Imaging del trasferimento di energia della risonanza di Förster su cellule vive delle dinamiche di attivazione di Akt metabolicamente regolate nelle cellule HepG2

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare le dinamiche spazio-temporali dell'attivazione e della fosforilazione di Akt in cellule HepG2 vive. L'imaging a trasferimento di energia per risonanza di Förster (FRET) è uno strumento potente che fornisce preziose informazioni sulle vie di segnalazione dell'insulina e sulla regolazione metabolica nelle cellule tumorali.

L'attivazione metabolicamente regolata di Akt è un nodo critico nella cascata di segnalazione dell'insulina e fornisce preziose informazioni sulla relazione tra diabete e cancro. Per quantificare con precisione l'attività di Akt nelle cellule HepG2, abbiamo sviluppato un protocollo robusto e riproducibile che utilizza il trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) con biosensori specifici per Akt geneticamente codificati. Questo protocollo delinea i passaggi dettagliati per la coltura cellulare, la preparazione della piastra di imaging e la trasfezione di cellule HepG2 per esprimere biosensori basati su FRET, insieme a linee guida specifiche per la configurazione hardware e software del microscopio confocale a scansione laser. I risultati hanno dimostrato modelli unici di segnalazione dell'insulina nelle cellule HepG2, che mostrano un interruttore irreversibile caratterizzato dall'attivazione costitutiva di Akt con una soglia di accensione definita ma nessuna soglia di spegnimento. Al contrario, i miotubi mostrano un interruttore reversibile. L'attivazione persistente di Akt nelle cellule HepG2 suggerisce meccanismi alla base della resistenza all'insulina e della disregolazione metabolica nelle cellule epatiche, con implicazioni più ampie per la comprensione della progressione dei disturbi metabolici e del cancro. Questo protocollo offre un quadro prezioso per esplorare le vie di segnalazione correlate ad Akt e i comportamenti cellulari in vari contesti patologici.

Il diabete mellito rappresenta una delle principali sfide per la salute globale, caratterizzato da insulino-resistenza e alterata omeostasi del glucosio¹. Una comprensione completa delle vie di segnalazione dell'insulina è fondamentale per chiarire la fisiopatologia di questa malattia, poiché l'insulina svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo del glucosio, nella crescita cellulare e nella sopravvivenza². Numerosi studi hanno dimostrato che la segnalazione dell'insulina ha un impatto significativo su vari tipi di cancro, collegando l'insulino-resistenza alla progressione del tumore e agli scarsi risultati dei pazienti 3,4,5,6. Le cellule HepG2, una linea cellulare di carcinoma epatocellulare comunemente usata, fungono da modello prezioso per studiare l'insulino-resistenza e l'interazione tra disregolazione metabolica e sviluppo del cancro⁷. Tradizionalmente, i ricercatori hanno visto le risposte all'insulina come classificate; Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che le singole cellule possono mostrare risposte bistabili, mostrando transizioni salienti tra la mancata risposta e la risposta completa che si verificano a specifiche soglie di concentrazione di insulina ^8,9.

L'imaging FRET (Förster Resonance Energy Transfer) è un potente strumento per studiare la distribuzione spazio-temporale delle biomolecole nelle cellule viventi¹⁰. Estraendo informazioni dalla dinamica molecolare, FRET fornisce informazioni su processi come l'attivazione di Akt in tempo reale, rendendola una tecnica inestimabile per lo studio delle cellule viventi^11,12. Questo metodo di imaging si è dimostrato essenziale nello studio delle dinamiche cellulari, in particolare nelle malattie metaboliche e nel cancro, dove le interazioni molecolari precise sono cruciali¹³. FRET consente inoltre il monitoraggio in tempo reale delle interazioni molecolari, facendo luce su meccanismi come l'insulino-resistenza e la progressione tumorale^14,15. I biosensori FRET sono fondamentali nella ricerca sul cancro per lo studio dei microambienti tumorali, della resistenza ai farmaci e dei disturbi metabolici¹⁶. I metodi di rilevamento FRET, come l'emissione sensibilizzata (SE), lo sbiancamento accettore (AB), la microscopia per imaging a fluorescenza (FLIM) e la spettroscopia, offrono vantaggi distinti per quantificare le interazioni molecolari¹⁷. SE misura il trasferimento di energia tra i fluorofori donatore e accettore, determinando uno spostamento misurabile negli spettri di emissione che è correlato alla vicinanza di biomolecole interagenti¹⁸. AB utilizza il fotosbiancamento selettivo del fluoroforo accettore e tiene traccia dei cambiamenti nella fluorescenza del donatore, il che consente ai ricercatori di valutare la cinetica e le distanze di interazione¹⁹. FLIM valuta i tassi di decadimento della fluorescenza del fluoroforo donatore, direttamente influenzati dall'efficienza FRET, per fornire misurazioni precise su scala nanometrica delle interazioni molecolari²⁰.

Utilizzando le tecniche FRET, abbiamo recentemente dimostrato risposte insuliniche bistabili in miotubi^derivati da C2C12 8,9,21,22,23,24. Le distinte soglie di accensione e spegnimento per l'attivazione di Akt, come abbiamo scoperto, suggeriscono che la dose-risposta graduata all'insulina in tutto il corpo smentisce la complessità della cascata di segnalazione subcellulare a partire dallo stimolo insulinico, che culmina in una risposta tutto o niente a livello di singola cellula 21,22,23,24 . Per testare la presenza di bistabilità in altri tipi di cellule, abbiamo stimolato le cellule HepG2 con insulina e registrato la loro risposta utilizzando l'imaging FRET a cellula singola. Abbiamo stimolato le cellule HepG2 con concentrazioni variabili di insulina e monitorato l'attività di Akt a livello di singola cellula utilizzando un biosensore Akt. Il biosensore Akt comprende la proteina fluorescente ciano potenziata (ECFP)²⁵ come fluoroforo donatore e la variante più brillante della proteina fluorescente gialla (YPet)²⁶ come fluoroforo accettore, collegato da un linker Eevee contenente la sequenza peptidica SGRPRTTTFADSCKP. Questo peptide funge da substrato per Akt fosforilato (pAkt), ottimizzato dalla glicogeno sintasi chinasi 3β umana (GSK3β). Nel suo stato non fosforilato, la separazione spaziale tra i fluorofori donatori e accettori supera il raggio di Förster, che inibisce il trasferimento di energia. Dopo la stimolazione dell'insulina, si verifica la fosforilazione di Akt che porta alla fosforilazione di SGRPRTTTFADSCKP. Questo processo induce un cambiamento conformazionale che porta il donatore e l'accettore all'interno del raggio di Förster, consentendo FRET²⁷. Di conseguenza, l'intensità del segnale FRET è correlata alla quantità di molecole di Akt fosforilate e consente la quantificazione in tempo reale delle risposte cellulari mediate dall'insulina.

Questo protocollo, inizialmente sviluppato per studiare la segnalazione dell'insulina in miotubi derivati da C2C12, è stato applicato con successo alle cellule HepG2 e utilizzato su diverse piattaforme hardware e software, dimostrando così la sua applicabilità, adattabilità e versatilità. Le cellule HepG2 mostrano un'attività costitutiva di Akt, che le rende un modello in vitro ideale per studiare la segnalazione dell'insulina specifica del fegato e i processi metabolici. Le caratteristiche principali del protocollo sono descritte passo dopo passo nella sezione relativa al protocollo.

Una panoramica delle fasi sperimentali coinvolte nell'imaging di cellule vive FRET per monitorare la fosforilazione di Akt in singole cellule HepG2 è mostrata nella Figura 1.

1. Acquisizione, propagazione e purificazione dei plasmidi

NOTA: Questa sezione descrive i passaggi essenziali per l'acquisizione, l'amplificazione e la purificazione del plasmide necessari per l'analisi FRET su singola cellula.

1. Utilizzare il plasmide pEevee-iAkt-NES-YPet (Figura 2A).
   NOTA: Il plasmide è stato generosamente fornito dal Prof. Kazuhiro Aoki presso l'Istituto Nazionale di Biologia di Base (NIBB), Giappone.Le mappe plasmidi per i biosensori FRET utilizzati per il monitoraggio di Akt e i rispettivi controlli sono illustrati nella Figura 2. Il pEevee-iAkt-NES-ECFP (donatore; Figura 2B) e pEevee-iAkt-NES-Ypet (accettore; Figura 2C) i plasmidi sono utilizzati come controlli di calibrazione durante gli esperimenti FRET⁹.
   NOTA: La Figura 3 mostra la composizione e il meccanismo del biosensore FRET intramolecolare.
2. Per propagare il plasmide, eseguire la trasformazione batterica utilizzando cellule di E. coli chimicamente competenti (vedi Tabella dei materiali). Placcare le cellule trasformate su agar Luria-Bertani (LB) contenente 100 μg/mL di ampicillina e incubare per una notte a 37 °C. Il giorno successivo, selezionare una colonia resistente all'ampicillina e coltivarla in brodo LB integrato con 100 μg/mL di ampicillina per l'amplificazione plasmidica.
3. Per purificare il DNA plasmidico, utilizzare un kit di purificazione del DNA plasmidico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) per ottenere un'elevata purezza e resa. Valutare la qualità del DNA misurando i rapporti di assorbanza (A260/A280 e A260/A230) utilizzando uno spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali). I rapporti compresi tra 1,8-2,0 e 2,0-2,2 sono considerati ottimali. Verificare l'integrità del plasmide attraverso l'elettroforesi su gel di agarosio per assicurarsi che sia adatto alla trasfezione.

2. Procedura di coltura cellulare

NOTA: Eseguire tutte le procedure di coltura cellulare all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere un ambiente sterile e prevenire la contaminazione. Il flusso di lavoro della coltura cellulare HepG2 è mostrato nella Figura 4. Il terreno completo per le cellule HepG2 è costituito da un terreno essenziale minimo (MEM), 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1 mM di piruvato di sodio, 2 mM di integratore di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 2,5 μg/mL di soluzione antibiotico-antimicotica (vedi Tabella dei materiali, Tabella 1).

1. Scongelare rapidamente le cellule HepG2 congelate ponendo la fiala in un termomiscelatore a 37 °C o in un bagnomaria fino a completo scongelamento.
2. Trasferire le cellule scongelate in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di terreno di crescita completo (vedere la Tabella dei Materiali).
   NOTA: Preriscaldare l'intero terreno di coltura a 37 °C prima dell'uso per ridurre al minimo lo shock termico delle cellule.
3. Centrifugare la provetta a 200 x g per 5 minuti per pellettare le cellule.
4. Aspirare con cura il surnatante utilizzando una punta per pipetta a foro largo per evitare di disturbare il pellet cellulare.
5. Risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura completo fresco.
6. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone per coltura tissutale da 75 cm².
7. Incubare il matraccio a 37 °C in atmosfera umidificata con CO₂ al 5%
   NOTA: Osservare le cellule nelle successive 24-48 ore per confermare l'attaccamento e valutare il recupero. Non disturbare le celle per almeno 4 ore per garantire un corretto fissaggio prima di cambiare il fluido. Evitare di aprire frequentemente l'incubatrice durante le prime 4 ore, poiché ciò potrebbe interrompere l'attacco delle cellule. Seguire i protocolli istituzionali di biosicurezza e utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati per mantenere un ambiente di lavoro sicuro durante tutte le procedure di coltura cellulare. Subcoltura delle cellule HepG2 quando raggiungono la confluenza del 70%-80% per mantenere condizioni di crescita ottimali e prevenire il sovraffollamento, che può influire sulla vitalità cellulare e sul potenziale di crescita.
8. Per la subcoltura, aspirare il terreno e sciacquare le cellule una volta con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
9. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% per coprire il monostrato cellulare (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Assicurarsi che la tripsina sia preriscaldata a 37 °C per un'attività ottimale. Non tripsinizzare eccessivamente le cellule, poiché ciò potrebbe ridurre la vitalità. Monitorare le cellule al microscopio per confermare il distacco.
10. Incubare a 37 °C per circa 5 min.
11. Quando le cellule si staccano, aggiungere 2 mL di terreno completo per neutralizzare la tripsina e raccogliere le cellule mediante pipettaggio.
12. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare per rompere i grumi e ottenere una sospensione a cellula singola.
13. Aggiungere 3 mL di terreno completo a ciascun nuovo pallone, quindi trasferire le cellule in ciascun pallone con un rapporto di divisione di 1:2.
    NOTA: Per i primi passaggi, dividere le celle a una diluizione di 1:2. Dopo i passaggi 4-5, possono essere eseguite diluizioni di 1:4 o 1:5, a seconda dei casi.
14. Incubare le cellule a 37 °C in atmosfera umidificata con CO₂ al 5%.
    NOTA: Controllare le celle dopo 24 ore per confermare l'attaccamento e valutare il recupero.
15. Per la coltura di routine, sostituire il terreno di coltura ogni 2-3 giorni o prima se l'indicatore di pH cambia da rosa a giallo, indicando acidificazione.
    NOTA: Non lasciare che il terreno diventi troppo acido, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule.
16. Controllare regolarmente la morfologia cellulare al microscopio per garantire la salute delle cellule.
    NOTA: Per la conservazione a breve termine, congelare le celle HepG2 a -80 °C; Per la conservazione a lungo termine, conservare in azoto liquido. La composizione del mezzo di congelamento utilizzato in questo esperimento è descritta nella (Tabella 2).

3. Rivestimento di piastre di imaging con poli-l-lisina

1. Utilizzare 1 mL di una soluzione di poli-L-lisina 0,1 mg/mL per piastra di imaging per coprire l'intera superficie (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Regolare la concentrazione di poli-L-lisina in base ai requisiti specifici del tipo di cella.
2. Scuotere delicatamente il piatto per ottenere un rivestimento uniforme della superficie di coltura.
   NOTA: Garantire condizioni sterili durante tutto il processo per evitare contaminazioni.
3. Incubare le piastre per una notte a temperatura ambiente (RT).
4. Aspirare la soluzione di poli-L-lisina in eccesso dalle piastre pipettandola.
5. Risciacquare la superficie con PBS tre volte, riposando ogni volta per 5 minuti (vedi Tabella dei Materiali). Rimuovere completamente la poli-L-lisina non legata dalla piastra di imaging per prevenire l'inibizione della crescita cellulare. Sciacquare delicatamente le piastre per evitare di raschiare o danneggiare il fondo del vetro.
6. Asciugare all'aria le piastre di imaging rivestite a 37 °C per almeno 3 ore.
7. Utilizzare immediatamente le piastre per immagini rivestite o conservarle a 4 °C per un massimo di 2 settimane.

4. Trasfezione di cellule HepG2

NOTA: Il metodo di trasfezione HepG2 è illustrato nella Figura 5.

1. Seminare le cellule HepG2 in piastre di imaging pre-rivestite 24-48 ore prima della trasfezione per assicurarsi che raggiungano il 70%-90% di confluenza.
2. Scongelare il reagente di trasfezione e il plasmide che codifica il biosensore FRET su ghiaccio. Agitare accuratamente ed eseguire una breve centrifuga (ad es. 5.000 x g per 5 s) prima dell'uso (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Assicurarsi che il reagente di trasfezione e il plasmide siano completamente scongelati prima dell'uso.
   ATTENZIONE: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento, in quanto ciò potrebbe ridurre l'efficienza del reagente di trasfezione.
3. Aggiungere 8 μg di plasmide codificante il biosensore FRET con il tampone di reazione fino a un volume finale di 100 μL. Mescolare bene agitando per 5 s ad alta velocità (circa 3.000-5.000 x g).
   NOTA: Aggiungere sempre il plasmide al tampone prima di aggiungere il reagente di trasfezione a base di polimero. Almeno 50 μl della soluzione devono essere costituiti dal tampone di reazione (vedi Tabella dei materiali).
4. Aggiungere 2,4 μl del polimero di trasfezione alla provetta contenente il DNA plasmidico diluito. Mescolare bene agitando per 15 s ad alta velocità (circa 3.000-5.000 × g).
   NOTA: Utilizzare sempre 0,3 μl di polimero di trasfezione per 1 μg di DNA.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che il polimero di trasfezione sia accuratamente miscelato con il DNA plasmidico per formare complessi di nanoparticelle uniformi.
5. Incubare la miscela di biosensore e polimero a 37 °C per 15 minuti per consentire la formazione di complessi di nanoparticelle.
   NOTA: Evitare di tenere il polimero di trasfezione in soluzione per più di 30 minuti, poiché ciò potrebbe ridurre l'efficienza di trasfezione.
   ATTENZIONE: Monitorare attentamente il tempo di incubazione per evitare un'incubazione eccessiva, che può portare a una riduzione dell'efficienza di trasfezione.
6. Centrifugare la provetta per 5 s a 5.000 x g per raccogliere il contenuto sul fondo, quindi aggiungere tutti i 100 μl di soluzione di complesso di nanoparticelle goccia a goccia al terreno di coltura cellulare. Scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro per mescolare.
   NOTA: Assicurarsi che la soluzione del complesso di nanoparticelle venga aggiunta goccia a goccia per distribuirla uniformemente sul terreno di coltura cellulare.
   ATTENZIONE: Evitare un forte dondolio, in quanto ciò potrebbe spostare le cellule o causare una distribuzione non uniforme dei complessi.
7. Incubare la piastra a 37 °C per 4 ore o tutta la notte.
   NOTA: Il tempo di incubazione può essere regolato in base alle esigenze sperimentali, ma 4 ore sono in genere sufficienti per una trasfezione efficiente.
   ATTENZIONE: Evitare l'incubazione prolungata (>16 ore), poiché ciò potrebbe ridurre la vitalità cellulare.
8. Rimuovere i complessi di nanoparticelle dalle cellule mediante aspirazione, sostituirli con 2 mL di terreno di coltura completo fresco e rimettere la piastra nell'incubatore a 37 °C fino al momento dell'analisi. Il picco di espressione raggiunge tipicamente le 48 ore dopo la trasfezione.
9. Analizzare le cellule al microscopio a fluorescenza.
   NOTA: Assicurarsi che il microscopio sia calibrato correttamente per l'imaging a fluorescenza per ottenere risultati accurati.
   ATTENZIONE: Ridurre al minimo l'esposizione delle cellule alla luce intensa durante l'imaging per prevenire la fototossicità.

5. Fame delle cellule HepG2

NOTA: Dopo aver completato la fase di trasfezione, affamare le cellule prima della stimolazione con insulina e dell'imaging FRET. Ciò riduce al minimo l'attivazione della via Akt dovuta all'insulina presente nell'FBS e garantisce livelli basali costanti di attività Akt. La composizione del mezzo di innesto utilizzato in questo esperimento è descritta in (Tabella 3). BSA si presenta in polvere. Per preparare una soluzione allo 0,1% (p/v), ricostituire 0,1 g di BSA in 3 mL di DMEM, mescolando accuratamente. Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,45 μm e regolare il volume finale a 100 mL aggiungendo DMEM.

1. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare le piastre di imaging con 1 PBS due volte per 5 minuti ciascuna.
   NOTA: I due lavaggi PBS aiutano a rimuovere completamente il siero residuo e qualsiasi insulina o fattore di crescita che possa interferire con l'esperimento.
2. Aggiungere 2 mL di terreno di prova alle piastre di imaging (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere delicatamente il terreno attorno al bordo del piatto per evitare di staccare le celle dal fondo del bicchiere. Incubare a 37 °C per 4 ore.
   NOTA: L'incubazione di 4 ore è ottimale per sincronizzare il metabolismo cellulare; Tuttavia, la durata può essere estesa a seconda delle esigenze sperimentali.

6. Imaging FRET su cellule vive per cellule HepG2

NOTA: Questa sezione fornisce istruzioni per l'imaging FRET su cellule vive per monitorare le dinamiche spazio-temporali della fosforilazione di Akt in singole cellule HepG2. È essenziale ottimizzare la configurazione del microscopio, le procedure di manipolazione e le condizioni di imaging per le cellule HepG2 vive, come descritto di seguito. La configurazione del microscopio è fondamentale per ottimizzare le condizioni di imaging per l'imaging FRET. Seguire la configurazione della microscopia a scansione laser confocale (CLSM) del PC/passo dopo passo secondo le istruzioni del produttore per garantire un funzionamento stabile. La configurazione CLSM personalizzata per l'imaging FRET è mostrata in (Figura 6).

1. Accendere l'interruttore remoto per alimentare il microscopio, il computer, lo scanner, il lancio laser, il piezoelettrico e la sorgente luminosa a LED per epifluorescenza. Assicurarsi che tutti i componenti siano collegati correttamente prima dell'accensione per evitare potenziali danni.
2. Ruotare la chiave in posizione ON sul lancio laser e premere i pulsanti per attivare entrambi i laser necessari per FRET (linee laser a 457 nm e 514 nm).
   NOTA: Assicurarsi che siano presenti i filtri e le impostazioni appropriati per un'imaging FRET ottimale. La selezione della linea laser deve essere basata sui profili di eccitazione ed emissione del biosensore.
3. Accendere la ciabatta per alimentare il computer e il monitor collegati al microscopio.
   NOTA: Assicurarsi che tutti i collegamenti siano sicuri prima dell'accensione per evitare danni alle apparecchiature.
4. Accedi a Windows e avvia il software di microscopia.
5. Fare clic su A1 per l'acquisizione per avviare la configurazione dell'imaging. Selezionare le configurazioni ottiche appropriate in base ai requisiti dell'esperimento FRET.
6. Regolare la potenza del laser e la sensibilità del rivelatore secondo necessità per ottenere condizioni di imaging ottimali. Installare con cura l'incubatore superiore del tavolino del microscopio e fissarlo con le viti.
   NOTA: Non serrare eccessivamente le viti per evitare danni all'incubatrice o al tavolino del microscopio.
7. Riempire il bagnomaria interno con acqua sterile bidistillata (ddH₂O). Installare saldamente il riscaldatore superiore e accendere l'alimentazione per il stage riscaldatore, riscaldatore per vasca e riscaldatore per lenti (Figura 7A).
   NOTA: Non riempire eccessivamente per evitare fuoriuscite nel sistema. Assicurarsi che tutti i riscaldatori funzionino correttamente per mantenere condizioni di temperatura costanti per l'imaging di cellule vive.
8. Utilizzare la lente a immersione in olio 40x per l'imaging (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Fare riferimento al sito Web del produttore per le specifiche tecniche.
9. Pulire la lente dell'obiettivo con carta per lenti inumidita con etanolo al 95%. Posizionare una piccola goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo (Figura 7B). Posizionare la capsula di imaging contenente le cellule HepG2 sul tavolino del microscopio e fissarla con il supporto (Figura 7C).
   NOTA: Assicurarsi che la piastra di imaging sia correttamente allineata e fissata per evitare qualsiasi movimento durante l'imaging. Evitare la pressione contro l'obiettivo per evitare danni sia all'obiettivo che al fondo di vetro del piatto.
10. Chiudere la camera e incubare le cellule all'interno della camera delle cellule vive per 1-2 ore per consentire loro di equilibrarsi (Figura 7D).
11. Durante l'imaging time-lapse, fare una pausa a intervalli specifici e rimuovere delicatamente il terreno (Figura 7E), quindi aggiungere 1 ml di terreno appena preparato con la concentrazione di insulina data (Figura 7F, Tabella dei materiali).
    NOTA: Preparare una soluzione madre di insulina da 1 mg/mL sciogliendo 1 mg di insulina in 1 mL di acido acetico da 10 mM. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa sterile da 0,2 μm e conservare le aliquote a -20 °C.
12. Avviare la finestra Acquisizione ND dal menu File del software di microscopia.
    NOTA: La configurazione dell'acquisizione ND è mostrata in (Figura 8).
13. Selezionare la scheda Tempo per impostare l'intervallo, la durata e i loop desiderati per l'imaging time-lapse. Quindi, fai clic sulla scheda XY e premi il pulsante + aggiungi per includere le singole cellule HepG2 per l'imaging.
14. Per aggiungere più celle, individuare le celle adatte, eseguire la scansione, regolare la messa a fuoco e bloccare la funzione di diffusione dei punti (PSF). Ripetere questo passaggio per ogni nuova cella aggiunta per l'imaging. Scansiona più cellule in posizioni diverse all'interno delle piastre di imaging per identificare le varie cellule bersaglio da includere.
15. Fare clic sull'icona X rossa per deselezionare le celle. Seleziona la casella "Z" per impostare la posizione Z. Dopo aver selezionato tutti i parametri, inserisci il nome dell'esperimento nella casella "Nome file".
16. Fare clic su Sfoglia per scegliere la cartella di destinazione, quindi selezionare la casella Salva su file. Premi la scheda Esegui ora per avviare l'acquisizione ND. La finestra di acquisizione ND mostrerà l'avanzamento in tempo reale dell'imaging time-lapse, incluso il tempo trascorso e rimanente.
17. Registra le misurazioni di base per un massimo di 30 minuti senza stimolare le cellule con l'insulina.
18. Individua le celle adatte, ingrandisci/rimpicciolisci per mettere a fuoco una singola cellula e seleziona le celle con un'elevata intensità di fluorescenza. Aggiungere le celle una alla volta, fino a un massimo di 6 celle.
    NOTA: Limitare il numero di celle per evitare ritardi nell'acquisizione dell'immagine e il congelamento della finestra durante l'imaging.
19. Impostare l'ora e la frequenza di imaging per l'imaging time-lapse. Avviare l'imaging time-lapse.
    NOTA: Assicurarsi che tutti i parametri, inclusi il tempo di esposizione e la potenza del laser, siano ottimizzati prima di iniziare la sessione di imaging.
20. Mettere in pausa l'imaging a intervalli regolari, rimuovere delicatamente il terreno dal piatto con fondo di vetro e aggiungere 1 ml di terreno integrato con la concentrazione di insulina appropriata.
21. Riprendere l'acquisizione dell'immagine. Ripetere il passaggio 6.20 secondo necessità.
22. Al termine dell'esperimento, fare clic sulla scheda Fine per chiudere. Esegui il backup e archivia le immagini acquisite in modo sicuro per l'analisi.

7. Analisi dei dati

1. Correggere i dati di imaging FRET time-lapse pre-elaborati da campioni di controllo per la diafonia spettrale e l'autofluorescenza CFP, il che si traduce in valori FRET corretti e un'efficienza FRET precisa. Utilizzare il software di imaging per l'acquisizione, l'elaborazione e l'analisi delle immagini FRET, seguendo i protocolli delineati negli studi precedenti 27,28,29,30 (Figura 9).

8. Calcoli dell'efficienza FRET

1. Per determinare l'efficienza FRET, acquisire sette immagini: cella (I_DA(D), I_DD(D), I_DA(A), I_AA(A), I _DD, I_AA e I_DA). Calcola l'efficienza FRET utilizzando la seguente formula:
   
   dove FRET_Corrected si ottiene dall'equazione:
   
   dove d e a sono definiti come:
   
   
   Qui I_DA, I_DD e I_AA rappresentano immagini di cellule trasfettate con il biosensore. I_DA(D) e I_DD(D)) sono immagini di controllo solo donatore, e I_DA(A) e I_AA(A) sono immagini di controllo solo accettore.

9. Acquisizione delle immagini

1. I_DA : Ottenere l'immagine mediante eccitazione del donatore (434 nm) con emissione accettore (530 nm).
2. I_DD : Ottenere l'immagine mediante eccitazione del donatore (434 nm) con emissione del donatore (477 nm).
3. I_AA : Ottenere l'immagine mediante eccitazione dell'accettore (517 nm) con emissione dell'accettore (530 nm).
4. I_DA(D) e I_DA(A) : Acquisiscono l'immagine utilizzando la stessa eccitazione ed emissione di I_DA ma da cellule che esprimono rispettivamente solo il donatore e l'accettore.
5. I_DD(D) : Acquisire l'immagine alle stesse condizioni di I_DD per il controllo solo donatore.
6. I_AA(A) : Ottiene l'immagine utilizzando le stesse condizioni di I_AA ma è specifica per il controllo solo accettore.

10. Correzione dello sfondo

1. Aprire il software di analisi delle immagini sul computer. Dalla barra dei menu in alto, accedi al menu File . Seleziona Apri o Apri file dalle opzioni a discesa.
2. Passare alla directory contenente i dati dell'immagine time-lapse. Individua l'immagine time-lapse che richiede l'analisi (ad esempio, il formato nd2).
3. Scegli il file e fai clic su Apri o OK per caricarlo nel software per la visualizzazione e l'analisi. Definite un'area di interesse (ROI) all'interno della cella (o utilizzate l'intera cella come ROI) e registrate il valore di grigio di ogni pixel all'interno di questa regione.
4. Scegli un'area priva di celle come sfondo e calcola il suo valore medio di grigio. Crea l'immagine corretta sottraendo questa media di sfondo dal valore di grigio di ciascun pixel all'interno del ROI della cella.

11. Eliminazione del cross-through (diafonia) dei FRET

NOTA: La sovrapposizione spettrale tra l'emissione del donatore e l'eccitazione dell'accettore è illustrata nella Figura 3B, che è fondamentale per l'efficienza FRET e il processo di trasferimento dell'energia. Il bleed-through nell'imaging FRET time-lapse è una sfida significativa che deriva dalla sovrapposizione spettrale dei fluorofori donatore e accettore, che porta a misurazioni imprecise. La diafonia è intrinseca perché gli spettri dei fluorofori donatori e accettori si sovrappongono in una certa misura (Figura 3C, D). Questo problema è aggravato da fattori quali alte concentrazioni di fluorofori e configurazioni improprie dei filtri. Affrontare il problema del bleed-through è fondamentale per garantire l'affidabilità delle misure FRET.

1. Fare riferimento a uno studio precedente per un metodo per mitigare gli effetti di sanguinamento⁹.

12. Quantificazione e analisi statistica

1. Esegui analisi statistiche utilizzando un software di analisi statistica.

Per studiare l'attivazione di Akt nelle cellule HepG2, le cellule sono state seminate su piastre di imaging pre-rivestite e trasfettate con il biosensore pEevee-iAkt-NES basato su FRET (Figura 2A), progettato per consentire il monitoraggio in tempo reale della fosforilazione di Akt. Dopo la trasfezione, le cellule sono state sottoposte a fame sierica per 4 ore in un terreno privo di siero per sincronizzare il loro stato metabolico e ridurre al minimo la segnalazione dell'insulina basale.

Le cellule sono state successivamente esposte a concentrazioni variabili di insulina (0 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM e 0 pM) per attivare sistematicamente la via di segnalazione dell'insulina. Come mostrato nella Figura 10A, è stato osservato un aumento dose-dipendente della fosforilazione di Akt. In particolare, un forte aumento della fosforilazione si è verificato a 300 pM di insulina, segnando la soglia per la massima attivazione di Akt. Oltre questa concentrazione, i livelli di fosforilazione si sono stabilizzati, con un aumento graduale osservato fino a 500 pM.

È interessante notare che, quando le concentrazioni di insulina sono state ridotte sequenzialmente da 500 pM a 0 pM, l'attivazione di Akt è stata sostenuta, con livelli di fosforilazione che sono rimasti elevati e non sono riusciti a tornare al basale. Questo fenomeno indica l'attivazione costitutiva di Akt, suggerendo che una volta superata la soglia di attivazione a 300 pM di insulina, la fosforilazione di Akt rimane attiva indipendentemente dalle successive riduzioni della concentrazione di insulina.

I dati normalizzati presentati nella Figura 10B, C sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti. In questi esperimenti, in cui le cellule sono state stimolate con concentrazioni di insulina in sequenza crescenti (0 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM e 500 pM), seguite da una diminuzione graduale (500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM e 0 pM). Questo esperimento ha dimostrato un modello simile di attivazione di Akt, confermando la risposta dose-dipendente e l'attività sostenuta di Akt oltre la soglia di attivazione.

Figura 1: Flusso di lavoro dell'imaging FRET nelle cellule HepG2 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Mappe plasmidiche di biosensori FRET per il monitoraggio di Akt. (A) pEevee-iAkt. (B) pEevee-iAkt-NES-ECFP (donatore). (C) pEevee-iAkt-NES-YPet (accettore). Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Composizione e meccanismo del biosensore FRET intramolecolare. (A) Il fosfo-Akt fosforila il peptide substrato (SGRPRTTTFADSCKP), che promuove il legame con il PBD e induce uno spostamento conformazionale, consentendo il trasferimento di energia dal fluoroforo donatore al fluoroforo accettore^27,31. (B) Sovrapposizione spettrale tra l'emissione del donatore e l'eccitazione dell'accettore. (C) L'interazione di eccitazione si verifica a causa della sovrapposizione tra gli spettri di eccitazione di ECFP e YPet. (D) La diafonia delle emissioni si verifica a causa della sovrapposizione tra gli spettri di emissione di ECFP e YPet. Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Flusso di lavoro delle colture cellulari HepG2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Trasfezione di HepG2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Configurazione CLSM personalizzata per l'imaging FRET. (A) Selezionare i canali desiderati e configurare le impostazioni nel pannello del percorso ottico. (B) Nel pannello delle impostazioni Aplus, scegliere i canali appropriati, impostare la potenza e l'intensità del laser, il tempo di permanenza dei pixel, il foro stenopeico e altri parametri pertinenti. Mantenere l'offset impostato su "0" come valore predefinito. Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Impostazione del microscopio e preparazione del campione per l'imaging di cellule vive. (A) Installare l'incubatore TOKAI HIT Stage Top per regolare la temperatura e i livelli di CO₂ . (B) Applicare olio da immersione sulla lente da immersione in olio da 40×. (C) Montare una capsula di imaging da 35 mm con fondo in vetro sul tavolino a temperatura controllata. (D) Pre-incubare i campioni nella camera delle celle vive per equilibrarli con le condizioni ambientali. (E) Rimuovere il fluido utilizzando una pompa peristaltica precisa. (F) Aggiungere terreni integrati con insulina al piatto utilizzando una punta di pipetta fine. Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Impostazione dell'acquisizione ND per l'imaging time-lapse. (A) Nella finestra Acquisizione ND, abilitare l'opzione time per impostare l'intervallo, la durata e il numero di loop per l'esperimento time-lapse. (B) Fare clic sull'opzione XY per selezionare o deselezionare singole celle per l'imaging. (C) Abilita l'opzione Z per bloccare la posizione Z e fai clic su "Esegui" per riprendere l'esperimento. (D) Verrà visualizzata la finestra di avanzamento ND che mostrerà lo stato in tempo reale dell'esperimento. Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Flusso di lavoro per l'analisi dei dati FRET. Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Immagini time-lapse rappresentative e rapporto medio normalizzato del segnale FRET della fosforilazione di Akt in singole cellule HepG2. (A) Le cellule HepG2 hanno mostrato la massima efficienza FRET quando stimolate con insulina 300 pM, che ha segnato la soglia per la massima attivazione di Akt. È stato osservato un graduale aumento dell'efficienza del FRET quando le concentrazioni di insulina sono salite a 500 pM. Anche con una diminuzione graduale della concentrazione di insulina da 500 pM a 0 pM a vari intervalli, l'attivazione sostenuta di Akt persisteva, indicando la fosforilazione costitutiva di Akt. (B) Segnale FRET tracciato contro la concentrazione di insulina, illustrando una risposta irreversibile di tipo switch. (C) Segnale FRET tracciato rispetto al tempo trascorso, con barre di errore che indicano la deviazione standard. Questa cifra è stata adottata con il permesso di Akhtar et ^al.8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: MEM Composizione completa dei supporti.

Tabella 2: Composizione del mezzo di congelamento.

Tabella 3: Composizione del mezzo di digiuno.

Il protocollo per l'imaging FRET su cellule vive per monitorare la fosforilazione di Akt nelle cellule HepG2 prevede diversi passaggi chiave per garantire risultati affidabili e riproducibili. La prima fase critica è la coltura cellulare, che include la manutenzione ordinaria delle cellule, il rivestimento delle piastre di imaging e la semina cellulare. Un rivestimento adeguato è essenziale per l'adesione delle cellule durante gli esperimenti di imaging time-lapse, in quanto garantisce un'aderenza stabile delle cellule, previene il distacco e riduce al minimo la deriva, che può portare a dati incoerenti ^9,32. Le variazioni dello spessore della cellula o delle strutture subcellulari possono causare la sfocatura di parti della cellula, compromettendo l'accuratezza della misurazione. La temperatura, il pH e le concentrazioni di ioni influiscono sui segnali FRET e aggiungono variabilità 33,34,35. Un corretto attacco delle cellule supporta la salute cellulare, mantiene l'integrità della segnalazione e garantisce misurazioni FRET accurate. La trasfezione di cellule HepG2 con il biosensore Akt basato su FRET è un passaggio critico, poiché l'efficienza di trasfezione influisce direttamente sull'intensità e la consistenza del segnale FRET³¹. Tuttavia, la trasfezione transitoria porta intrinsecamente all'eterogeneità nell'espressione dei biosensori. Questa variabilità può essere minimizzata ottimizzando le condizioni di trasfezione, implementando controlli rigorosi e selezionando cellule con intensità di fluorescenza uniforme. Garantire un'espressione omogenea in tutta la popolazione cellulare è essenziale per ottenere risultati coerenti e affidabili. La calibrazione delle emissioni sensibilizzate (SE) utilizzando campioni di controllo, come i costrutti solo donatore, solo accettore e donatore-accettore, è fondamentale per una quantificazione accurata dell'efficienza FRET. Questa calibrazione corregge la diafonia spettrale e stabilisce misurazioni di base coerenti, consentendo un'interpretazione precisa dei dati 28,36,37,38.

Sebbene il metodo SE-FRET fornisca preziose informazioni in tempo reale sulle dinamiche di fosforilazione di Akt, è necessario affrontare diverse limitazioni per garantire risultati accurati e affidabili. La diafonia spettrale tra i fluorofori donatori e accettori può distorcere i segnali FRET, richiedendo l'uso di più campioni di controllo²⁸. Le limitazioni del bleed-through spettrale (SBT) e della profondità di campo in microscopia influiscono in modo significativo sull'accuratezza dell'analisi FRET in cellule con spessore o morfologia variabili. Queste sfide richiedono metodi di correzione avanzati per migliorare l'affidabilità delle misure^27,39. Per affrontare queste sfide, i ricercatori devono ottimizzare l'espressione del fluoroforo donatore/accettore, perfezionare le procedure di trasfezione e condurre robusti esperimenti di controllo per correggere segnali non specifici e garantire una raccolta dati precisa^28,39. Un controllo inadeguato di questi fattori potrebbe portare a conclusioni errate, ma tecniche di normalizzazione avanzate, come quelle sviluppate da Hoppe et ^al.40 e Zal e Gascoigne⁴¹, possono correggere l'interferenza spettrale e migliorare l'accuratezza delle misure FRET in ambienti cellulari complessi. Inoltre, i metodi avanzati di normalizzazione FRET, come evidenziato da Hochreiter et ^al.42, consentono l'analisi quantitativa delle interazioni proteiche, comprese le stechiometrie e le affinità relative nelle cellule viventi, fornendo una comprensione più profonda della dinamica delle proteine in varie condizioni.

Oltre a queste limitazioni tecniche, l'integrazione di modelli computazionali delle vie di segnalazione è fondamentale per migliorare l'interpretazione dei risultati SE-FRET. Questi modelli forniscono un quadro strutturato per interpretare dati biologici complessi. Simulando le reti di segnalazione, i ricercatori possono comprendere meglio le dinamiche delle interazioni molecolari e gli effetti delle perturbazioni, portando a previsioni e intuizioni più accurate 43,44,45,46. Ad esempio, gli studi sulla via mTOR hanno identificato interruttori bistabili nell'attivazione di Akt, dove la segnalazione alterna tra stati stabili distinti cruciali per la regolazione di processi come la proliferazione cellulare e la sopravvivenza^47,48. Tali modelli sottolineano la complessità della segnalazione Akt, in particolare nelle cellule tumorali dove l'attivazione persistente guida la progressione della malattia. Integrando l'imaging SE-FRET in tempo reale con i modelli computazionali, i ricercatori possono ottenere informazioni più approfondite su come i cicli di feedback e gli spostamenti temporali nell'attività di Akt influenzano le risposte cellulari, contribuendo a una comprensione più completa delle malattie metaboliche e del cancro 13,48,49,50.

Il metodo basato su FRET offre vantaggi significativi rispetto agli approcci tradizionali per lo studio delle interazioni proteina-proteina e delle dinamiche di segnalazione, in particolare nelle vie metabolicamente regolate⁵¹. A differenza dei saggi biochimici di massa, l'imaging FRET fornisce una risoluzione sia spaziale che temporale a livello di singola cellula, consentendo l'osservazione in tempo reale dei processi dinamici nelle cellule vive. Questa capacità di tracciare gli eventi molecolari a livello di singola cellula fornisce informazioni sull'eterogeneità cellulare, che è importante per capire come i cambiamenti metabolici (come quelli causati dalla disponibilità di nutrienti, dalla segnalazione dell'insulina o dallo stress metabolico) possono influire sulle dinamiche di segnalazione Akt. Rispetto ad altre tecniche basate sulla fluorescenza, FRET è particolarmente sensibile ai cambiamenti nella distanza tra le proteine interagenti, il che lo rende ideale per rilevare cambiamenti conformazionali sottili o transitori e interazioni proteiche ^8,9,52. Tuttavia, il trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) e la microscopia per imaging a fluorescenza con FRET (FLIM-FRET) sono tecniche avanzate per lo studio delle interazioni proteiche, ognuna delle quali offre vantaggi unici in specifici contesti sperimentali. BRET utilizza la luminescenza della luciferasi per ridurre al minimo problemi come il fotosbiancamento e l'autofluorescenza, rendendolo particolarmente efficace per quantificare l'espressione proteica^{di membrana 53}. Al contrario, FLIM-FRET fornisce immagini ad alta risoluzione e analisi quantitativa delle interazioni proteiche, specialmente in condizioni native, misurando le variazioni di durata della fluorescenza^54,55. Sebbene questi metodi abbiano dei limiti, offrono intuizioni complementari in specifici contesti sperimentali.

Il protocollo basato su FRET per il monitoraggio della fosforilazione di Akt nelle cellule vive di HepG2 offre informazioni significative sulla segnalazione cellulare, in particolare nel contesto di malattie metaboliche come il diabete e il cancro. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale dei processi dinamici, migliorando la comprensione del ruolo di Akt nella regolazione metabolica e nella patogenesi della malattia 27,31,56. L'adattabilità dei metodi per studiare l'attivazione di Akt in vari tipi di cellule aumenta significativamente la loro utilità nella ricerca sul cancro. Questa flessibilità consente ai ricercatori di studiare i meccanismi di segnalazione specifici del tipo di cellula, che possono portare all'identificazione di potenziali bersagli terapeutici¹³. Inoltre, la robustezza di questi protocolli consente lo studio di altre vie di segnalazione e interazioni proteiche, migliorando la comprensione dei processi cellulari. Il potenziale per l'adattamento ad alto rendimento di questi metodi apre nuove strade per la scoperta di farmaci, in particolare nel cancro e nelle malattie metaboliche 12,13,56. Lo sviluppo di nuovi biosensori che utilizzano diverse proteine fluorescenti (FP), insieme a tecniche avanzate come la microscopia a fluorescenza (FLIM), ha un potenziale significativo per migliorare l'utilità dei saggi basati su FRET. Queste innovazioni migliorano la sensibilità, riducono la diafonia spettrale, consentono l'imaging multiplexato e forniscono una precisione quantitativa, che amplia l'applicabilità del FRET nella ricerca biomedica. Tali progressi facilitano lo studio di reti di segnalazione complesse, lo screening di farmaci ad alto rendimento e la modellazione delle malattie con maggiore precisione e affidabilità.

In conclusione, sebbene SE-FRET presenti alcune limitazioni, controlli rigorosi e strategie di imaging avanzate affrontano queste sfide. Questo rende SE-FRET uno strumento potente e versatile per chiarire complesse dinamiche cellulari. La sua capacità di osservare in tempo reale la dinamica di singole cellule offre vantaggi distinti rispetto ai saggi di massa e fornisce informazioni sulle interazioni molecolari che altrimenti potrebbero non essere rilevate. Questa capacità è particolarmente importante per lo studio della fosforilazione di Akt, dove la comprensione delle dinamiche spaziali e temporali degli eventi di segnalazione è fondamentale per lo sviluppo di terapie mirate per malattie metaboliche come l'insulino-resistenza e il cancro.

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Natural Science Foundation di Shenzhen (JCYJ20240813113606009), dalla Shenzhen-Hong Kong Cooperation Zone for Technology and Innovation (HZQB-KCZYB-2020056), dalla National Natural Science Foundation of China (32070681), dal National Key R&D Program of China (2019YFA0906002) e dallo Shenzhen Peacock Plan (KQTD2016053117035204).