;aria per 15 minuti con il ventilatore. </li></ol> 3. Braccia Dacron da cucire <ol><li> Usa Prolene sutura 4,0 a cucire piccoli pezzi di polsini Dacron (1 cm) su ogni estremità della rete PGA con una sovrapposizione di 2-3mm. Nota: non stare attento a forare tubi di silicone (Figura 3). </li><li> Utilizzare la sutura stessa a cucire tre punti verso la fine senza polsini Dacron. Assicurarsi di lasciare abbastanza suture alle estremità libera di sutura Prolene per la fase 5.1 (Figura 3). </li></ol> 4. Assemblea dei bioreattori (giorno prima dell&#39;inizio della cultura bioreattore) <ol><li> Immergere maglia cucita e tubi in silicone, strumenti chirurgici, e un filo sottile in un bagno di etanolo al 70% per 20-30 minuti. </li><li> Aprire i sacchetti autoclave contenente il bioreattore e immergerlo in bagno etanolo al 70% per almeno 30 minuti prima del montaggio. Assicurarsi di lavare il bioreattore a fondo con l&#39;etanolo. L&#39;esposizione di tutti i componenti bioreattore al 70% di etanolo è un passo oltre la sterilizzazione. Questa operazione rimuove anche endotossina, che non viene rimosso in autoclave ed è nociva per le cellule vascolari. </li><li> Tirare tubo in silicone con bracci laterali con filo sottile di tirare fino in fondo. </li><li> Prendete bioreattore da bagno etanolo (tenere in rete sommersa in etanolo). Fissare il patibolo PGA all&#39;interno del bioreattore serrando polsini Dacron sopra le labbra bicchiere svasato stringendo e legando le suture Prolene (Figura 3). </li><li> Collegare un lato di armi bianche bioreattore ai connettori tramite tubo in silicone. </li><li> Tirare dall&#39;altra parte di tubo in silicone con tensione sufficiente e inserire i restanti due connettori in tubo in silicone. Mantenere il tubo in silicone strettamente quando si inseriscono i connettori! </li><li> Bioreattore reinserire in bagno a filo con etanolo e l&#39;etanolo tirando delicatamente connettori fuori dei bracci laterali. </li><li> Capovolgere bioreattore più e consentono un ammollo per 10 minuti. </li><li> Bioreattore flip lato destro in alto e prendere per altri 10 minuti. </li><li> Scaricare tutto l&#39;etanolo. </li><li> Creato tre grandi piatti di Petri (10 cm) in serie e bioreattori posto nel piatto centrale a tenere l&#39;etanolo in eccesso gocciolava dalle estremità dei tubi. </li><li> Flush bioreattori e PGA rete con acqua di coltura con una pipetta da 5 ml o 10 ml. Anche a livello della cultura dell&#39;acqua presente nei tessuti in tubo in silicone. </li><li> Accuratamente tutta l&#39;acqua di scarico in eccesso in piastre Petri su entrambi i lati del bioreattore. </li><li> Bioreattore asciugare durante la notte in cappa con ventilatore acceso e spento UV. </li><li> Note aggiuntive: assicurarsi ancoretta sterile è in bioreattore. Fare attenzione a non &quot;hover&quot; sopra il bioreattore da questo punto in avanti, per evitare contaminazioni. Tagliare un sacco di strisce parafilm e ammollo in una piccola vasca etanolo al 70% (grandi Petri funziona bene). </li></ol> 5. Giorno 1: installazione Bioreattore <ol><li> Inserire una piastra di Petri sterile oltre all&#39;apertura di ogni bioreattore per proteggere l&#39;interno PGA patibolo da sostanze contaminanti. </li><li> Assemblare sistema a flusso di bioreattore come indicato in Figura 4 e parafilm tutti i giunti di collegamento. <ol><li> Pulire i connettori prima con cotone imbevuto di alcol. </li><li> Fissare porta di iniezione a terzi, braccio inutilizzati di bioreattore. </li><li> Rimuovere il tubo di tricheco e legare fine blu della diluizione salina impostato come vicino al raccordo a Y possibile. Tirare fascetta in atto per garantire l&#39;assenza di trasferimento di liquidi a questa parte del tubo </li><li> Rimuovere borsa IV, e allegare tubi tricheco (rosso) di gran lunga fine di borsa IV. Assicurarsi di pulire porta di inserimento con batuffolo imbevuto di alcool prima. </li><li> Attaccare tricheco da un lato del sistema di flusso (tramite tubo estremità bianca). </li><li> Inserire 3-way rubinetto nel sistema di flusso. </li><li> Rimuovere trasduttore di pressione e la connessione a tre vie rubinetto. </li><li> Collegare altra estremità del trasduttore di pressione per l&#39;apertura centrale nella borsa. </li></ol></li><li> Collegareil bioreattore al sistema che attraverso lo Y-giunzione. Utilizzare una siringa da 60 ml per aggiungere 350ml di 1 Fungizone% (5 ml Fungizone mescolare con 495ml di PBS) per borsa IV. </li><li> Spremere borsa IV per sciacquare il sistema che scorre regolando la rubinetti arresto per consentire il flusso di PBS. Nota: controllare all&#39;interno bioreattore per assicurare che non si perde. </li><li> Risospendere 8 x10 6 SMC (circa un confluenti T75) in 1.25ml di medie e di semi su ogni scafffold PGA. Assicurarsi sospensione cellulare è stata uniformemente sgocciolava sul reticolo Dacron giunzione PGA così come sul lato inferiore del PGA mesh. </li><li> Pulire bordo del bioreattore con batuffolo imbevuto d&#39;alcol attraverso la rotazione del bioreattore lateralmente evitare bilico. </li><li> Coperchio tappo in silicone di montaggio (Figura 2) <ol><li> Peel borsa autoclave indietro attentamente, facendo attenzione a non esporre fondo del coperchio. </li><li> Fissare porta di iniezione a tubo di alimentazione al connettore maschio. </li><li> Allega PTFE 0,20 micron filtri a ciascuna delle tre porte d&#39;aria. </li><li> Fare attenzione a non esporre / toccare il fondo del coperchio durante questo processo. </li><li> Parafilm la porta di iniezione. </li></ol></li><li> Inserire il coperchio tappo in silicone in bioreattore in vetro e assicurarsi che il tubo di alimentazione all&#39;interno del bioreattore non tocca la ponteggi PGA seminato. Parafilm tutto il coperchio. </li><li> Luogo bioreattore con il sistema di flusso all&#39;interno dell&#39;incubatore (su un lato) e ruotare il bioreattore ogni 5 minuti per 25-30 minuti. </li><li> Riempire la camera bioreattore con 400 ml del nostro 4-10 terreni di coltura, come descritto nella (Tabella 1). Questo terreno di coltura è &quot;ottimizzato&quot; per le arterie suina ingegnerizzati. </li></ol> 6. Giorno 6-7: Accensione della pompa, e prima alimentazione <ol><li> Crescono i ponteggi seminato staticamente senza pulsatile di pompaggio attraverso il tubo in silicone per 6-7 giorni. Non c&#39;è bisogno di cambiare mezzo o la supplementazione di vitamina C durante questo periodo. </li><li> Assicurarsi che non vi siano perdite di PBS o attorcigliamento del tubo di flusso del sistema prima di attivare la pompa. </li><li> Accendere la pompa del sistema di flusso e assicurarsi di regolare le impostazioni della pompa in modo che la pressione si legge circa 270/-30mmHg. </li><li> Pressioni registrare ogni giorno in tutta la cultura e mantenere la pressione a 270/-30mmHg. Trasduttore di pressione può essere collegato a un computer per leggere e monitorare la pressione. </li></ol> Alimentazione prima <ol start="5"><li> Montare iniezione indiretta e PTFE filtro sulla alimentazione coperchi sia per il cambiamento medio e medio deposal scopi rifiuti. </li><li> Posizionare il tubo di alimentazione saldamente sulla pompa e inserirne l&#39;estremità all&#39;alimentazione porta del bioreattore e l&#39;altra estremità al coperchio di alimentazione. Assicurarsi di pulire le porte di iniezione con salviette etanolo. </li><li> Utilizza un processore dual-direzionale pompa Masterflex per pompare fuori 200 ml di mezzo. Quindi utilizzare un nuovo tubo di alimentazione alla pompa 200 ml di terreno fresco di nuovo nel bioreattore. Iniziano sempre con una velocità molto lenta, soprattutto quando si pompano ritorno medio del bioreattore. </li><li> Cambiamenti a medio e acido ascorbico 2x/sett supplemento. Per aggiungere acido ascorbico, utilizzare una siringa 30ml per eliminare 25ml di media e riporla nel cappuccio di tessuto. Sciogliere 25 mg di acido ascorbico in 5 ml di PBS e filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. In primo luogo iniettare l&#39;acido ascorbico sterile nel tubo di alimentazione e aggiungere nuovamente il medium 25ml presi in precedenza. La ricetta di media è riportata nella Tabella 1. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. I tubi e connettori per l&#39;assemblaggio del sistema di flusso è mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Il tappo in silicone montaggio coperchio è mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Schemi di montaggio bioreattore sono indicati sopra. All&#39;interno del polsini Dacron bioreattore sono fissati sulle braccia di vetro con i nodi di sutura blu. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Sistema a flusso collegato a tubi e bioreattore è mostrato sopra. L/S18 tubi sarà pompata da una pompa Masterflex e quindi guida il flusso. Il trasduttore di pressione misura la pressione prima di entrare nel bioreattore a flusso superiore. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Immagine di raccolta nave progettata. Vasi Progettato apparirà opaco e raggiungere uno spessore di circa 250μm dopo 8 settimane di cultura in condizioni pulsatile. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Ematossilina ed eosina macchiato sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono di 8 settimane non-pulsato e pulsata navi, rispettivamente.C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. L indica il lato del lume dei vasi. La barra di scala è 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Figura 7"/> Figura 7. Masson tricromica macchie per il collagene (blu) per le sezioni trasversali dei vasi ingegnerizzati. A e B sono 8 settimane di imbarcazioni non a impulsi e ad impulsi, rispettivamente. C e D sono vasi non-pulsato e ad impulsi di 4 settimane, rispettivamente. Si noti che le 4 settimane di nave pulsata mostra più collagene rispetto al suo non-pulsato controparte. Frecce bianche indicano ancora frammenti PGA nei vasi. La barra di scala è 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Colorazione immunochimica dei marcatori SMC nei bovini arterie artificiali. Muscolo liscio α-actina, calponina-1, e liscia la catena pesante della miosina muscolare (SMMHC) sono primi, intermedio e in ritardo marcatori SMC contrattile, rispettivamente. Entro la fine di 12 settimane di cultura, le cellule della parete dei vasi esprimere SM α-actina e moderate quantità di Calponin-1 e SMMHC. La barra di scala è 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> DMEM (DME / bassa modificato) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (siero fetale bovino) inattivato con il calore </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamina C (sciolto in PBS o DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycine / Alanina 25 mg/25 mg/10 mg (sciolta in 5 ml di PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 mcg (sciolto in1 ml di PBS) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Penicillina G a 10.000 unità / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (derivato dalle piastrine fattore di crescita-BB) a 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti) a 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Componenti di media &quot;4-10&quot; sono riportati nella tabella sopra riportata. Con l&#39;eccezione di PDGF-BB e bFGF, tutti gli altri componenti devono essere filtrate attraverso un filtro 0.2μm prima dell&#39;uso.

<ol>
	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La qualità delle navi ingegneria è in gran parte dettata dalla qualità della SMC utilizzati in coltura. Gli aspetti critici del fenotipo SMC comprendono morfologia contrattile, numero passaggio basso, e la capacità di proliferare all&#39;interno del bioreattore. Si raccomanda che il numero passaggio essere superiore a P3, al momento della semina di cellule sul patibolo polimero. Inoltre, è fondamentale per confermare che i sorgenti di SMC sono liberi micoplasma prima dell&#39;uso. Abbiamo osservato che il micoplasma contaminati da cellule portare ad una sostanziale diminuzione nella proliferazione cellulare e la matrice deposizione di collagene nella cultura bioreattore. Più di 400.000 innesti delle arterie coronarie sono necessità di operazioni di bypass ogni anno, con una conseguente forte domanda di piccolo diametro (&lt;6 mm) innesti vascolari 12. L&#39;obiettivo finale è quello di ingegnere funzionale vasi di piccolo diametro che simulano le funzioni fisiologiche del tessuto nativo. Il nostro sistema di bioreattori pulsatile è uno strumento promettente per costituire funzionale innesti arteriosi che potrebbe ripristinare e sostituire le arterie malate. In un ambiente chimicamente e meccanicamente controllato, il bioreattore ci permette di ingegnere impiantabili di piccolo diametro vasi che presentano una forte ritenzione di sutura ed eccellenti proprietà meccaniche. Il sistema di bioreattore pulsatile può essere utilizzato per ricostruire le arterie di bovini 3, suini 6,7, e 9 cellule umane in vari formati e dimensioni, rendendo questo sistema generalizzabile e versatile. Inoltre, abbiamo modificato il nostro bioreattore per consentire in tempo reale immagini di vascolare matrice extracellulare, in modo non invasivo 8. Un approccio combinato del nostro bioreattore, tecniche non invasive di imaging microscopia, e avanzate valutazioni biomeccaniche ci aiuterà a capire e valutare la deposizione di ECM e le variazioni vascolari caratteristiche meccaniche nel tempo. Pertanto, questo sistema bioreattore fornisce un approccio unico alla ingegnere innesti vascolari biologico-based, che può giocare un ruolo importante nella rigenerazione vascolare innesti autologhi in futuro applicazioni cliniche 10,11.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / materiale </th><th> Fornitore </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> FBS (Fetal Bovine Serum) inattivato per calore </td><td> Hyclone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-base </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> Sigma </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-Alanina </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Silicone Stopper </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex tubi L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron bracciale </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA feltro </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1,5 metrico Surgipro II sutura </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0,7 sutura Dexon metrico </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filtri </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Three Way rubinetto </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Trasduttore di pressione </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV borse </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Diluizione di Saline </td><td> Freccia </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Tubi di silicone </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

Molti sforzi sono stati dedicati a sviluppare e far progredire la metodologia per la rigenerazione funzionale di piccolo diametro bypass arterioso. In ambiente fisiologico, sia la stimolazione meccanica e chimica sono tenuti a mantenere il corretto sviluppo e la funzionalità dei vasi arteriosi 1,2. Sistemi di coltura bioreattore sviluppato dal nostro gruppo sono stati progettati per sostenere la rigenerazione all&#39;interno di una nave controllata con precisione chemio-meccanico ambiente imitando quella dei vasi nativi. La nostra assemblea bioreattori e procedure di manutenzione sono abbastanza semplici e altamente ripetibili 3,4. Cellule muscolari lisce (SMC) sono seminate su un acido poliglicolico tubolare (PGA) maglia che viene infilato nel tubo in silicone compatibile e colta nel bioreattore, con o senza stimolazione pulsatile per un massimo di 12 settimane. Ci sono quattro caratteristiche principali che contraddistinguono la nostra bioreattore da alcuni predecessori. 1) A differenza di altri sistemi di coltura che simulano soltanto la biochimica dei vasi sanguigni circostanti nativi, il nostro bioreattore crea anche un ambiente fisiologico pulsatile applicando ciclica deformazione radiale dei vasi nella cultura. 2) Più imbarcazioni progettate possono essere coltivate simultaneamente in diverse condizioni meccaniche all&#39;interno di un ambiente chimiche controllate. 3) Il bioreattore permette una mono strato di cellule endoteliali (CE) per essere facilmente rivestiti sul lato luminale dei vasi progettato l&#39;impianto per i modelli animali. 4) Il nostro bioreattore può anche recipienti di coltura progettata con dimensioni di diverso diametro varia da 1 mm a 3 mm, risparmiando lo sforzo di adattare ogni singolo bioreattore per adattarsi a una dimensione specifica diametro. I vasi progettati colta nel nostro bioreattore assomigliano vasi sanguigni nativo istologicamente in una certa misura. Cellule nelle pareti dei vasi esprimere maturo marcatori SMC contrattili come catena pesante della miosina del muscolo liscio (SMMHC) 3. Una notevole quantità di collagene si deposita all&#39;interno della matrice extracellulare, che è responsabile per la massima resistenza meccanica dei vasi progettati 5. Analisi biochimica indica anche che il contenuto di collagene dei vasi ingegnerizzati è paragonabile a quella delle arterie native 6. È importante sottolineare che il bioreattore pulsatile ha costantemente rigenerato navi che presentano proprietà meccaniche che permettono l&#39;impianto esperimenti di successo in modelli animali 3,7. Inoltre, questo bioreattore può essere ulteriormente modificato per consentire in tempo reale valutazione e monitoraggio del rimodellamento del collagene nel corso del tempo, non invasivo, usando una non lineare microscopia ottica (NLOM) 8. Per concludere, questo bioreattore dovrebbe servire come una piattaforma eccellente per studiare i meccanismi fondamentali che regolano la rigenerazione funzionale di protesi vascolari di piccolo diametro.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor at JoVE.com

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.0K Views.  Yale University. Il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di coltura bioreattore che imita lo stress pulsatile fisiologica del sistema cardiovascolare per rigenerare impiantabili protesi vascolari di piccolo diametro.

Video: Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS elastomerico Ponteggi in Ingegneria tessuto arterioso

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Ricerca

Bioingegneria

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Ingegneria

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Scaling di Engineered vascolari innesti Usando 3D Stampato Guide e il metodo di impilamento Anello

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized microfluidic multimateriali per l'ingegneria dei tessuti e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Un nuovo bioreattore stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious surgical and pharmacological interventions to prevent and treat vascular disease are urgently needed. In part, the shortage of translational models limits the understanding of the cellular and molecular processes involved in vascular disease. Ex vivo perfusion culture bioreactors provide an ideal platform for the study of large animal vessels (including humans) in a controlled dynamic environment, combining the ease of in vitro culture and the complexity of the live tissue. Most bioreactors are, however, custom manufactured and therefore difficult to adopt, limiting the reproducibility of the results. This paper presents a 3D printed system that can be easily produced and applied in any biological lab, and provides a detailed protocol for its setup, enabling users&#39; operation. This innovative and reproducible ex vivo perfusion culture system enables the culture of blood vessels for up to 7 days in physiological conditions. We expect that adopting a standardized perfusion bioreactor will support a better understanding of physiological and pathological processes in large animal blood vessels and accelerate the discovery of new therapeutics.

Autore in primo piano: EasyFlow - Un bioreattore di perfusione economico e adattabile per la coltura di grandi vasi sanguigni 

This protocol presents the setup and operation of a newly developed, 3D printed bioreactor for the ex vivo culture of blood vessels in perfusion. The system is designed to be easily adopted by other users, practical, affordable, and adaptable to different experimental applications, such as basic biology and pharmacological studies.

Ex Vivo Coltura di perfusione di grandi vasi sanguigni in un bioreattore stampato in 3D

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious ...

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video