Gli autori vorrebbero riconoscere il Lynn e Mike Garvey Imaging Laboratory presso l&#39;Istituto per cellule staminali e la medicina rigenerativa, nonché il Fondo di Washington Nanofabbricazione presso l&#39;Università di Washington. Essi riconoscono anche il sostegno finanziario del National Institute of Health concede DP2DK102258 (a YZ), e la formazione concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Microvasi ingegnerizzati sono un modello in vitro in cui sono presenti e sintonizzabile caratteristiche fisiologiche come la geometria luminale, forze idrodinamiche, e le interazioni multi-cellulari. Questo tipo di piattaforma è potente in quanto offre la possibilità di modellare e studiare il comportamento endoteliale in una varietà di contesti in cui le condizioni di coltura in vitro in può essere abbinata a quella del microambiente in questione. Ad esempio, i meccanismi di guida processi endoteliali, come angiogenesi, sono noti a verificarsi in modo diverso in diversi organi e in diversi stati patologici, quali la salute e la malattia 44. Per questo motivo, coltura cellulare endoteliale planare è costantemente inadeguata 6 e come tale il campo ha fatto affidamento su modelli animali lungo e costoso. I modelli animali, mentre informativo ed essenziale per il progresso della ricerca biologica, non sempre si traducono bene alla clinica.Questo è stato in gran parte attribuito alle differenze tra murine e biologia umana, in particolare per quanto riguarda la loro risposta agli stimoli 9,45. E &#39;quindi essenziale per essere in grado di costruire modelli in vitro che possono fornire dati specifici umane supplementari per integrare le informazioni raccolte da modelli animali. In vitro piattaforme hanno il potenziale per imitare il microambiente di interessi con la capacità aggiuntiva per accordare tale ambiente. Caratteristiche chiave di un tale sistema dovrebbe includere struttura tridimensionale e la geometria, composizione della matrice extracellulare (ECM), la vicinanza delle cellule parenchimali e l&#39;interazione, il flusso di sangue, e gli stimoli biochimici. microvasi Engineered hanno la capacità di incorporare tutti questi parametri. Questo può essere fatto contemporaneamente per creare un modello onnicomprensivo, o aggiunti in modo saggio passo per isolare le risposte individuali e interazioni. Un aspetto potente di microvasi ingegnerizzati è la capacità diflusso di controllo e manipolare le forze idrodinamiche esercitate sull&#39;endotelio. Come esempio, il dispositivo può essere coltivato in gravità guidato condizioni di flusso o con perfusione continua (Figura 2). L&#39;entità dello sforzo di taglio sulla parete del vaso può essere modulata in entrambe le condizioni mediante cambiamenti nella portata e la geometria del serbatoio. La differenza principale tra le due condizioni è la distribuzione temporale della sollecitazione di taglio entro il recipiente. In gravità guidato condizioni di flusso, la sollecitazione di taglio non è costante nel tempo. La portata e la sollecitazione di taglio sono più elevati immediatamente dopo una modifica del supporto quando il serbatoio è pieno di ingresso. Come i canali di scolo dei media, la sollecitazione di taglio diminuirà. Questo porta ad una serie di sollecitazioni di taglio nel corso di 12 ore. Esperimenti che richiedono un controllo preciso sulle proprietà idrodinamiche (ad esempio, per studiare gli effetti di sollecitazione di taglio sulla endotelio) dovrebbero utilizzare condizioni di coltura flusso continuo. Emicrovasi ngineered possono essere adattati per rispondere a una vasta gamma di domande con relativamente semplici modifiche. Diversi tipi di cellule, sia parenchimale e endoteliale, possono essere utilizzate per modellare sistemi di diversi organi. Oltre a fabbricare microvasi con semina delle cellule endoteliali, cellule epiteliali possono invece essere utilizzati per rivestire il canale per studi relativi alla mucosa intestinale, alveoli polmonari, tubulo renale, ecc. Una volta che il microambiente è definita da composizione cellulare, la soluzione nutritiva (cioè, media, sangue, fattori di crescita, o altro fluido biologicamente rilevante) che viene utilizzato per perfusione dispositivo può essere modificato per rispondere a domande complesse circa segnalazione cellulare, quiescenza, shear stress , nutrienti, risposta ai farmaci, e altro ancora. Inoltre, la geometria del vaso può essere specificamente progettato per investigare risposta endoteliale alle sollecitazioni di taglio e tortuosità. Come esempio, una recente pubblicazione da Zheng et. al. hanno dimostrato che le cellule endoteliali hanno increasEd VWF la secrezione e l&#39;assemblaggio di fibre nelle regioni microvasi con elevato sforzo di taglio e l&#39;accelerazione del flusso. In particolare, VWF bundle tipicamente formata in angoli e curve a gomito all&#39;interno della rete. La geometria di rete può anche essere progettato per fabbricare tubuli multicellulari. Ad esempio, un disegno che contiene due canali paralleli ciascuno con il proprio ingresso e uscita potrebbe essere usato per generare un gradiente di concentrazione o per modellare un ambiente tubulo adiacente (ad esempio, vaso linfatico con microvasi adiacente). Le strutture a griglia di disegni rete correnti (mostrati nella Figura 1A-C) sono vantaggiosi per la modellazione computazionale di fluido e per l&#39;integrità strutturale durante la fabbricazione, ma non sono indicativi della struttura vascolare nel corpo. In studi futuri, dovrebbero essere utilizzati i modelli di rete più fisiologici, quali quelli con ramificazione gerarchica e angoli arrotondati. Mentre tutti i passaggi descritti in questa procedura sono importanti, cisono diversi passaggi critici che sono necessari per il successo la fabbricazione dei microvasi ingegnerizzato. Il gel di collagene deve essere miscelato con cura per ottenere una soluzione omogenea, ed è essenziale non introdurre bolle durante questa fase. Ciò è essenziale per la vitalità delle cellule e la funzione fisiologica, particolarmente per gli esperimenti che includono cellule parenchimali nella matrice di collagene. Se una miscela uniforme del collagene è difficile da ottenere, controllare il pH della soluzione per assicurarsi che sia neutra. Se il problema persiste, è possibile che il collagene magazzino deve essere sostituito. Un altro passo importante è l&#39;assemblaggio dei pezzi superiore e inferiore delle abitazioni - è fondamentale non usare forza eccessiva in quanto ciò può causare i canali a crollare. Diversi giri di pratica possono essere necessari per ottenere un senso della quantità di forza necessaria per applicare ruotando viti. Se il canale crollo o Smashing continua a verificarsi anche dopo le prove, è possibile la rete di PDMS è diventato deformato a causa di absorptione di umidità. A partire con stampi PDMS appena fatte aiuterà a risolvere questo problema. fori filettati non correttamente nel dispositivo di fondo può anche causare il collasso del canale. Se le viti non sono in grado di ruotare agevolmente durante il montaggio, forza aggiuntiva deve essere applicata spesso con conseguente cedimento strutturale. L&#39;ultimo passo fondamentale che deve essere sottolineato è l&#39;importanza di poppate frequenti, in genere ogni 12 ore. Ciò è essenziale per mantenere l&#39;endotelio e impedendo il dispositivo si secchi. Nel caso in cui seminate cellule endoteliali appaiono insalubri o staccano dalla parete collagene, potenziali modi per migliorare la salute endoteliale sono per alimentare i vasi più spesso, utilizzare una pompa a siringa per applicare flusso continuo, o controllare il pH del gel di collagene per assicurare che è ad un livello fisiologico. Attualmente, questa piattaforma è limitato alla fabbricazione di matrice extracellulare rigidità appropriate per mantenere l&#39;integrità strutturale del canale durante il montaggio. co densellagen uguale o maggiore di 6 mg / ml è sufficiente, ma collagene meno di 6 mg / ml e altre matrici come matrice decellularized da organi interi sono troppo deboli. Questo può essere superato utilizzando una miscela di collagene con la matrice in questione. microvasi ingegnerizzati sono anche limitati dalla loro scala di calibro. Le navi possono essere fabbricate ad un limite inferiore di circa 100 um, ma dovrebbero essere applicate per ottenere una scala più piccola modifiche sostanziali. Sebbene microvasi ingegnerizzati creano un tre lume dimensionale, la rete stessa è planare. Per creare un plesso vascolare veramente tridimensionale, ulteriori modifiche dovrebbero essere applicate come la creazione di una rete multistrato impilando più vasi ingegnerizzati. I risultati rappresentativi presentati in questo metodo dimostrano come microvasi Engineered può essere utilizzato per valutare la funzione di barriera, la segnalazione cellula-cellula (assunzione periciti e stabilizzazione vascolare), angiogenesi, e trombosi. highlicombatte di questi studi sono presentati qui con le presentazioni più dettagliate in precedenti pubblicazioni 31,32. Questi studi mostrano come periciti migrano e cappotto l&#39;endotelio dei microvasi ingegnerizzati 31, le piastrine aderiscono alla endotelio attivato 31, e il fluido shear stress modula attivazione endoteliale e VWF la secrezione e di montaggio 32. Microvasi Engineered possono inoltre essere utilizzate per costruire i tessuti vascolarizzati e sistemi organo-specifiche modello, come il rene 33 o cuore 34. La capacità di replicare queste interazioni sangue-endotelio fisiologiche e sintonizzare il microambiente rispetto alle sollecitazioni di taglio, geometria, ECM e composizione cellulare consentirà futuri studi di malattie vascolari.

Il microcircolo in ogni organo aiuta a definire il microambiente del tessuto, mantenere l&#39;omeostasi tissutale e regolare l&#39;infiammazione, la permeabilità, la trombosi, e fibrinolisi 1,2. Endotelio microvascolare, in particolare, è l&#39;interfaccia tra il flusso di sangue e di tessuto circostante e svolge quindi un ruolo fondamentale nella modulazione vascolare e la funzione degli organi in risposta a stimoli quali forze idrodinamiche e citochine circolanti e ormoni 3 - 5. La comprensione delle interazioni approfondite tra l&#39;endotelio, sangue e il microambiente tessuto circostante è importante per lo studio della biologia vascolare e la progressione della malattia. Tuttavia, i progressi nello studio di queste interazioni è stato ostacolato dalla limitata in vitro strumenti che non ricapitolano nella struttura microvascolare vivo e funzionano 6,7. Come risultato, il campo e il progresso terapeutico è affidato molto costoso e tempo-consumare modelli animali, che spesso non riescono a tradurre in successo negli esseri umani 8 - 10. Mentre modelli in vivo sono preziosi nello studio dei meccanismi di malattia e funzioni vascolari, sono complessi e spesso non preciso controllo dell cellulari, biochimici e biofisici spunti. Vascolarizzazione in tutto il corpo possiede una struttura gerarchica maturo in collaborazione con letti capillari espansive, fornendo perfusione ottimizzato e trasporto dei nutrienti simultaneamente 11. Inizialmente, le forme vascolarizzazione come un plesso primitiva che riorganizza a una rete ramificata gerarchicamente durante lo sviluppo precoce 12,13. Sebbene molti dei segnali coinvolti in questi processi sono ben comprese 14 - 16, rimane elusiva come tale modello vascolare viene determinato 15. A sua volta, ricapitolando questo processo in vitro per progettare reti vascolari organizzate ha apen. Molte piattaforme difficili esistenti in vitro per modellare vascolare, come due colture di cellule endoteliali dimensionali, mancano caratteristiche importanti quali la vicinanza multicellulare, tre geometria tridimensionale luminale, flusso, e la matrice extracellulare. Saggi del tubo di formazione in idrogel 3D (collagene o di fibrina) 17 - 19 o invasione saggi 20,21 sono stati utilizzati per studiare la funzione endoteliale in 3D e le loro interazioni con altri vascolari 17,22 o di cellule del tessuto tipo 23. Tuttavia, assemblati lumen in questi saggi mancano di interconnessione, il flusso emodinamico, e perfusione adeguata. Inoltre, la propensione per la regressione vascolare in questi saggi formazione del tubo 24 impedisce coltura a lungo termine e maturazione che limita il grado di studi funzionali che possono essere eseguite. Pertanto, vi è la necessità crescente di progettare piattaforme in vitro di reti microvascolari che possono opportunamente modellare itendoteliale caratteristiche e sono capaci di coltura a lungo termine. Una varietà di tecniche di ingegneria vascolari sono emerse nel corso degli anni per le applicazioni mediche per sostituire o vasi di bypass colpite nei pazienti con malattia vascolare. Vasi di grande diametro realizzati con materiali sintetici come il polietilene tereftalato (PET), e politetrafluoroetilene (ePTFE) hanno avuto un notevole successo terapeutico con termine pervietà a lungo (in media il 95% pervietà oltre 5 anni) 25. Anche se piccolo diametro innesti sintetici (&lt;6 mm) in genere affrontare complicazioni quali iperplasia intimale e trombopoiesi 26 - 28, di ingegneria tessutale innesti di piccolo diametro realizzati con materiale biologico hanno compiuto progressi significativi 29,30. Nonostante i progressi di questo genere, vasi ingegnerizzati su microscala sono rimaste una sfida. Per modellare adeguatamente il microcircolo, è necessario generare modelli di rete complessa con sufficiente resistenza meccanica a mantenere la pervietà e con una composizione matrice che permette sia permeazione nutrienti per le cellule parenchimali e rimodellamento cellulare. Questo protocollo rappresenta una rete di vasi romanzo artificiale perfusable che imita un nativo in vivo impostazione con un sintonizzabile e controllabile microambiente 31 - 34. Il metodo descritto genera microvasi ingegnerizzate con diametri dell&#39;ordine di 100 micron. microvasi Engineered sono fabbricati mediante perfusione cellule endoteliali attraverso un canale microfluidica che è incorporato all&#39;interno di tipo morbido collagene idrogel. Questo sistema ha la capacità di generare reti di fantasia con struttura luminale aperto, replicare le interazioni multi-cellulari, modulare la composizione della matrice extracellulare, e applicare fisiologicamente rilevanti forze emodinamiche.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Wafer Fabrication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoGlow Plasma System</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc&amp;nbsp;</td><td>PWM32 Spin Coater&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ABM Contact Aligner</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Step Profilometer</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Resist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>8&quot; silicon wafer</td><td>Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Micro Pattern Generator</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&amp;mu;PG 101</td><td>For generation of photomask</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>Ispropyl alcohol</td><td>Avantor Performance Materials</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (120 x 120 mm, square)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Mixed at 10:1 (w/w)</td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device Fabrication and Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly(methyl methacrylate) (PMMA)</td><td>Plexiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corona Treater</td><td>Electro-Technic Products, Inc.</td><td>BD-20</td><td>Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds</td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller&amp;nbsp;</td><td>WTCPS</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel dowel pins</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers&amp;nbsp;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>Any similar tweezers may be used</td></tr><tr><td>Spatula (Micro Spoon)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>Screw driver</td><td></td><td></td><td>Any flat head screwdriver may be used, autoclaved</td></tr><tr><td>Glass coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>4460030966</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (150 x 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (100 x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces</td><td></td><td></td><td>Autoclaved</td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Dilute to 1% in cell culture grade water</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Dilute to 0.1% in cell culture grade water</td></tr><tr><td>Sterile H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Autoclaved DI H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid</td><td></td><td></td><td>Isolated from rat tails as described in Rajan &lt;i&gt;et. al.&lt;/i&gt; 2006 (ref #37)</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>30 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10x Media&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial growth media</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Dextran from Leuconostoc spp. (70&amp;nbsp;kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>18 G Blunt Fill Needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 G Stainless Steel Dispensing Needle</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32&amp;rdquo; ID, 3/32&quot; OD Silicon Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; Tube-to-tube Coupling</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&amp;deg; Elbow Connectors, Tube-to-Tube</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Coupling (Female, 1/16&quot; ID)</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Forceps, with Jaw Grips</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>Dual Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-bottom tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device Analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-hCD31</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>1:25 working dilution</td></tr><tr><td>FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>1:100 working dilution</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit 568 secondary antibody</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>1:100 working dilution</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Resuspended in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium cacodylate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>To make 0.2 M cacodylate buffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa FITC-conjugated Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional Culture Reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>Small molecule GSK-3 inhibitor</td></tr><tr><td>Human recombinant VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant bFGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterning and assembly of 3d microvessels

In piattaforme vitro per studiare le cellule endoteliali e biologia vascolare sono in gran parte limitati a colture di cellule endoteliali 2D, il flusso camere con polimeri o substrati di vetro a base, e saggi di formazione del tubo di idrogel a base. Questi test, mentre informativo, non ricapitolano la geometria del flusso luminoso, matrice extracellulare corretta, e la vicinanza multicellulare, che svolgono un ruolo chiave nel modulare la funzione vascolare. Questo manoscritto descrive un metodo di stampaggio ad iniezione per generare navi ingegnerizzate con diametri dell&#39;ordine di 100 micron. Microvasi sono fabbricati da semina cellule endoteliali in un canale microfluidica incorporato all&#39;interno di un tipo nativo collagene idrogel. Incorporando cellule parenchimali all&#39;interno della matrice di collagene prima di incanalare la formazione, microambienti tessuti specifici possono essere modellati e studiati. Ulteriori modulazioni di proprietà e dei media idrodinamica composizione consentono il controllo della funzione vascolare complessa all&#39;interno del microambiente desiderato.Questa piattaforma permette lo studio del reclutamento perivascolari cellule, interazioni sangue-endotelio, risposta flusso, e le interazioni microvascolotessutali. microvasi Engineered offrono la possibilità di isolare l&#39;influenza da singoli componenti di una nicchia vascolare e precisamente controllare i suoi chimiche, meccaniche e biologiche per studiare biologia vascolare sia in salute e malattia.

La piattaforma nave progettata crea microcircolo funzionale incorporato all&#39;interno di un tipo di collagene naturale I MATRIX e permette di stretto controllo dell&#39;ambiente cellulare, biofisici e biochimici in vitro. Per realizzare microvasi ingegnerizzati, vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) sono perfusi attraverso la rete microfluidica collagene-embedded in cui essi attribuiscono a formare un lume di brevetto e confluenti endotelio. Come illustrato in figura 1A-C, la geometria del serbatoio può essere specificamente progettato per rispondere a domande riguardanti portata, tortuosità, e la ramificazione angoli, tra gli altri. Modulando la portata attraverso i microvasi fornisce una panoramica della shear stress risposta delle cellule endoteliali. In precedenza, fabbricazione attenzione si è concentrata principalmente su navi nell&#39;intervallo 100 micron dimensioni, tuttavia microvasi fino a 500 micron o, in alcuni casi, piccolo come 50 micron di diametro sono stati successfully fatto e colta. Esempi di pervietà a lungo termine sono mostrati come pure la sopravvivenza dei microvasi coltivate sotto flusso per gravità condotto (Figura 2A) e il flusso continuo applicata (Figura 2B). Le proprietà in vivo -come di microvasi ingegnerizzati possono essere dimostrati in diversi modi. Diverse funzioni endoteliali possono essere misurati usando questa piattaforma, compresa la funzione di barriera (figura 3A), le interazioni cellula-cellula e di segnalazione (Figura 3B), e il rimodellamento angiogenica (Figura 3C). Una caratteristica fondamentale di questi microvasi è la loro capacità di rispondere a stimoli infiammatori in maniera biologicamente rilevanti. Questo è meglio dimostrato attraverso la loro interazione con sangue intero in Figura 4A-C dove endotelio non attivato è quiescente (Figura 4B) e endotelio attivato induce formazione di trombi (Figura 4C). Coltivando le cellule endoteliali dei differing origini all&#39;interno di questa piattaforma, è possibile comprendere l&#39;eterogeneità funzionale tra cellule endoteliali da fonti diverse. Figura 5A-C illustra un esempio di questa eterogeneità con due differenti tipi di cellule endoteliali derivati ​​dalle cellule staminali umana che quando coltivate sul display dell&#39;impianto microrecipiente drasticamente differenti fenotipi 41. Con messa a punto dei profili di flusso, la composizione delle cellule, e le condizioni di coltura, microvasi ingegnerizzati forniscono un potente strumento in vitro per studiare biologia endoteliale e microcircolo sia in salute e malattia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di Creazione di reti e il protocollo Microchannel Fabrication. La geometria della rete vascolare può essere configurata specificamente per generare differenti modelli di flusso. A. Per esempio, un progetto ramificato sarà diminuito fltariffe ow vicino al centro (una riduzione di 8 volte in un 3 per 3 griglia) con conseguente regioni di varia shear stress sull&#39;endotelio all&#39;interno dello stesso recipiente 31. B. Una griglia altamente ramificato segue lo stesso principio del modello precedente ma con plesso grandi. Con questo progetto, -1 possono osservare gli effetti di una riduzione del 50 volte il tasso di flusso, con una conseguente riduzione della frequenza di taglio da 10 a 500 sec quando una caduta di pressione di 1.000 Pa viene applicata attraverso la rete 32. C. I disegni più complessi come una rete tortuosa con spigoli vivi 32 possono essere utilizzati per rispondere a domande riguardanti risposta endoteliale interruzioni flusso laminare, che spesso si verificano in contesti patologici 42. Microvasi in queste modelli avranno un diametro di 100 -. 150 micron D. Ci sono tre fasi principali durante microcanali fabbricazione. In primo luogo, la parte superiore della maschera alloggiamento è collocato sulla parte superiore del PDMS modellato muffa rete tale che l&#39;ingresso e l&#39;uscita sono allineate. Collagene I viene quindi iniettato nello spazio chiuso attraverso le porte di iniezione (freccia nera). Tipicamente, una miscela 0,75% collagene I è utilizzato per la fabbricazione. Successful microvasi fabbricazione può essere raggiunto con partire da 0,6% collagene, tuttavia meno dello 0,6% provoca tipicamente insufficiente resistenza meccanica e collasso canale. E. Un sottile strato di collagene viene aggiunto al pezzo inferiore sulla parte superiore del vetrino e appiattito con un altro pezzo PDMS. F. Dopo gelificazione a 37 ° C, i PDMS stampi vengono rimossi e la superiore e inferiore maschere abitative sono avvitate insieme per racchiudere la rete. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54457/54457fig1large.jpg" target="_blank">si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig2.jpg" /> <strong<html> &gt; Figura 2. microvasi coltivate con i profili flusso controllato. A. HUVECs seminati in microvasi coltivate in condizioni di flusso guidato gravità e B. applicata flusso continuo ad una velocità di 3 ml / min. Culture sotto flusso applicata è meglio realizzato con l&#39;aggiunta di 3,5% Destrano ai media che ha dimostrato di stabilizzare microvasi a base di collagene microfluidici esercitando pressioni fisiche all&#39;interno del lume che migliorano la formazione di giunzione, sebbene l&#39;esatto meccanismo di guida questo effetto è chiaro 39 . Microvasi sono state colorate per il CD31 endoteliale proteina giunzione o cluster di differenziazione 31 (rosso) e fattore di von Willebrand (vWF) granuli (verdi). A &#39;, B&#39;. In entrambe le condizioni, HUVECs espresso marcatori endoteliali di giunzioni cellula-cellula e VWF granuli. a &quot;, B&quot;. viste ortogonali mostrano brevetti e lumen arrotondati dopo 6 giorni di coltura.arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig3.jpg" /> Figura 3. Engineered microvasi per lo studio della funzione endoteliale. Un. Funzione di barriera endoteliale può essere valutata dopo perfusione di FITC (fluoresceina isotiocianato) coniugata destrano attraverso le reti (in alto) e la successiva valutazione della sua diffusione nel collagene di massa (in basso). Utilizzando il codice personalizzato, i video delle perfusione possono essere analizzati per tracciare intensità dei pixel su una regione di interesse all&#39;interno della struttura nel corso del tempo per determinare il coefficiente di permeabilità K (micron / sec) della FITC-destrano. Precedenti pubblicazioni di laboratorio hanno dimostrato che la permeabilità di questi vasi ingegnerizzati è paragonabile a quella della ex vivo mammiferi vasi 31,43. B. interazioni delle cellule endoteliali con perivcellule ascular o supporto possono essere analizzati in questa piattaforma modulando la composizione cellulare della matrice di collagene. Qui, un esempio di queste interazioni cellula-cellula può essere visto quando le cellule muscolari lisce sono incorporate all&#39;interno del collagene che circonda i vasi. Dopo 14 giorni di coltura, le cellule muscolari lisce (colorate per actina alfa del muscolo liscio (αSMA) in verde) associato con l&#39;endotelio e estendere i processi lungo la parete del vaso e agiscono come cellule perivascolari come si vede nelle proiezioni ortogonali 31. Immagini come da tabella A e B sono riproduzioni da una precedente pubblicazione 31. C. germinazione angiogenica e il rimodellamento possono essere valutati in microvasi ingegnerizzati modificando il terreno di coltura per includere stimoli angiogenici. Senza stimoli angiogenici, HUVECs mostrano germinazione minima (a sinistra); con stimoli angiogenici (1 micron inibitore piccola molecola di GSK-3, 20 ng / ml fattore di crescita endoteliale vascolare, e 20 ng / ml gro fibroblasti di basewth factor), HUVECs prontamente germogliare nella matrice come si vede in alto verso il basso proiezioni e viste ortogonali (a destra). La lunghezza del germoglio e il numero è facilmente quantificabile con il software ImageJ 41. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54457/54457fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig4.jpg" /> Figura 4. Interazioni sangue-endotelio. Engineered microvasi sono quiescenti e rispondere adeguatamente agli stimoli infiammatori. A. Un non modificato, HUVEC nave colta fotografato vicino all&#39;ingresso mostra forte colorazione CD31 giunzionale (rosso) e un giro, lume aperto. A &#39;. Ortogonale è mostrata vista del lume. B. Quando citrato sangue intero con piastrine CD41a-etichettati (verde) è perfuso attraverso un vaso simile di riposo, ad minimasi osserva coesio delle piastrine (verde) per l&#39;endotelio. C. Con l&#39;esposizione a stimoli infiammatori come forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA, 50 ng / ml) per il supporto, la perfusione dei risultati di sangue intero nella formazione di grandi trombi (CD41a-etichettato, verde) all&#39;interno del canale e adesione dei leucociti (CD45 + etichettato, bianco) alla parete del vaso 31. Immagini visto qui sono tratti da una pubblicazione precedente 31. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54457/54457fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig5.jpg" /> Figura 5. microvasi generato con staminali umane cellulari derivate-EC. Le fonti di cellule endoteliali possono essere utilizzati per generare microvasi ingegnerizzati. All&#39;inizio di quest&#39;anno, Palpant et. al. hanno dimostrato che due distinti sottotipi ocellula cellule derivate f umane staminali embrionali endoteliali può essere ottenuto manipolando Wnt / segnalazione β-catenina durante la differenziazione: cellule endoteliali hemogenic (caratterizzata da espressione di Hand1 e un elevato potenziale hemogenic) e cellule endoteliali endocardico-like (caratterizzati in parte da espressione di NFATC1 e GATA4) 41. A. Quando semi e coltivate in vaso piattaforma 3D, EC hemogenic subire alcune germinazione angiogenico. B. Tuttavia, la endocardico simile EC sono molto più angiogenica e migratori, suggerendo differenze funzionali, forse in risposta a flusso, tra i due sottotipi di EC (questo lavoro è presentato in dettaglio in una precedente pubblicazione 41). Entrambi i tipi di cellule esprimono CD31 proteine ​​giunzionale (rosso) e un po &#39;di VWF (verde). Viste ortogonali di entrambi mostrano lumen di brevetto. C. Un&#39;immagine microscopio elettronico a scansione del endocardico simil-EC all&#39;interno del vaso mostra un germoglio angiogenica come si è vistodal lato luminale. Immagini presentate nei pannelli A e B sono riproduzioni da Palpant et. al. 41. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54457/54457fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

micropatterning-and-assembly-of-3d-microvessels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Views.  University of Washington.  Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte. 

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Process of Making Three-dimensional Microstructures using Vaporization of a Sacrificial Component

Vascular structures in natural systems are able to provide high mass transport through high surface areas and optimized structure. Few synthetic material fabrication techniques are able to mimic the complexity of these structures while maintaining scalability. The Vaporization of a Sacrificial Component (VaSC) process is able to do so. This process uses sacrificial fibers as a template to form hollow, cylindrical microchannels embedded within a matrix. Tin (II) oxalate (SnOx) is embedded within poly(lactic) acid (PLA) fibers which facilitates the use of this process. The SnOx catalyzes the depolymerization of the PLA fibers at lower temperatures. The lactic acid monomers are gaseous at these temperatures and can be removed from the embedded matrix at temperatures that do not damage the matrix. Here we show a method for aligning these fibers using micromachined plates and a tensioning device to create complex patterns of three-dimensionally arrayed microchannels. The process allows the exploration of virtually any arrangement of fiber topologies and structures.

The Vaporization of a Sacrificial Component (VaSC) process is used to fabricate microvascular structures. This procedure uses sacrificial poly(lactic) acid fibers to form hollow microchannels with precise 3D geometric positioning provided by laser micromachined guide plates.

Processo di creazione di microstrutture tridimensionali mediante vaporizzazione di un componente sacrificale

Vascular structures in natural systems are able to provide high mass transport through high surface areas and optimized structure. Few synthetic material ...

Ricerca

Ingegneria

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Biologia

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Capillary-based Centrifugal Microfluidic Device for Size-controllable Formation of Monodisperse Microdroplets

Here, we demonstrate a simple method for the rapid production of size-controllable, monodisperse, W/O microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. W/O microdroplets have recently been used in powerful methods that enable miniaturized chemical experiments. Therefore, developing a versatile method to yield monodisperse W/O microdroplets is needed. We have developed a method for generating monodisperse W/O microdroplets based on a capillary-based centrifugal axisymmetric co-flowing microfluidic device. We succeeded in controlling the size of microdroplets by adjusting the capillary orifice. Our method requires equipment that is easier-to-use than with other microfluidic techniques, requires only a small volume (0.1-1 &#181;l) of sample solution for encapsulation, and enables the production of hundreds of thousands number of W/O microdroplets per second. We expect this method will assist biological studies that require precious biological samples by conserving the volume of the samples for rapid quantitative analysis biochemical and biological studies.

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

Centrifuga dispositivo a microfluidi capillare a base per la Formazione Size-controllabile di Monodisperse microgocce

Here, we demonstrate a simple method for the rapid production of size-controllable, monodisperse, W/O microdroplets using a capillary-based centrifugal ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioingegneria

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

Riepilogo

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Processo di creazione di microstrutture tridimensionali mediante vaporizzazione di un componente sacrificale

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Centrifuga dispositivo a microfluidi capillare a base per la Formazione Size-controllabile di Monodisperse microgocce

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule

Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

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Processo di creazione di microstrutture tridimensionali mediante vaporizzazione di un componente sacrificale

Un dispositivo a microfluidi con pattern Groove per studiare il comportamento cellulare

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Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Modellazione di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità

Immagine-guidate, Fabrication laser a base di reti microfluidici vascolare-derivati

Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Controllo della geometria cellulare attraverso il micropatterning laser assistito a infrarossi

Un metodo versatile di patterning proteine e cellule