Vorremmo ringraziare il Dott. S. Ressler (Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare, Baylor College of Medicine) per aver suggerito l&#39;uso di proteine ​​concentratori per aumentare la concentrazione di MMP nei surnatanti di coltura cellulare. Questo progetto è stato supportato anche da finanziamenti del Fondo di Clifford Sig.ra Elder Bianco ricerca Dotato Graham e il NIH / NIAMS (AR059838) al CB. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

1. Caricamento ed esecuzione del Gel <ol><li> Tutti i campioni devono essere preparati in modo adeguato per mantenere la funzione degli enzimi e utilizzato immediatamente dopo la raccolta o conservati congelati a -80 ° C. I campioni non devono contenere agenti riducenti (un β-mercaptoetanolo) o essere bollito prima di caricare gel. </li><li> Aprire il sacchetto contenente un gel all&#39;interno di una cassetta, la cassetta di risciacquo con acqua deionizzata. <ul><li> Rimuovere il nastro protettivo dalla parte inferiore della cassetta e il pettine dalla parte superiore del gel. </li><li> Lavare i pozzetti tre volte con tampone di corsa (diluito in acqua deionizzata 1X). </li><li> Posizionare il gel nella Mini-Cell, assicurando che il lato minore della cassetta volti verso l&#39;interno. Bloccare in posizione con il cuneo tensione Gel. Il Mini-Cell permette di eseguire uno o due gel in parallelo. </li><li> Riempire la parte superiore (interno) da camera con 1X tampone di corsa sopra il livello del pozzi, verificare eventuali perdite. In caso di perdite, rimuovere il buffer e riposizionare il gel. </li><li> Riempire la camera inferiore con 1X tampone di corsa. </li></ul></li><li> Carico 10 l di proteine ​​marker molecolari in un pozzetto. <ul><li> Mescolare una pari quantità di gel-caricamento del buffer e del campione e caricare nei pozzetti del gel con gel-loading punte (cambio tra un campione). Questi pozzi possono essere caricati fino a 20 microlitri totale. </li></ul></li><li> Mettere il coperchio sulla Mini-Cell e collegare i cavi degli elettrodi per l&#39;alimentazione. Accendere l&#39;alimentatore e impostare l&#39;esecuzione a 125 V costante per 90 minuti. Controllare la formazione di piccole bolle sul filo della camera bassa, indicando circolazione di corrente. </li><li> Quando si esegue il primo gel, monitorare i progressi della migrazione ogni 15 minuti, usando il blu di bromofenolo inclusi nel tampone di caricamento come indicatore. Lasciate che il gel fino a correre il colorante indicatore raggiunge il fondo del gel. </li></ol> 2. Rinaturazione e Sviluppo del Gel <ol><li> Per ogni gel, la preparazione di 100 ml di tampone 1X rinaturazione e 200 ml di denaturazione tampone, sia in acqua deionizzata. </li><li> Quando il colorante blu bromofenolo inseguimento raggiunge il fondo del gel, passare l&#39;alimentazione elettrica, aprire il Mini-Cell, e rimuovere il gel. Separare le due parti della cassetta con il coltello gel (o una spatola di pesatura). Tagliare un angolo per segnare la direzione del gel. </li><li> Rimuovere accuratamente il gel dal cassetto e posto in un contenitore con 100 mL di tampone di rinaturazione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. </li><li> Rimuovere il tampone rinaturazione e aggiungere 100 ml di sviluppo tampone al gel. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. </li><li> Rimuovere il tampone sviluppo e aggiungere 100 mL di tampone più via di sviluppo per il gel. Incubare per una notte (16-18 ore) a 37 ° C. </li><li> Rimuovere il tampone sviluppo e lavare tre volte (5 minuti ciascuno) con acqua deionizzata sotto agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Scansione del gel per salvare l&#39;esatto posizionamento di bande di serie della proteina come diventeranno meno o non visibile dopo colorazione gel. </li><li> Macchiare il gel con l&#39;aggiunta di 20 ml di SimplyBlue Safestain al gel. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Rimuovere il SafeStain SimplyBlue e de-macchia il gel in 100 ml d&#39;acqua più o deionizzata per un&#39;ora a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Per ottenere risultati migliori, sostituire con fresca acqua deionizzata e incubare per un&#39;altra ora o più a temperatura ambiente sotto agitazione. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Rimuovere accuratamente il gel dall&#39;acqua e posto in un protettore foglio di plastica. </li><li> La scansione del gel con una risoluzione di 300 dpi o superiore. Salvare l&#39;immagine in formato TIFF (Figura 1A). </li><li> Misura intensità band con ImageJ (o un altro software simile). <ul><li> Aprire il file TIFF in ImageJ (Figura 1A). </li><li> Visualizza in bianco e nero, selezionando &quot;Immagine&gt;&gt; Tipo 8-bit&quot; (Figura 1B). </li><li> Utilizzare lo strumento di selezione rettangolare a delineare la prima band, disegnando un rettangolo almeno due volte più alto che largo (questo è un requisito software). </li><li> Premere il tasto &quot;1&quot; o selezionare &quot;Analizza&gt; Gel&gt; corsia Seleziona prima&quot; e la band sarà delineato. </li><li> Un nuovo rettangolo apparirà, spostarlo nella fascia successiva e selezionare &quot;Analizza&gt; Gel&gt; corsia Seleziona&quot;. Ripetere fino a quando tutte le bande sono selezionati (Figura 1B). </li><li> Premere &quot;3&quot; oppure selezionare &quot;Analizza&gt; Gel&gt; corsie Plot&quot; per generare il grafico di profilo per ogni banda (Figura 1C). </li><li> Utilizzare la selezione in linea retta (dovrebbe essere già selezionata automaticamente) per tracciare linee di base in modo che il picco di interesse è un&#39;area completamente recintata. </li><li> Selezionare lo strumento bacchetta magica e fare clic all&#39;interno di ogni picco per selezionarlo. </li><li> Selezionare &quot;Analizza&gt; Gel&gt; picchi Label&quot; per ottenere una tabella con l&#39;area di ciascun picco selezionata. Questi dati possono essere rappresentati come tali (F1D IGURA) o può essere normalizzata al valore di un gruppo scelto. Questa normalizzazione è particolarmente importante quando i valori da mettere in comune diverse gel replicare per determinare la significatività statistica dei risultati. </li></ul></li></ol> 4. Rappresentante Risultati Mostriamo un gel con 11 pozzi caricato con surnatanti diverse colture di cellule contenenti diverse quantità di MMP-2 (Figura 1A). L&#39;osservazione diretta di questo gel mostra evidenti differenze nelle concentrazioni di MMP-2 tra alcuni dei pozzetti. Per esempio, è chiaro che i pozzi # 4 e 5 contengono molto di più MMP-2 che bene # 11 o anche ben # 10. Per la quantificazione oggettiva delle band che abbiamo usato densitometria con il software ImageJ (Figura 1B-D), confermando una differenza di circa 4 volte in MMP-2 importi tra bene # 11 e # pozzi 4 e 5 e una differenza di circa 2 volte a MMP-2 e gli importi compresi tra # 10 e # pozzi 4 e 5. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rilevazione di MMP-2 da zimografia gelatina. A, L&#39;immagine acquisita di un gel gelatina. I numeri sono ben indicate nella parte superiore del gel. B, gel Stessa Un mostrato in bianco e nero per la densitometria. Ogni banda è stato selezionato con un rettangolo in ImageJ. C, due esempi di profili di densitometria per il gel mostrato in A e B (bande # 4 e # 11). Una linea retta è stato redatto alla base di ogni picco di creare uno spazio chiuso. D, Plot delle aree di picco per il gel mostrato in A e B (a destra) normalizzazione prima (a sinistra) e dopo alla densità di banda # 1. <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Questa figura dimostra come zimografia può essere usato come un semi-quantitativa tecnica. Abbiamo caricato diluizioni seriali (passi di 1:1 diluizioni) in 7 pozzi consecutivi e misurato la densità di banda sia per i pro-MMP-2 e MMP-2.

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	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo dimostrato come eseguire l&#39;analisi zymographic di MMP-2 nel surnatante di coltura cellulare. La quantità di campione da caricare su un gel deve essere determinato empiricamente a seconda della provenienza e MMP di interesse. Caricamento troppo poco impedisce di rilevamento durante il caricamento di troppo può portare alla saturazione quanto non vi è solo substrato tanto una proteasi in grado di digerire nell&#39;area della band. Se necessario, il campione può essere diluito in acqua deionizzata prima della miscelazione con tampone di caricamento o il tempo di sviluppo possono de ridotto da notte per 4 ore. E &#39;anche possibile concentrare le proteine ​​in una soluzione che utilizza concentratori (es. catalogo Millipore # UFC803024). Se le bande rimangono poco visibile, può essere necessario per sviluppare il gel per un periodo di tempo più lungo, anche fino a 48 ore. Quando la preparazione dei campioni da surnatanti colture di tessuti, si deve rilevare che siero fetale bovino (e altri sieri) contiene MMP che possono influenzare i risultati. Per questa ragione, raccogliamo tutti i nostri surnatanti dopo cultura in mezzo privo di siero. La lava di cui ai paragrafi 2.9 e 2.10 del protocollo sono necessari per rimuovere la colorazione di fondo delle bande digerito. Volte di più lavare rimuoverà più di fondo, ma anche debole la colorazione del supporto in tutto il gel. Se i tempi di lavaggio più lunghi sono necessari, si consiglia la scansione del gel ogni poche ore per selezionare la scansione con il miglior contrasto. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare altre MMP. Per esempio, MMP-9 possono essere rilevati su gel di gelatina, e anche in misura minore, MMP-1, MMP-8 e MMP-13 la gelatina non è il loro substrato preferito. MMP-1 e MMP-13 sono i migliori rilevati zimografia collagene, mentre la caseina è il substrato preferito per MMP-11 e permette anche per la rilevazione di MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12, e MMP-13 9. MMP-7 (matrilysin) e collagenasi (MMP-1 e MMP-13) sono difficili da individuare quando presente a bassi livelli di caseina o gel gelatina. L&#39;aggiunta di eparina al campione al momento del carico gel migliora in modo significativo il limite di rilevamento per la MMP-7. Per MMP-1 e MMP-13, l&#39;eparina deve essere aggiunto il gel dopo la corsa elettroforetica è già in corso 12. Dal zimografia misura l&#39;attività enzimatica dopo denaturazione e rinaturazione degli enzimi, si misura l&#39;attività di tutti MMP presenti nel campione. Questo include gli enzimi, pro-enzimi, ed enzimi legati agli inibitori endogeni (ad esempio TIMP-2). E &#39;tuttavia possibile determinare il livello di attivazione MMP nel campione confrontando la densità di banda dell&#39;enzima attivo e di quello del pro-enzima, che avrà un peso leggermente superiore molecolare. Zimografia spesso non è sufficiente per identificare un MMP. Confronto del livello di migrazione di un MMP con nota standard di peso molecolare è di aiuto nella identificazione, ma va notato che alcune di queste norme contengono un agente riducente e che se usati in condizioni non riducenti possono indicare diversi pesi molecolari 9. Una possibilità è quella di caricare un MMP solubile ricombinante sullo stesso gel come campioni di prova. MMP può tuttavia essere associata con altre proteine, inducendo un cambiamento apparente peso molecolare. Gli inibitori selettivi MMP può essere aggiunta al gel (o parte di un gel tagliato a metà) durante l&#39;incubazione in tampone di sviluppo come strumenti farmacologici per l&#39;identità del MMP della tecnica interest.A secondo (Western Blot, immunocitochimica, o ELISA) si consiglia di aiuto per l&#39;identificazione del MMP di interesse. Va notato che i limiti di rilevazione per Western Blot sono spesso molto inferiori a quelli di gel zymographic, che porta a risultati falsi-negativi quando si usa questa tecnica.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

Metalloproteinasi della matrice (MMP) sono contenenti zinco endopeptidasi. Si degradano le proteine ​​per scissione di legami peptidici. Più di venti MMP sono stati identificati e sono divisi in sei gruppi in base alla loro struttura e specificità di substrato (collagenasi, gelatinasi, tipo a membrana [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, e altri). MMP svolgono un ruolo critico nella invasione delle cellule, la degradazione della cartilagine, il rimodellamento dei tessuti, la guarigione delle ferite, e l&#39;embriogenesi. Essi hanno quindi partecipare sia i processi normali e nella patogenesi di molte malattie, come l&#39;artrite reumatoide, il cancro o malattie polmonari croniche ostruttive 1-6. Qui ci concentreremo su MMP-2 (gelatinasi A, collagenasi di tipo IV), un MMP ampiamente espresso. Dimostreremo come rilevare MMP-2 nei supernatanti colture cellulari da zimografia, un uso comune, tecnica semplice, ma molto sensibile descritto per primo nel 1980 da C. Heussen e EB Dowdle 7-10. Questa tecnica è semi-quantitativa, si può quindi essere usato per determinare i livelli di MMP nei campioni di prova quando le concentrazioni note di MMP ricombinanti sono stati caricati sullo stesso gel 11. Soluzioni contenenti MMP (ad esempio surnatanti di coltura cellulare, delle urine o siero) vengono caricati su un gel di poliacrilamide contenente dodecil solfato di sodio (SDS, per linearizzare le proteine) e la gelatina (substrato per la MMP-2). Il buffer di esempio è progettato per aumentare la viscosità del campione (per facilitare il carico gel), forniscono un colorante di tracciamento (blu di bromofenolo, di monitorare la migrazione del campione), di fornire le molecole denaturazione (a linearizzare le proteine), e controllare il pH del campione. Le proteine ​​sono poi permesso di migrare sotto una corrente elettrica in un tampone di corsa progettata per fornire una velocità costante migrazione. La distanza di migrazione è inversamente correlata con il peso molecolare della proteina (piccole proteine ​​muoversi più velocemente attraverso il gel di proteine ​​di grandi dimensioni e quindi non migrano più in basso il gel). Dopo la migrazione, il gel viene posto in un buffer di rinaturazione delle proteine ​​per permettere di ritrovare la loro struttura terziaria, necessari per l&#39;attività enzimatica. Il gel viene posto in un buffer di sviluppo progettato per consentire la proteasi per digerire il suo substrato. Il buffer contiene anche lo sviluppo di p-aminophenylmercuric acetato (Apma) per attivare il non-proteolitico pro-MMP in MMP attiva. Il passo successivo consiste di colorazione del substrato (gelatina nel nostro esempio). Dopo aver lavato il colorante in eccesso il gel, le aree di digestione della proteasi appaiono come bande chiare. La più chiara la band, il più concentrato della proteasi in esso contenuti. Colorazione delle bande può essere determinata da densitometria, utilizzando un software come ImageJ, che consenta raffronti campione.

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Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Questo protocollo descrive una basata sulle attività di analisi per la rilevazione di metalloproteinasi della matrice in sovranatanti o fluidi corporei.

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

83.6K Views.  Baylor College of Medicine. Questo protocollo descrive una basata sulle attività di analisi per la rilevazione di metalloproteinasi della matrice in sovranatanti o fluidi corporei.

Video: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Ricerca

Biologia

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

Rilevamento di RNA-binding proteins by<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA a tendina nella cultura degli adipociti

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...