Trasferimento di cellule adottive: introduzione degli splenociti di topo donatore a un topo ospite e valutazione del successo tramite FACS

Fonte: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unità di Linfopoiesi, Dipartimento di Immunologia, Istituto Pasteur, Parigi, Francia
² INSERM U1223, Parigi, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Parigi, Francia
⁴ Platfrom, Citometria a flusso e biomarcatori UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Parigi, Francia

Il trasferimento di cellule adottive è un metodo per introdurre cellule in un paziente o in un organismo di studio al fine di trattare una malattia o studiare un processo biologico, come l'ematopoiesi. Gli obiettivi del trasferimento adottivo sono vari; può essere utilizzato in biologia fondamentale e nelle scienze mediche (1, 2). Nei modelli murini, la migrazione e la distribuzione delle cellule trasferite possono essere studiate e seguite da un sistema di tracciamento (marcatore della superficie cellulare, colorazione mediante CFSE, ecc.). Negli studi sul cancro su modelli murini, il trasferimento di specifiche popolazioni cellulari può essere utilizzato come trattamento sperimentale contro i tumori. Un altro esempio di questa tecnica è la creazione di topi chimerici mediante trasferimento di cellule del midollo osseo a topi irradiati o topi con un fenotipo di immunodeficienza grave. Questo modello murino può essere utilizzato per valutare l'impatto della delezione genica su una specifica popolazione cellulare, ad esempio. Il trasferimento di cellule di prestito osseo è anche usato nel trattamento medico umano. Quando i pazienti vengono irradiati in caso di terapia antitumorale, il trasferimento adottivo del midollo osseo consente la ricostituzione del sistema immunitario.

Il primo passo in questa tecnica è quello di ottenere la popolazione cellulare di interesse. La tecnica scelta per isolare questa popolazione dipende dal livello di specificità della popolazione target. Il più grande livello di selezione è l'intero organo, in cui vengono prese tutte le popolazioni cellulari presenti nell'organo. Un metodo più preciso è la selezione di una popolazione cellulare target, spesso selezionata da un marcatore di superficie cellulare. Il metodo ideale per ordinare le celle in questo caso è lo smistamento magnetico. Infine, il livello più rigoroso è la selezione delle cellule da parte di diversi marcatori di superficie cellulare per ordinare popolazioni cellulari molto specifiche. Lo smistamento della citometria a flusso è il metodo più popolare per questo livello di selezione. Una volta ottenuta la popolazione di interesse, può essere trasferita all'host. Prima del trasferimento adottivo è essenziale garantire la compatibilità tra ospite e donatore. Infatti, indipendentemente dall'obiettivo di trasferimento, la compatibilità è fondamentale per garantire l'adozione delle cellule da parte dell'ospite senza il rigetto delle cellule.

In questo esercizio di laboratorio, dimostriamo la tecnica di trasferimento cellulare adottivo trasferendo gli splenociti da un topo CD45.2 in un topo Ragγc CD45.1 (privo di linfociti) e quattro giorni dopo confermiamo il trasferimento degli splenociti usando la citometria a flusso (vedi Figura 1).

Figura 1: Rappresentazione schematica del trasferimento adottivo. (1) Gli splenociti sono isolati dai topi CD45.2 e (2) trasferiti nel topo CD45.1 Ragγc, il mouse di controllo viene iniettato solo con PBS. (3) 4 giorni dopo il trasferimento adottivo, gli splenociti vengono recuperati dai topi e (4) analizzati mediante citometria a flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, indossare guanti da laboratorio e gli indumenti protettivi appropriati.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione, prima con un detergente e poi con etanolo al 70% e poi asciugare accuratamente.
3. Preparare 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 2% di siero fetale per vitelli (FCS).

2. Dissezione

1. Utilizzando un sistema di rilascio di anidride carbonica, eutanasizzare il topo per ipossia. Fissare il topo eutanasizzato su una piastra di dissezione in posizione supina ed eseguire una laparotomia longitudinale usando forbici e pinza.
2. Usando la pinza muovi l'intestino e lo stomaco sul lato destro dell'addome per esporre lo stomaco e la milza. La milza è attaccata allo stomaco.
3. Usando una pinza staccare accuratamente la milza dallo stomaco e posizionarla sulla capsula di Petri contenente 5 ml di HBSS 2% FCS.

3. Isolamento delle cellule immunitarie

1. Posizionare la milza su un colino cellulare da 40 μm sopra la capsula di Petri. Schiacciare la milza con uno stantuffo per dissociarla.
2. Recuperare le cellule aderenti risciacquando lo stantuffo e il filtro con 1 mL di HBSS 2% FCS.
3. Trasferire la milza dissociata e il fluido in un tubo centrifugo da 15 ml.
4. Lavare la capsula di Petri con 5 millilitri di HBSS 2% FCS e trasferire il fluido nel tubo da 15 ml.
5. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C ed eliminare il surnatante evitando il pellet.
6. Risuscisci il pellet in 2 mL di pipetto di cloruro di ammonio di potassio su e giù per ricaspendare il pellet e lisi gli eritrociti.
7. Attendere 2 min e aggiungere HBSS 2% FCS al pellet riaspenso per ottenere il volume fino a 14 mL.
8. Centrifugare nuovamente il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C. Scartare il surnatante e ricasospenare il pellet in 5 ml di HBSS 2% FCS tubando su e giù.
9. Contare le cellule utilizzando il test di colorazione blu tripano e regolare la concentrazione cellulare finale a^{10 7} cellule / mL utilizzando il volume appropriato di HBSS 2% FCS.

4. Trasferimento adottivo

1. Trasferire 2 mL di sospensione cellulare ottenuta in un tubo di raccolta da 5 mL.
2. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C e poi scartare il surnatante.
3. Spese di sospensione del pellet in 2 mL di PBS e centrifugazione del tubo a 370 x g per 7 min a 10°C.
4. Scartare il pellet surnatante e spese in 200 μL di PBS.
5. Utilizzando una siringa da 0,5 mL con un ago da 29G iniettare 200 μL di sospensione cellulare nel topo sperimentale per via endovenosa nel seno sanguigno retro-orbitale.
6. Come controllo, iniettare un secondo topo nello stesso seno sanguigno con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato.

5. Raccolta e colorazione delle cellule

1. Quattro giorni dopo il trasferimento adottivo, eutanasizzare i topi e rimuovere la milza.
2. Raccogliere gli splenociti come descritto nel paragrafo 3.
3. Trasferire 100 μL di sospensioni cellulari da ciascun topo in due tubi FACS, etichettati come "controllo" e "trasferiti".
4. Centrifugare il tubo a 370 x g per 7 min a 10°C e poi scartare i supernatanti.
5. Preparare una miscela contenente i quattro anticorpi alle diluizioni elencate nella Tabella 1.

Tabella 1: Composizione della miscela di anticorpi. Preparazione di cocktail a quattro anticorpi utilizzando coniugati fluorescenti anticorpali concentrati e HBSS.

6. Aggiungere 100 μL della miscela a ciascun tubo, quindi incubare per 20 minuti sul ghiaccio al buio.
7. Aggiungere 1 mL di HBSS 2%FCS e quindi centrifugare i tubi a 370 x g per 3 minuti a 10°C.
8. Scartare i supernatanti e ricasospenare i pellet in 200 μL di HBSS 2% FCS.
9. Trasferire le celle riconsepense in nuovi tubi FACS etichettati.
10. Utilizzando la citometria a flusso, come mostrato nel protocollo FACS, valutare la presenza di linfociti CD45.2 positivi.

6. Analisi dei dati

1. Aprire il software "FlowJo" e trascinare i file per ogni tubo nella finestra " Tutti icampioni".
2. Fare doppio clic sul file "trasferito" per visualizzare le celle registrate da quel campione su un dot plot che visualizza la dispersione in avanti "SSC-A" sull'asse Y e la dispersione laterale "FSC-A" sull'asse X.
3. Fare clic su "poligono" e creare una strategia di gating per selezionare i linfociti, quindi distinguere le cellule donatrici e ospiti utilizzando marcatori di superficie cellulare (CD45.1, CD45.2) e quindi caratterizzare la popolazione cellulare CD45.2⁺ (CD3, CD4).
4. Ripetere i passaggi di analisi con il file "control mouse".
5. Per visualizzare una popolazione di celle, fare clic su "Editor di layout".
6. Trascinare le "celle trasferite" e la popolazione di "celle CD4 trasferite" dai file "trasferiti" e "di controllo" nella scheda "Editor layout".
7. Apparirà un dot plot che rappresenta le cellule CD45.2⁺ e i linfociti CD4.
8. Le celle trasferite CD45.2 dovrebbero apparire solo nel dot plot "trasferito dal mouse".

I topi Ragγc hanno una composizione alterata del sistema immunitario, principalmente privi di linfociti. Il trasferimento adottivo di splenociti consente l'introduzione di popolazioni carenti come le cellule T e B. La nostra colorazione includeva marcatori di superficie cellulare CD45.1 e CD45.2 per distinguere rispettivamente le cellule ospiti e donatrici (Figura 2A). Ha anche incluso altri marcatori della superficie cellulare per evidenziare le popolazioni cellulari assenti nei topi Ragγc, come le cellule T CD4 (Figura 2B). Come previsto, il mouse di controllo non aveva celle CD45.2-positive(Figura 2B,pannelli superiori) e il mouse trasferito lo ha fatto(Figura 2B,pannelli inferiori, 71,2% delle celle totali). Potremmo anche rilevare specificamente le cellule T CD4 all'interno delle cellule trasferite (22,1% delle cellule CD45,2).

Figura 2: Risultati rappresentativi del trasferimento adottivo. (A) Istogrammi di cellule CD45.2 di topi iniettati con PBS (gruppo di controllo) (tratteggiato) e topi iniettati con splenociti CD45.2 (gruppo di prova) (linea solida). (B) Strategia di Gating di cellule CD45.2-positive in topi di controllo iniettati con PBS (pannelli superiori) e topi iniettati con splenociti CD45.2 (pannelli inferiori). Le cellule donatrici e ospiti si distinguono utilizzando marcatori di superficie cellulare (CD45.1, CD45.2), quindi viene caratterizzata la popolazione cellulare CD45.2-positiva (CD3, CD4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il trasferimento adottivo è una tecnica traslazionale in diversi campi della scienza, con applicazioni in medicina. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la migrazione cellulare e il tropismo o l'incidenza della carenza proteica in specifiche popolazioni cellulari. In quest'ultimo caso, possono essere utilizzate diverse tecnologie, in particolare topi OGM in cui specifiche popolazioni cellulari sono intrinsecamente carenti. Tuttavia, la costruzione genetica per ottenere topi OGM può essere un processo molto complesso e lungo. In questo caso, il trasferimento adottivo della popolazione cellulare carente è più facile e veloce.

I trasferimenti adottivi hanno applicazioni dirette in medicina. Ad esempio, gli innesti di midollo osseo in pazienti irradiati durante la terapia del cancro vengono utilizzati per ricostituire il sistema immunitario. Recentemente, altre applicazioni di trasferimento adottivo sono state utilizzate in campo medico. Le cellule T artificiali (chiamate cellule T CAR) sono progettate per riconoscere ed eliminare alcuni tumori. Inoltre, queste celle ingegnerizzate sono costruite per smorzare il rischio di rigetto da parte dell'ospite. Il trasferimento di cellule T CAR è attualmente testato in studi clinici.