Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio Fondazione Nazionale della Scienza Graduate Research di SK e National Institutes of Heath concedere R01EB008722.

A. La preparazione dei materiali e sterilizzazione <ol><li> Prima di materiali di incapsulamento preparazione, preparare una soluzione 0,5% in peso del fotoiniziatore Irgacure 2959 (I2959) in tampone fosfato salino (PBS), mixando e incubazione per diversi giorni a 37 ° C. La soluzione può allora essere filtrati siringa per la sterilizzazione e conservati a temperatura ambiente per un utilizzo a lungo termine. </li><li> Sulla base della composizione desiderata di gel da sintetizzare, calcolare (usando un foglio di calcolo come Microsoft Excel) il peso di polimero e reticolante necessario. Perché un dato peso di polimero deve essere sciolto in un determinato volume totale per ottenere una concentrazione desiderata in idrogel, il reticolante e porzioni soluzione di polimero del volume gel totale deve essere determinato anche utilizzando il foglio di calcolo. Calcoli simili dovrebbero essere eventuali frazioni di sospensione (ad esempio, un adesivo o RGD YGSR contenenti oligopeptide) devono essere inseriti prima di reticolazione. </li><li> Pesare la quantità di polimero e reticolante e il luogo in tubi Eppendorf. Regolare il foglio di calcolo di conseguenza per il peso effettivo del polimero ottenuto. (Nota: i volumi possono essere modificati per compensare la massa effettiva del polimero reticolante e ottenuto). </li><li> Preparare gli stampi gel utilizzando una lama di rasoio per tagliare le cime via di confezione singola sterile monouso siringhe da 1 ml. Garantire un taglio piatto è fatto per stampi da utilizzare per i gel photopatterned. </li><li> Mettere gli stampi siringa, provette Eppendorf (con tappi aperto) e qualsiasi altro materiale necessario, sotto una fonte di luce germicida (tipicamente integrato in cappe di sicurezza biologica) e sterilizzare per 30 minuti. </li></ol> B. Preparazione cellulare <ol><li> Dopo la sterilizzazione, aggiungere il giusto volume di tampone sterile (per calcoli di foglio di calcolo, mentre la scelta del buffer può variare, PBS e un buffer di base debole come trietanolammina sono tipicamente utilizzati per la reticolazione radicali liberi e michael-tipo, rispettivamente) alla Eppendorf polimero e (opzionalmente) porzione ciondolo da inserire (per esempio, adesivi peptide) e vortice di sciogliere (se al di fuori del vortex avvolgere la cappa sterile Eppendorf con parafilm). </li><li> Aggiungere il volume appropriato di soluzione porzione pendant alla soluzione di polimeri e avvolgere il sigillo con parafilm. Mescolare brevemente nel vortex e incubare a 37 ° C a reagire (se possibile, in cima a un piatto mescolare rotante) durante la preparazione delle cellule. Questo implica la reazione di un tiolo su un peptide (via gruppo cisteina) ad un acrilato o metacrilato in modo che il peptide è incluso come un gruppo ciondolo in idrogel finale. </li><li> Trypsinize e contare le cellule e si separano in porzioni contenenti il ​​numero appropriato per ogni set di gel. Ad esempio, per una serie di tre da 50 microlitri gel ad una densità di 10 milioni di cellule / ml, 1,5 milioni separato le cellule in una provetta conica individuale. Si raccomanda di non più di 4 gel essere preparati in un set singolo a causa della tempistica di gelificazione (nota: se sintetizzare più set di gel, un singolo Eppendorf contenente un adeguato volume di soluzione polimerica per tutti i set possono essere preparati). </li><li> Centrifugare le cellule. </li><li> Mentre le cellule girano verso il basso <ol class="lalpha"><li> Luce iniziata reticolazione radicali liberi: aggiungere 0,5% in peso I2959 soluzione alla soluzione di polimeri pari al 10% del volume totale di gel (per una concentrazione finale iniziatore dello 0,05% in peso). </li><li> Michael-type (aggiunta) reticolazione: aggiungere buffer nel reticolante per ottenere la soluzione adeguata concentrazione. </li><li> Per reticolazione sequenziali: questi gel incorporare entrambi i tipi di reticolazione e richiedono entrambi i passaggi precedenti. </li></ol></li></ol> C. Hydrogel Formazione <ol><li> Aspirare il surnatante dalla parte delle cellule centrifugato. Attendere il liquido di stabilirsi dopo l&#39;aspirazione iniziale e ri-aspirare a rimuovere il supporto quanto più possibile senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet cellulare con la soluzione di polimero fino cellule sono uniformemente distribuite. Minimizzare la formazione di bolle lentamente pipettaggio la soluzione su e giù (circa 10 cicli dovrebbe essere sufficiente per distribuire le cellule). </li><li> Reticolazione idrogel <ol><li> Luce iniziata radicali liberi reticolazione: Distribuire il volume appropriato in stampi siringa. Esporre le siringhe ai raggi UV per la reticolazione radicale (ad esempio, una esposizione 10 minuti a 365 nm, 4 mW/cm2 luce UV è comune per i polimeri funzionalizzati acrilato). Questa operazione deve essere eseguita rapidamente per ridurre al minimo delle cellule assestamento prima dell&#39;esposizione ai raggi UV. </li><li> Michael-type (aggiunta) reticolazione: Utilizzando un ampio orifizio punta della pipetta, aggiungere il volume appropriato di soluzione reticolante al polimero / cella soluzione, impostare la pipetta per il volume desiderato gel individuali, pipetta la soluzione su e giù peromogeneizzare e aliquote in stampi pendere l&#39;ago della siringa. Questa operazione deve essere eseguita rapidamente per garantire una distribuzione uniforme delle celle. Lasciare 10-30 minuti (a seconda del sistema individuale) di incubazione nel cappuccio cultura per reticolazione. </li><li> Reticolazione sequenziale: si tratta di Michael-tipo di reazione di addizione e poi l&#39;esposizione alla luce per la reticolazione secondo. Solo una frazione di legami crociati teorica dovrebbe essere reagito durante la reticolazione e poi una mascherina sterile deve essere applicato direttamente sulla superficie del gel prima di esposizione alla luce utilizzando una pinzetta sterilizzata. Un colorante funzionalizzati (ad esempio, rodamina methacrylated (MeRho) ad una concentrazione finale nel gel di 20 Nm) può anche essere aggiunto alla soluzione iniziale per visualizzare il modello, dato che incorporano preferenzialmente nelle regioni radicalmente reticolato del gel (Figura 2 ). </li></ol></li></ol> D. coltura cellulare e analisi <ol><li> A seguito di reticolazione, gel immergersi in pozzetti di una piastra di coltura di tessuti contenenti i media per l&#39;incubazione e l&#39;analisi (vedere i passaggi seguenti). </li><li> Le celle possono essere visualizzati per la morfologia con microscopia ottica (figura 3, in genere, gli idrogel sintetizzati sono trasparenti) e la vitalità usando un fluorescente live / morti kit di colorazione (figure 3 e 4). Colorazione per cellulari actina (ad esempio, rodamina o marcate con fluoresceina falloidina) e nuclei (ad esempio, 4&#39;-6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI)) possono essere eseguite utilizzando la fissazione e procedure standard permeabilizzazione (Figura 4) con la seguente procedura. <ol class="laplha"><li> Sciacquare costruisce 3X per 5 minuti con PBS. </li><li> Fix gel mediante incubazione in 1 ml di formaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare costruisce 3X con una soluzione di blocco contenente il 3% (w / v) di BSA e 0,5% (w / v) Tween in PBS. </li><li> Permeabilize membrana con 0,25% (w / v) Triton X nel bloccare la soluzione per 20 min. </li><li> Sciacquare costruisce 3X con il blocco soluzione. </li><li> Macchia di F-actina con 0,66 mg / ml FITC o rodamina falloidina nel bloccare una soluzione per due ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare 3x con blocco soluzione. </li><li> Macchia nuclei cellulari utilizzando 0,4 microlitri / ml DAPI in PBS per 20 min. </li><li> Sciacquare 3X con PBS. </li><li> Visualizzare le cellule usando la microscopia confocale o epifluorescente. </li></ol></li><li> Proliferazione di cellule all&#39;interno di gel viene comunemente valutata mediante test disponibili in commercio (ad esempio, DNA totale o contenuti biochimici). PicoGreen è un uso comune e sensibile acidi nucleici colorante fluorescente per quantificare il DNA a doppia elica (Singer et al.). Le cellule possono anche essere contati e normalizzato ad un numero iniziale di controllo utilizzando i metodi di visualizzazione descritto al punto 2. </li><li> Sezionamento istologici e colorazione può essere utilizzato anche per visualizzare cellule e formano matrice. Il protocollo seguito per la disidratazione e il sezionamento di idrogeli 3D possono essere utilizzate per ottenere sezioni trasversali su vetrini: <ol class="lalpha"><li> Fissazione e la disidratazione <ol class="lroman"><li> Sciacquare campione 3 volte in PBS. </li><li> Fix per 5 - 30 minuti in paraformaldeide 4%. </li><li> Sciacquare campione 3 volte in PBS. </li><li> Incubare campione in EtOH a 25 ° C per 1 ora a ciascuno dei seguenti EtOH (v / v) le concentrazioni in acqua (in ordine): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (A questo punto, i campioni può essere conservato durante la notte a 25 ° C). </li></ol></li><li> Compensazione e infiltrazione <ol class="lroman"><li> Trasferimento% Citrisolv 100 per 1 ora a 25 ° C, seguita da un&#39;ora a 65 ° C. </li><li> Tagliare a metà i campioni con una lametta in una piastra di Petri in modo tale che la sezione trasversale del campione è esposto. </li><li> Trasferimento in miscela 1:1 di Citrisolv / Micro-taglio di paraffina per 1 ora a 65 ° C. </li><li> Trasferimento al 100% Micro-taglio di paraffina per 1 ora a 65 ° C. </li><li> Trasferimento al 100% Micro-taglio paraffina notte a 65 ° C. </li><li> Trasferimento al 100% Micro-taglio di paraffina per 1-2 ore a 65 ° C. </li></ol></li><li> Incorporare <ol class="lroman"><li> Posizione nel campione peel-away stampo con il 100% paraffina. </li><li> Mettete una piccola quantità di cera a letto stampo, e inserire le due metà del campione con la sezione rivolta verso il basso. </li><li> Applicare top pezzo filtro <ol><li> Aggiungi cera aggiuntive per immergere il pezzo superiore e lasciare indurire per circa 10 minuti. </li></ol></li><li> Trasferimento inserti frigorifero a 4 ° C per consentire provino per indurire durante la notte. </li><li> Campione può essere sezioneed il giorno seguente, di solito a spessore micron 5-10 per fetta utilizzando microtomi disponibili in commercio. In genere il peel-away stampo è montato verticalmente contro il palco microtomo e controlli manuali consentono di impostare lo spessore della sezione, affettatrice e l&#39;allineamento del campione con la lama. </li></ol></li><li> Estrazione di RNA L&#39;espressione genica può anche essere valutata quantitativamente (ad esempio tramite real-time polymerase chain reaction (PCR)). Il protocollo per l&#39;estrazione di RNA da idrogel 3D, un esempio è riportato di seguito, è molto diverso dal caso più semplice 2D. <ol class="lroman"><li> Etichettare un certificato RNasi libero provetta Eppendorf per ogni idrogel 3D e aggiungere 500 microlitri Trizol ® reagente ad ogni provetta. </li><li> Utilizzare un pestello (grinder tessuto) per macinare manualmente l&#39;idrogel fino a quando una soluzione limpida ottenuta. Smerigliatrici garantire diversi sono utilizzati per ogni condizione. </li><li> Vortex ogni Eppendorf per 20 secondi per omogeneizzare i campioni. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti per consentire completa dissociazione dei complessi nucleoproteina. </li><li> Refrigerare i campioni in ghiaccio per 20 minuti </li><li> Aggiungere 200 ul (per mL Trizol) cloroformio per ogni campione e vortice. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti. </li><li> Centrifugare i campioni a 12000 xga 4 ° C per 15 min. </li><li> Trasferire la fase acquosa (chiaro strato superiore) a nuovi tubi Eppendorf (evitando regione interfacciale e inferiore rosso, fenolo-cloroformio fase). RNA rimane nella fase acquosa limpida. </li><li> Tecniche comuni per l&#39;isolamento di RNA e storage possono ora essere utilizzati. </li><li> Dopo l&#39;estrazione di RNA, i kit disponibili in commercio per la trascrittasi inversa e PCR in tempo reale sono spesso utilizzati con alcune modifiche (Elisseff et al. Strehin et al.). </li></ol></li></ol></li></ol> Rappresentante dei risultati: Si vedano le figure 2-4 (come indicato nei protocolli di cui sopra) per ottenere risultati rappresentativi della visualizzazione di idrogel photopatterned e incapsulamento di cellule all&#39;interno gel. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Panoramica della procedura di incapsulamento 3D. Passi diagramma corrispondono ai titoli delle sezioni dei protocolli graduale. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Photopatterned idrogel con Michael sequenziale di tipo polimerizzazione per addizione poi radicale. (A) Schema di photopatterning di un idrogel parzialmente reticolato con l&#39;incorporazione di un colorante reattivo foto. (B) Circle o (C) maschera di trasparenza striscia film di fantasia idrogel di acido ialuronico. Rodamina Methacrylated (MeRho) è incorporato soltanto nelle regioni del gel che sono stati esposti alla luce. Barre di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Visualizzazione di cellule in idrogel 3D. Le cellule staminali visualizzati tramite (a) microscopia ottica o (b) dal vivo (verde, calceina AM) e morti (rossi, etidio omodimero-1) colorazione 24 ore dopo l&#39;incapsulamento a 1 milione di cellule / ml in un idrogel di acido ialuronico reticolato con il semaforo iniziato meccanismo radicali liberi. Barre di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Visualizzazione di cellule in idrogel 3D. hMSCs macchiato per (a) cellule vive (calceina AM) o (b) cellulari actina (rodamina falloidina) e nuclei (DAPI) cinque giorni dopo l&#39;incapsulamento a 1 milione di cellule / ml in un idrogel di acido ialuronico reticolato attraverso un meccanismo di tipo Michael ( utilizzando peptidi adesivi pendente e bifunzionali reticolanti peptide proteoliticamente degradabili). Barre di scala = 100 micron.

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	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

I protocolli descritti rappresentano un metodo semplice ed efficace per incapsulare le cellule all&#39;interno di ponteggi idrogel in modo cytocompatible. Tali tecniche sono particolarmente importanti poiché terminalmente differenziate e le cellule staminali possono manifestare un comportamento marcatamente diverso in microambienti 2D vs 3D. Anche per approcci terapeutici che coinvolgono l&#39;impianto di materiali (ad esempio, a polimerizzazione in situ radicale), l&#39;incapsulamento delle cellule e di analisi per la vitalità e la differenziazione può aiutare nel processo di sviluppo materiale. Il processo descritto sequenziale può essere usato per manipolare l&#39;ambiente spazialmente idrogel, e di conseguenza il comportamento cellulare (vedi Khetan et al.). In generale, l&#39;elemento più critico dei protocolli descritto è l&#39;omogeneità di tutte le soluzioni utilizzate. In particolare, particolare attenzione deve essere adottate per garantire le cellule siano uniformemente distribuite nella soluzione prepolimero, e che la soluzione è ben mixato da risospensione pipetta seguente aggiunta della soluzione di reticolante. Non riuscire a garantire questo può portare ad aggregazione di cellule o di variazioni locali della struttura del gel e gonfiore. Mentre i protocolli qui presentati si concentrano principalmente sulla procedura per le cellule incapsulamento, è importante notare anche che l&#39;incapsulamento può richiedere alcuni aggiustamenti per protocolli di analisi che in genere sono scritti per la semina 2D. Numerosi esempi sono stati illustrati per la visualizzazione e la valutazione delle cellule in idrogel.

<table><tbody><tr><td>I2959</td><td>Reagent</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>.2 M Triethanolamine Buffer</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td>1x, sterile liquid</td></tr><tr><td>Live/Dead staining kit</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td></tr><tr><td>Phalloidin-FITC</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td><td>Reagent</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Citrisolv</td><td>Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143975</td><td></td></tr><tr><td>Micro-cut paraffin</td><td>Reagent</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24202</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m pore size nylon syringe filters</td><td>Equipment</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>1 mL disposable syringes</td><td>Equipment</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td></tr><tr><td>Wide orifice pipette tips</td><td>Equipment</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6800</td><td></td></tr><tr><td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td><td>Equipment</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>254 nm germicidal UV light source</td><td>Equipment</td><td></td><td></td><td>Built into most biological safety cabinets</td></tr></tbody></table>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

L&#39;incapsulamento 3D di cellule all&#39;interno idrogel rappresenta una tecnica sempre più importante e popolare per la coltura delle cellule e verso lo sviluppo di costrutti per l&#39;ingegneria tissutale. Questo ambiente riproduce meglio ciò che osservare le cellule in vivo, rispetto alla cultura dei tessuti standard, a causa del tessuto simil-proprietà e ambiente 3D. Idrogel polimerici sintetici sono gonfi d&#39;acqua le reti che possono essere progettati per essere stabili o di degradare tramite idrolisi o proteolisi come nuovo tessuto viene depositato dalle cellule incapsulate. Una vasta gamma di polimeri sono stati esplorati per queste applicazioni, come la poli (glicole etilenico) e acido ialuronico. Più comunemente, il polimero è funzionalizzato con gruppi reattivi come metacrilati o acrilati poter subire una reticolazione attraverso vari meccanismi. Negli ultimi dieci anni, molti progressi sono stati fatti nel campo dell&#39;ingegneria questi microambienti - ad esempio, tramite l&#39;incorporazione fisica o ciondolo covalente di segnali biochimici - fenotipo cellulare per migliorare la viabilità e diretto, tra cui la differenziazione delle cellule staminali incapsulate (Burdick et al.). I seguenti metodi per l&#39;incapsulamento 3D delle cellule sono stati ottimizzati nel nostro ed altri laboratori per massimizzare citocompatibilità e minimizzare il numero di fasi di lavorazione idrogel. Nei protocolli seguenti (vedi Figura 1 per l&#39;illustrazione della procedura), si assume che i polimeri funzionalizzati in grado di subire reticolazione sono già in mano, ottime recensioni della chimica dei polimeri, applicato al campo della ingegneria dei tessuti possono essere trovati altrove (Burdick et al.) e questi metodi sono compatibili con una vasta gamma di tipi di polimeri. Inoltre, l&#39;aggiunta Michael-tipo (vedi Lütolf et al.) E la luce iniziati radicali liberi (vedi Elisseeff et al.) Meccanismi concentrati qui costituiscono solo una piccola parte delle tecniche di reticolazione segnalati. Reticolazione modalità mista, in cui una parte di gruppi reattivi viene prima consumato da oltre reticolazione e seguita da un meccanismo radicale, è un altro paradigma comunemente utilizzati e potenti per dirigere il fenotipo delle cellule incapsulate (Khetan et al. Salinas et al.).

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Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all&#39;interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l&#39;ingegneria tissutale

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.8K Views.  University of Pennsylvania. Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all'interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

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Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Ricerca

Bioingegneria

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biochimica

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Fabbricazione seguita da incapsulamento 3D di sferoidi tumorali in idrogel PEG

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth. Here, we designed an in vitro 3D glioblastoma model for spheroid encapsulation to mimic the tumor extracellular microenvironment. First, we formed square pyramidal microwell molds using polydimethylsiloxane. These microwell molds were then used to fabricate tumor spheroids with tightly controlled sizes from 50-500 &#956;m. Once spheroids were formed, they were harvested and encapsulated in polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels. PEG hydrogels are a versatile platform for spheroid encapsulation, as hydrogel properties such as stiffness, degradability, and cell adhesiveness can be tuned independently. Here, we used a representative soft (~8 kPa) hydrogel to encapsulate glioblastoma spheroids. Finally, a method to stain and image spheroids was developed to obtain high-quality images via confocal microscopy. Due to the dense spheroid core and relatively sparse periphery, imaging can be difficult, but using a clearing solution and confocal optical sectioning helps alleviate these imaging difficulties. In summary, we show a method to fabricate uniform spheroids, encapsulate them in PEG hydrogels and perform confocal microscopy on the encapsulated spheroids to study spheroid growth and various cell-matrix interactions.

Autore in primo piano: Modello in vitro di idrogel per lo studio del microambiente del glioblastoma

Here, we present a protocol that enables fast, robust, and cheap fabrication of tumor spheroids followed by hydrogel encapsulation. It is widely applicable as it does not require specialized equipment. It would be particularly useful for exploring spheroid-matrix interactions and building in vitro tissue physiology or pathology models.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l'ingegneria tissutale

Riepilogo

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Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l'ingegneria tissutale cardiaca