Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Lo sviluppo di tessuti cardiaci umani funzionali è molto promettente per il progresso delle applicazioni nello screening dei farmaci, nella modellazione delle malattie e nella medicina rigenerativa. Questo protocollo descrive la fabbricazione graduale di tessuti miocardici 3D con mimetismo avanzato della struttura cardiaca nativa combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) con idrogel di fibrina e cellule cardiache derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Il processo prevede l'inclusione di una miscela di cardiomiociti (hiPSC-CM) e fibroblasti cardiaci (hiPSC-CF) all'interno di una matrice di fibrina per creare mini-tessuti, con supporto strutturale fornito da scaffold generati da MEW. Questi scaffold fibrillari sono fabbricati su scala micro e nanometrica, consentendo un controllo preciso sull'architettura delle fibre, che svolge un ruolo chiave nell'organizzazione della distribuzione e dell'allineamento cellulare. Nel frattempo, la matrice di fibrina promuove la vitalità cellulare e imita l'ambiente extracellulare. La caratterizzazione dei tessuti generati rivela sarcomeri ben organizzati all'interno di hiPSC-CM, insieme a un'attività contrattile stabile. I tessuti dimostrano un battito spontaneo costante già due giorni dopo la semina, con funzionalità sostenuta nel tempo. La combinazione di hiPSC-CF con hiPSC-CM migliora l'integrità strutturale dei tessuti, supportando al contempo la vitalità cellulare a lungo termine. Questo approccio offre un metodo riproducibile, adattabile e scalabile per la creazione di modelli biomimetici di tessuto cardiaco, fornendo una piattaforma versatile per test preclinici di farmaci, studi meccanicistici di malattie cardiache e potenziali terapie rigenerative.

La fabbricazione di tessuti funzionali ingegnerizzati cardiaci umani è molto promettente per applicazioni ad alto impatto. Questi vanno dallo sviluppo di modelli di cardiotossicità da farmaci e malattie cardiache umane alla generazione di tessuti terapeutici di dimensioni rilevanti¹. Sebbene gli ultimi 15 anni siano stati testimoni di significativi progressi nel campo, la fabbricazione di miocardio umano altamente mimetico è attualmente ostacolata dalle difficoltà nel riprodurre la complessa organizzazione strutturale e meccanica della sua controparte naturale².

Dal punto di vista biologico, la rivoluzionaria tecnologia di riprogrammazione cellulare ha aperto la possibilità di sviluppare cellule terapeutiche specifiche per il paziente. Attualmente, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono l'unica fonte di cardiomiociti umani in un contesto personalizzato. Un'elevata resa di cardiomiociti può essere ottenuta seguendo robusti protocolli di differenziamento ^3,4. Un problema chiave è il grado di maturazione, poiché i cardiomiociti umani derivati da hiPSC (hiPSC-CM) attualmente utilizzati mostrano un fenotipo immaturo in condizioni convenzionali di differenziazione 2D⁵. Questo è legato al fatto che l'organizzazione strutturale del tessuto cardiaco è molto complessa, assolutamente diversa dalle colture 2D convenzionali. Inoltre, il miocardio è composto da diverse cellule cardiovascolari, compresi i non miociti come i fibroblasti cardiaci, la muscolatura liscia e le cellule endoteliali, disposte in modo ordinato attraverso una specifica struttura 3D, che consente un efficiente pompaggio del sangue ^6,7. Pertanto, sono necessari mini tessuti cardiaci umani altamente strutturati composti da tutti i principali tipi di cellule per generare tessuti biomimetici fisiologicamente rilevanti.

L'applicazione di nuovi approcci di biofabbricazione può rompere questa situazione di stallo. Tra queste, la scrittura elettrofilante a fusione (MEW), un'avanzata tecnologia di stampa 3D in grado di fornire alta precisione e risoluzione. Nella MEW, un campo elettrico viene utilizzato per depositare un polimero fuso sotto forma di fibre nell'intervallo di dimensioni della cella, un ordine di grandezza più piccolo rispetto alla stampa 3D convenzionale di modellazione a deposizione fusa (FDM), risultando in strutture di scaffold altamente definite ^8,9. MEW si è dimostrato in grado di tradurre un complesso progetto in silico in una matrice stampata e di regolare le proprietà fisiche in 3D per farle corrispondere a quelle del tessuto cardiaco¹⁰. Utilizzando la tecnologia MEW, è possibile stampare reti polimeriche con diverse forme e strutture che, combinate con idrogel morbidi e amiche delle cellule, generano tessuti compositi che imitano l'ambiente micro e macromeccanico del miocardio adulto nativo^11,12. È stato dimostrato che la modifica del design dell'impalcatura 3D MEW altera la funzionalità risultante (transitori di calcio)¹⁰, stabilendo le basi per comprendere la relazione forma-funzione su questo promettente sistema ingegnerizzato in 3D.

Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per la fabbricazione di mini tessuti cardiaci umani contrattili da hiPSC-CM e fibroblasti cardiaci derivati da iPSC umane (hiPSC-CF) e la loro combinazione all'interno di un idrogel di fibrina rinforzato con strutture stampate in 3D MEW. L'aggiunta di fibroblasti è stata ampiamente utilizzata in diversi sistemi ingegnerizzati in 3D per migliorare la sopravvivenza delle hiPSC-CM e mantenere la struttura tissutale, ma il suo uso nei sistemi 3D-MEW non è stato ancora esplorato¹³. La tecnologia qui descritta fornisce una piattaforma versatile per i ricercatori che mirano a sviluppare modelli accurati di tessuto cardiaco con applicazioni quali la comprensione dei meccanismi della malattia, la tossicologia preclinica e lo screening dei farmaci. Questo modello è adatto per valutare la cardiotossicità di farmaci consolidati come le antracicline (ad es. doxorubicina), gli inibitori della tirosin-chinasi e le terapie emergenti come le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR-T), che sono state associate a disfunzione cardiaca¹⁴. Inoltre, il modello ha un potenziale significativo nel far progredire la medicina rigenerativa consentendo la sperimentazione di biomateriali, bioink e terapie cellulari volte a migliorare la funzione cardiaca e ripristinare il tessuto miocardico in condizioni come l'infarto del miocardio.

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Configurazione dei terreni e dei reagenti

1. Pre-rivestimento di piastre per colture cellulari
   1. Prepara le aliquote delle azioni Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). Scongelare una fiala di MGFr per una notte in frigorifero con ghiaccio. In una cappa sterile, utilizzando puntali refrigerati e mantenendo sempre il brodo e i tubi sul ghiaccio, fare aliquote di volume adeguato diluendo il brodo 1:1 in RPMI 1640 L-glutammina fredda (RPMI).
      NOTA: Per la coltura di hiPSC e la semina di cardiomiociti hiPSC (hiPSC-CM), vengono utilizzate diverse diluizioni di MGFr. La diluizione del rivestimento MGFr per le hiPSC varia a seconda della specifica linea cellulare. Tuttavia, una volta raggiunto lo stadio di cardiomiociti, viene utilizzata la diluizione 1:80 indipendentemente dalla linea cellulare.
   2. Per il rivestimento di piastre per colture cellulari, scongelare lentamente il numero richiesto di aliquote di MGFr su ghiaccio e diluirle ulteriormente in RPMI a freddo, 1:180 per la coltura hiPSC (100 μL di MGFr in 9 mL di RPMI) e 1:80 per la riplaccatura hiPSC-CM (100 μL di MGFr in 4 mL di RPMI).
      1. Aggiungere immediatamente l'MGFr diluito a un volume di 1 mL per pozzetto per piastre a 6 pozzetti (mantenimento hiPSC) e 0,5 mL per pozzetto per piastre a 12 pozzetti (riplaccatura hiPSC-CMs). Conservare le piastre a 4 °C prima dell'uso (fino a 1 settimana).
         NOTA: Le piastre rivestite in MGFr devono essere riscaldate a 37 °C per 30 minuti prima della semina delle cellule. Prima di galvanizzare le celle, aspirare il liquido dalla piastra rivestita in MGFr.
   3. Per la coltura di hiPSC-CF, rivestire i matracci T75 o T175 con gelatina allo 0,1% per almeno 15 minuti a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso, a un volume di 5 mL per i matracci T75 o 10 mL per i matracci T175. Dopo l'incubazione, aspirare il liquido prima della semina cellulare.
2. Terreni di coltura cellulare
   1. Per la coltura hiPSC, utilizzare Complete Essential 8 Medium (E8 medium) aggiungendo Essential 8 Supplement (50x) a Essential 8 Basal Medium.
   2. Per la differenziazione dei cardiomiociti, preparare:
      1. RPMI/B27 senza insulina (terreno -INS): miscelare 500 mL di RPMI e 10 mL di B27 senza supplemento di insulina; RPMI/B27 (terreno B27): miscelare 500 ml di RPMI e 10 ml di integratore di B27.
   3. Per la purificazione dei cardiomiociti (terreno lattato), aggiungere 2 mL di lattato 1 M in 500 mL di RPMI 1640 privo di glucosio. Il terreno può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
   4. Per il replating dei cardiomiociti (Replating Medium), integrare il terreno B27 con il 10% di sostituzione del siero knock-out (KSR) e 10 μM di Y27.
      NOTA: KSR è una formulazione definita e priva di siero che sostituisce FBS nei protocolli di coltura ESC e iPSC.
   5. Per la differenziazione e il mantenimento dei fibroblasti (dall'11° giorno in poi), preparare il terreno di coltura completo per fibroblasti 3 (FGM3) come specificato dal produttore. Aggiungere la sua confezione di integratori (0,1 ml/mL di siero fetale di vitello, 5 μg/mL di insulina umana ricombinante e 1 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti basici umani, FGF2) al terreno basale FGM3.
      NOTA: Per promuovere la proliferazione dei fibroblasti, si raccomanda di aumentare la concentrazione di FGF2 a 10 ng/mL.
   6. Per la generazione e il mantenimento del tessuto cardiaco 3D, preparare:
      1. Terreno di generazione tissutale: Integrare il terreno B27 con l'1% di penicillina/streptomicina (P/S), il 10% di KSR e 10 μM di Y27. Terreno di mantenimento tissutale: Preparare il terreno B27 con l'1% di P/S e aprotinina (0,1% (peso/vol); 33 μg/mL).
         NOTA: L'aprotinina consente l'integrità del gel di fibrina durante il tempo in coltura, prevenendone la degradazione e mantenendo le cellule all'interno dell'idrogel. Pertanto, si consiglia vivamente di aggiungerlo al terreno lo stesso giorno in cui viene generato il tessuto.
3. Soluzioni stock per piccole molecole e fattori di crescita
   1. CHIR-99021 (CHIR): per l'inibitore GSK3 e l'attivatore di segnalazione Wnt, preparare una soluzione stock da 10 mM sciogliendola in DMSO. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
      NOTA: Le linee hiPSC possono rispondere al trattamento CHIR in modo diverso. Potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione della concentrazione di CHIR. Si consiglia il test CHIR di 6-10 μM.
   2. C59, inibitore Wnt: Preparare una soluzione madre da 10 mM sciogliendola in DMSO. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
   3. Y-27632, Inibitore ROCK (Y27): Preparare un stock da 10 mM sciogliendolo in DMSO. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 1 mese. La concentrazione finale dipende dal tipo di cellula bersaglio. Utilizzare 2 μM (1/5000) per le hiPSC e 10 μM (1/1000) per le hiPSC-CM, le hiPSC-CF e la generazione di tessuti.
      NOTA: Y27 promuove la sopravvivenza cellulare sopprimendo la morte cellulare in sospensione durante il distacco. Usalo durante la raccolta per evitare un'eccessiva morte cellulare.
   4. Acido retinoico: Preparare una soluzione madre da 30 mM sciogliendola in cloroformio. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 2 anni.
   5. FGF2 (Recombinant Human Fibroblast Growth Factor, anche FGF-b, promuove la proliferazione dei fibroblasti): preparare una soluzione madre da 50 μg/mL sciogliendola in acqua sterile. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
   6. SB431542 (SB), inibitore della segnalazione TGFß1: Preparare una soluzione madre da 10 mM sciogliendola in DMSO. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
      NOTA: Aggiungerlo al terreno fibroblastico per mantenere lo stato di FC e prevenire la transizione dei miofibroblasti (il fenotipo patologico che si verifica durante la fibrosi) in coltura 2D.
4. Soluzioni stock per l'idrogel di fibrina
   1. Fibrinogeno: Preparare una soluzione madre da 200 mg/mL. Per prima cosa, macinare i grumi di fibrinogeno fino a ridurli in polvere fine utilizzando strumenti sterili all'interno di una cappa cellulare. Aggiungere una soluzione calda di NaCl allo 0,9% (in peso/volume) e mantenerla a 37 °C fino a completa dissoluzione. Conservare le aliquote a -80 °C fino ad un anno; a 4 °C per 1 settimana.
      NOTA: A causa della sua viscosità a 4 °C, scongelarlo e mantenerlo a RT qualche tempo prima della fase di generazione del tessuto in modo che possa essere pipettato con precisione. Se un'aliquota non può essere pipettata facilmente quando viene riutilizzata, si consiglia di eliminarla e utilizzarne una nuova.
   2. Trombina: Preparare una soluzione madre da 100 U/mL sciogliendo la trombina in PBS sterile al 60% + acqua al 40%. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di un anno a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
      NOTA: Prima dell'uso, scongelarlo e tenerlo in ghiaccio fino al completamento della fase di generazione del tessuto.
   3. Aprotinina: Preparare una soluzione madre da 33 mg/mL sciogliendo l'aprotinina in acqua sterile (100 mg di polvere in 3,04 mL di acqua). Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di un anno.
5. Soluzioni per l'analisi
   1. Tampone FACS (citometria cellulare): preparare una soluzione di PBS (priva di Mg²⁺ e Ca²⁺) più 2,5 mM di EDTA e FBS al 5% (v/v).

2. Cultura e passaggio delle iPSC umane

NOTA: Le procedure qui riportate sono state eseguite con diverse linee hiPSC, tra cui UCSFi001-A (maschio, gentile dono del Professor Bruce Conklin, David J. Gladstone Institutes), ESi044-A (maschio), ESi007-A (femmina) e ESi044-C (femmina) linee sane e ESi107-A (amiloidosi cardiaca femminile) con piccoli adattamenti relativi al terreno di coltura hiPSC, alla diluizione passante e alla concentrazione di CHIR. Il protocollo contiene i dettagli specifici per l'uso di UCSFi001-A. Tutte le incubazioni di colture cellulari in questo protocollo vengono eseguite a 37 °C, 5% di CO₂ e 96% di umidità.

1. Linea hiPSC di coltura su piastre pre-rivestite a 6 pozzetti 1:180 MGFr. Mantienili sul terreno E8 per garantire la pluripotenza.
   NOTA: Per prevenire la differenziazione spontanea, è fondamentale evitare la crescita eccessiva delle colture. Pertanto, eseguire il passaggio di hiPSC quando le cellule sono confluenti all'80%-90%.
2. Per il passaggio cellulare, aspirare il vecchio terreno, lavare due volte i pozzetti con 1 mL di soluzione di EDTA 0,5 mM diluita in PBS (Mg²⁺- e Ca²⁺--free per pozzetto) e incubare per 7 minuti in EDTA/PBS a RT per interrompere le aderenze intercellulari.
3. Aspirare l'EDTA/PBS e prelevare le cellule, staccandole mediante pipettaggio energico con una micropipetta da 1000 μL con 1 mL di terreno E8 sulla superficie del pozzetto fino a quando le cellule non sono staccate. Raccoglili in una provetta da centrifuga sterile.
   NOTA: Evitare di pipettare più di 10-15 volte, poiché aumenterà la morte per hiPSC.
4. Da questo volume, effettuare diluizioni 1:15-1:20 e seminare le cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite con MGF in terreno E8 + 2 μM di Y27. Mantenere Y27 solo le prime 24 ore dopo la semina per evitare tossicità da sovraesposizione.
   NOTA: Regolare il rapporto di scissione per altre linee di hiPSC per mantenere le cellule indifferenziate e su una morfologia sana per 4-5 giorni.
5. Dopo 24 ore, aspirare il terreno vecchio e aggiungere un terreno fresco a temperatura ambiente E8 sufficiente per due giorni (di solito 3-4 ml). Dopodiché, cambia il mezzo ogni giorno per 3-4 giorni.
   NOTA: La frequenza di passaggio dipende da ciascuna linea cellulare; Evitare di raggiungere il 100% di confluenza. Le hiPSC dovrebbero crescere in colonie grandi, piatte e compatte con geometria poligonale, bordi smussati e un elevato rapporto nucleo/citoplasma.

3. Differenziamento dei cardiomiociti umani

NOTA: Per la generazione di cardiomiociti da hiPSC (hiPSC-CMs), il protocollo descritto si basa sulla metodologia di differenziazione monostrato utilizzata da Lian et ^al.3,15 e Burridge et ^al.4. Con un'adeguata manutenzione, hiPSC può essere differenziato su 30 passaggi consecutivi con un'elevata efficienza di differenziazione. I segni di un comportamento anomalo sono rilevati dalla differenziazione spontanea o dal fallimento consecutivo di più di 4 differenziazioni. Si raccomandano controlli regolari, compreso il test del micoplasma.

1. Per avviare la differenziazione cardiaca, raccogliere le hiPSC all'80%-90% di confluenza come descritto nel passaggio cellulare sopra (passaggio 2). Cellule di semina in piastre a 12 pozzetti rivestite in 1:180 MGFr che regolano le diluizioni divise per ottenere monostrati cellulari compatti al 90% della confluenza dopo 48-72 ore di semina. Per questa linea cellulare, fare diluizioni 1:10 e le cellule raggiungeranno la confluenza a 72 ore. Cambiare il terreno E8 ogni giorno.
   NOTA: in questo protocollo, le diluizioni sono state regolate in base al volume, non al numero di cellule, per evitare la variabilità dipendente dall'utente. Se lo stato di monostrato non viene raggiunto entro 72 ore dalla placcatura, è molto probabile che il processo di differenziazione non abbia successo. In tal caso, si consiglia di scartare il tentativo e riavviare, garantendo un'efficienza di passaggio ottimale.
2. Quando i monostrati vengono stabilizzati, inizia il processo di differenziazione, considerato d'ora in poi come il giorno 0. Quindi, cambiare il terreno in terreno -INS integrato con 8 μM di CHIR, l'attivatore di segnalazione Wnt, e incubare la piastra per 24 ore a 37 °C (1 mL per pozzetto).
   NOTA: Concentrazione di CHIR di titolato tra 6-12 μM per ciascuna linea iPSC per un'induzione efficiente del mesoderma. In questa fase, ci si aspetta un alto livello di morte cellulare, segno di un processo ottimale.
3. Giorno 1: Il giorno successivo, aspirare il terreno da ciascun pozzetto e lavare le cellule con RPMI senza integratori (0,5 ml per pozzetto). Quindi, aggiungere 1,5 mL di terreno -INS fresco e incubare le cellule per 2 giorni.
   NOTA: Le fasi di lavaggio vengono eseguite durante tutti i cambi di terreno per rimuovere detriti, cellule morte e residui di integratori.
4. Giorno 3: Per indurre la specifica del lignaggio cardiaco, sostituire il terreno con 1,5 mL di terreno -INS integrato con 5 μM di inibitore Wnt C59 per 48 ore.
   NOTA: Qui si forma il complesso GSK3 e la ß-catenina viene degradata, portando alla linea mesodermica cardiaca. Dopo questo passaggio è osservabile anche una certa morte cellulare.
5. Giorno 5: Lavare e sostituire con terreno fresco -INS per 48 ore a un volume di 1,5 mL per pozzetto, per favorire l'espansione dei progenitori cardiaci.
6. Giorno 7: Da questo giorno in poi, le cellule vengono mantenute nel terreno B27, con cambio del terreno ogni 2-3 giorni.
   NOTA: Regolare la quantità di terreno a 2,5 ml per pozzetto per evitare di cambiare il terreno durante il fine settimana, ma solo una volta raggiunto questo stato. Normalmente, le hiPSC-CM iniziano a battere spontaneamente nei giorni 7-9. In primo luogo, la contrazione sarà osservata come grappoli isolati e non coordinati, ma in pochi giorni, le colture ad alta purezza dovrebbero formare un monostrato battente uniforme.
7. Una volta ottenuti, questi monostrati contrattili (solitamente al giorno 10) vengono sottoposti a un processo di selezione metabolica costituito da 2 cicli di 72 h in terreno di lattato separati da una fase di replating per eliminare le cellule non cardiomiocitarie e arricchire la purezza della coltura.
8. Giorno 10, prima fase di purificazione (1^{° lattato} ): lavare le cellule di battitura con terreno di lattato (0,5 ml per pozzetto) e incubarle con 1 ml per pozzetto di terreno di lattato per 72 ore.
   NOTA: La fase di lavaggio deve essere eseguita con terreno lattato o RPMI 1640 senza glucosio basale per rimuovere completamente tutte le tracce del precedente mezzo glucosio (B27).
9. Giorno 13: Lavare e lasciare che le cellule si riprendano dal primo ciclo di purificazione con 1,5 mL per pozzetto di terreno B27 per 2 giorni.
10. Giorno 15 (fase di riplaccatura): tra i due cicli di purificazione, dissociare i monostrati mediante lavaggio con EDTA/PBS e incubazione con TrypLE per 10 minuti a 37 °C (0,5 mL per pozzetto).
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende da ciascuna linea cellulare.
11. Staccare le cellule utilizzando una micropipetta da 1000 μL e recuperarle con 0,5 mL per pozzetto di terreno B27 integrato con il 10% di KSR (v/v) in una provetta da centrifuga sterile.
    NOTA: I cardiomiociti sono sensibili allo stress da taglio e al forte pipettaggio, quindi cerca di evitare passaggi di pipettaggio ripetuti. Altre opzioni per una dissociazione hiPSC-CM a danno inferiore potrebbero essere l'uso di TrypLE 10x o collagenasi con DNasi. Ottimizzare il tempo di incubazione per garantire che sia sufficiente per il distacco delle cellule senza causare danni cellulari o richiedere un pipettaggio eccessivo, che potrebbe compromettere l'integrità delle cellule.
12. Centrifugare 10 min a 100 x g a RT e riplaccarli in piastre a 12 pozzetti rivestite in MGFr 1:80 con terreno di riplaccatura. Seminali in 1 ml per pozzetto.
    NOTA: Questo rimuoverà le cellule morte in eccesso e la matrice depositate durante la differenziazione, poiché queste possono successivamente avere un impatto negativo sulla generazione dei tessuti.
13. Giorno 16: Dopo 24 ore di riplaccatura, rimuovere Y27 e KSR e mantenere le cellule nel terreno B27 prima della successiva fase di purificazione (di solito 48-72 ore).
14. Giorno 18: Seconda fase di purificazione (2^° lattato). Come nel primo ciclo, lavare e incubare le cellule con terreno di lattato per 72 ore (1 mL per pozzetto).
    NOTA: I cicli di purificazione possono aumentare la purezza della coltura fino al 30%, come osservato dall'analisi con citometria a flusso del marcatore cardiomiocitario cTNT (troponina T cardiaca) (non mostrato). Questo processo riduce principalmente la contaminazione da fibroblasti e da hiPSC rimanente. Sebbene non sia stato determinato il livello di purezza minimo accettabile richiesto per procedere con la generazione di tessuto senza compromettere la resa, si raccomanda di utilizzare colture con una purezza di almeno l'85%-90%. Questo livello di purezza favorisce un migliore attaccamento dei cardiomiociti, migliora la forza contrattile del tessuto finale e supporta la riproducibilità tra gli esperimenti.
15. Giorno 21: Quando la purificazione del lattato è completata, mantenere i cardiomiociti purificati nel terreno B27 fino al loro utilizzo, con frequenti cambi di terreno (ogni 2-3 giorni).
    NOTA: Un ritardo nell'utilizzo ridurrà la resa delle celle in quanto saranno più difficili da staccare. Pertanto, si consiglia di utilizzarli tra il giorno in cui è terminata la seconda purificazione del lattato e meno di una settimana in più.

4. Differenziamento dei fibroblasti cardiaci umani

NOTA: Per ottenere fibroblasti cardiaci umani (hiPSC-CF) da hiPSC, il seguente protocollo si basa sulla metodologia a due fasi utilizzata da Zhang et ^al.16. Il primo passo consiste nell'ottenere cellule epicardiche (hiPSC-EpiC) riattivando la via di segnalazione Wnt dopo l'induzione del mesoderma cardiogeno. Quindi, le hiPSC-EpiC sono esposte agli inibitori dello sviluppo vascolare e all'FGF2 per ottenere fibroblasti cardiaci in 18 giorni.

1. Garantire la manutenzione, la raccolta e la densità di semina dell'hiPSC come descritto nel protocollo di differenziazione hiPSC-CMs. Coltura di hiPSC su piastre a 12 pozzetti rivestite in MGFr 1:180 per avviare la differenziazione.
2. Quando si ottengono monostrati compatti di hiPSC (Giorno 0), aggiungere il terreno -INS integrato con 5 μM di CHIR (1,5 mL per pozzetto) per 48 ore.
   NOTA: Concentrazione di CHIR titolato per ciascuna linea hiPSC per un'induzione efficiente del mesoderma.
3. Giorno 2: Aspirare e scartare il terreno, lavare le cellule con RPMI e sostituirlo con 1,5 ml di terreno -INS fresco per 24 ore.
   NOTA: Come nel protocollo hiPSC-CMs, sciacquare le celle durante qualsiasi cambio di fluido; A seconda di ogni fase, utilizzare il terreno basale non integrato corrispondente.
4. Giorno 3: Incubare le cellule con terreno -INS contenente 5 μM di C59 (inibitore di Wnt) per 48 ore (1,5 mL per pozzetto).
5. Giorno 5: Per il replating delle cellule mesodermiche cardiache, staccare le cellule lavandole con EDTA/PBS e incubandole con TrypLE per 5 minuti a 37 °C (0,5 mL per pozzetto). Raccogliere le cellule in 0,5 mL per pozzetto di terreno basale Advance DMEM (ADMEM) e centrifugare per 5 minuti a 300 x g a RT.
6. Seminarli in piastre pre-rivestite 1:180 MGFr a 12 pozzetti (1 mL per pozzetto) a una densità di 20.000 cellule/cm². Per la riplaccatura, utilizzare ADMEM integrato con 5 μM di CHIR, 2 μM di acido retinoico, 10% KSR (v/v) e 10 μM di Y27.
7. Giorno 6: A 24 ore dopo la riplaccatura, rinfrescare il terreno per rimuovere Y27 e diminuire il KSR al 2%. Mantenere le stesse concentrazioni di CHIR e acido retinoico per altre 48 ore per ottenere lo sviluppo di un fenotipo epicardico.
8. Giorno 8: Cellule di coltura con ADMEM integrate più il 2% di KSR per 72 ore per promuovere la generazione di monostrati epicardici.
   NOTA: le hiPSC-EpiC sembrano essere grandi cellule piatte o di forma cubica raggruppate in singole colonie. A questo punto, durante l'esecuzione dei primi cicli di differenziazione, i marcatori tipici delle cellule epicardiche come WT1 (antigene nucleare), ZO1 (antigene di membrana citoplasmatica) e TCF21 (antigene citoplasmatico) potrebbero essere analizzati mediante FACS (citometria con cella a flusso) o IF (colorazione in immunofluorescenza) (non mostrato).
9. Giorno 11: Per la riplaccatura delle cellule epicardiche, dissociare il lavaggio con hiPSC-EpiCs con EDTA/PBS e incubare con TrypLE per 5 minuti a 37 °C (0,5 mL per pozzetto). Raccogliere le cellule in terreno FGM3 (0,5 mL per pozzetto) e centrifugare per 5 minuti a 300 x g a RT.
10. Riplaccare le hiPSC-EpiC in piastre a 12 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1% con una densità cellulare di 10.000 cellule/cm². Utilizzare il terreno FGM3 integrato con 10 μM di SB (un inibitore della trasduzione del segnale TGFß1 per evitare la transizione dei miofibroblasti, di solito durante la coltura su plastica) e 10 μM di Y27 (solo per le prime 24 ore).
11. Il giorno seguente, rinfrescare il terreno fibroblastico (FGM3 + 10 μM di SB) ogni 2 giorni fino a ottenere le hiPSC-CF, per un totale di circa 18 giorni per l'intero processo.
    NOTA: le hiPSC-CF dovrebbero presentare una morfologia a forma di fuso. Qui, l'espressione del marcatore di fibroblasti DDR2 dovrebbe essere analizzata mediante tecniche FACS e IF (vedi passaggi 7.1-7.2).
12. Una volta che la coltura di hiPSC-CFs è confluente, eseguire passaggi cellulari 1:3 in fiasche T75 o T175 pre-rivestite di gelatina. Le cellule raggiungono il 90% di confluenza in circa 4-6 giorni. Per staccare le hiPSC-CF, utilizzare il protocollo di raccolta TrypLE descritto per il replating di hiPSC-EpiCs; qui, Y27 non è richiesto per il passaggio.
13. Mantenere le hiPSC-CF nel terreno FGM3 + 10 μM di SB fino al loro utilizzo o congelarle a basso passaggio con una densità cellulare di 1-3 milioni di cellule per criotubo.
    NOTA: Si raccomanda di mantenere le hiPSC-CF per un massimo di 6 passaggi prima di scongelare nuove cellule, poiché quando vengono coltivate in fiasche di plastica a lungo termine, le cellule iniziano a differenziarsi in un fenotipo di miofibroblasto più contrattile.

5. Fabbricazione di scaffold di scrittura per elettrofilatura (MEW) a fusione

NOTA: Questo protocollo utilizza l'omopolimero di polietilene ε-caprolattone (PCL) di grado medico per stampare scaffold fibrillari, utilizzando una stampante MEW appositamente progettata per questo scopo da QUT, Queensland University of Technology¹⁰.

1. Preparare un polimero PCL per la stampa. Caricare i granuli di PCL in una siringa Luer-lock di plastica da 3 mL collegata a un ago da 23 G e fonderli a 80 °C per 2 ore in forno, premendo delicatamente il pistone per rimuovere eventuali bolle mentre il polimero è fuso. Preparare diverse siringhe e conservarle in RT, poiché il PCL si solidifica rapidamente.
2. Il giorno della stampa, introdurre la siringa all'interno della camera di riscaldamento e collegarla a un tubo di alimentazione N₂ pressurizzato. Accendere l'apparecchiatura MEW, impostare i regolatori di temperatura a 80/65 °C (camera/ugello) e tenere la siringa per 30 minuti per garantire la corretta fusione del polimero.
3. Sotto la siringa, c'è la piastra di raccolta, motorizzata e mobile nelle direzioni XY da software compatibile (Mach3). Spostare la piastra di raccolta (controllo dei cursori del computer) fino a posizionare la testina di stampa su un bordo della piastra o in qualsiasi posizione desiderata e regolare manualmente la distanza tra la camera di riscaldamento e la piastra di raccolta (distanza del collettore) a 10 mm (piano Z).
   NOTA: Questa distanza deve essere testata sperimentalmente per raggiungere un determinato diametro della fibra. Minore è la distanza del collettore, più spessa è la fibra e viceversa.
4. Chiudere lo sportello dell'apparecchiatura, che collega automaticamente l'alimentazione del campo elettrico. Impostare la tensione a 7 kV e la pressione N₂ a 2 bar in modo che possa estrudere attraverso la punta da 23 G durante la stampa.
   NOTA: Fornendo un'alta tensione, si crea una differenza di potenziale tra la punta della siringa e la piastra di raccolta (in acciaio inossidabile). Quindi, la goccia accumulata all'ugello dalla pressione fornita si carica elettrostaticamente, generando il cono di Taylor, che si dirige verso la piastra del collettore. La tensione e la pressione possono essere regolate per modificare le dimensioni finali delle fibre. I parametri ad alta pressione estrudono fibre più spesse, richiedendo una maggiore tensione per stabilizzare la fibra. Il software è basato sul controllo numerico computerizzato (CNC), quindi le geometrie dell'impalcatura vengono scritte come codice G e inviate al programma, che controlla il movimento X-Y e la velocità del motore della piastra del collettore. Pertanto, prima di stampare gli scaffold definitivi, si consiglia di stampare qualsiasi codice G come passaggio precedente per ottenere un getto stabile che costruisca fibre definite senza alcun aspetto di avvolgimento o frustatura. Per questo, ottimizzare i parametri con piccole modifiche ogni volta, ad esempio 0,1 bar per la pressione dell'aria, 0,1 kV per la tensione e 60-100 mm/min per la velocità del collettore; questo garantirà un comportamento del cono di Taylor del getto.
5. Seleziona il codice G progettato nel software per stampare impalcature con una geometria quadrata. Questo esempio di codice G stampa maglie quadrate a 15 strati di 6 cm x 6 cm con pori di forma quadrata di 0,5 mm x 0,5 mm.
6. Per stampare fibre depositate con precisione (cioè fibre sovrapposte), regolare la velocità del collettore a 1080 mm/min.
   NOTA: Regolare i parametri di tensione, pressione, velocità del collettore e distanza del collettore su ciascuna apparecchiatura MEW per definire diametri precisi delle fibre (μm). Al di là dell'influenza dei parametri precedentemente menzionati, l'aumento della velocità del collettore si traduce in fibre più sottili, mentre diminuendola si producono fibre più spesse. Le impostazioni dei parametri in questo protocollo consentono la stampa di fibre con diametri di 10-15 micron.
7. Premere il pulsante START nel software per avviare la stampa. Rimuovere con cautela l'impalcatura dal raccoglitore al termine della stampa.
   NOTA: Per facilitare la manipolazione del ponteggio dopo la stampa, si consiglia di stamparlo su un pezzo di vetro più grande del ponteggio, fissato alla base del collettore con nastro adesivo.
8. Tagliare la rete stampata con un punzone di 6 mm di diametro per ottenere gli scaffold finali per la fabbricazione dei tessuti.
9. Poiché le reti PCL sono altamente idrofobiche, trattarle per 5 minuti con plasma O₂/Argon per aumentarne l'idrofilia e promuovere l'interazione con la fibrina e le cellule.
   NOTA: Opzionalmente, funziona anche un trattamento con NaOH 0,1 N per 15 minuti, seguito da ampi lavaggi PBS.
10. Sterilizzare le maglie immergendole in etanolo al 70% per 30 minuti, lavare abbondantemente con acqua distillata sterile per 30 minuti e lasciare asciugare.
    NOTA: Eseguire questo processo in una capsula di Petri sterile e all'interno di una cappa sterile. Non asciugare completamente le reti fino al momento dell'utilizzo per evitare la loro adesione alla piastra e la conseguente deformazione.

6. Generazione e mantenimento del mini tessuto di fibrina

NOTA: La generazione di mini tessuti miocardici 3D umani si basa sull'incapsulamento di cellule cardiache derivate da hiPSC all'interno di idrogel di fibrina combinati con scaffold MEW che forniscono supporto fibrillare. Il seguente protocollo è stato adattato dagli approcci di progettazione ingegneristica utilizzati da Breckwoldt et ^al.17 e Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. Staccare le hiPSC-CM come descritto sopra nella fase di replating (3.10-3.11) del protocollo di differenziazione hiPSC-CM (TrypLE harvesting). Risospendere il pellet cellulare nel terreno di generazione tissutale per contare le cellule nella camera di Neubauer.
2. Staccare le hiPSC-CF come nella fase di raccolta delle hiPSC-CM con TrypLE. Utilizzare 3 mL di TrypLE per i matracci T75, 5 mL per i matracci T175 e lo stesso volume per l'incubazione inattivata del TrypLE. Infine risospendere il pellet cellulare nel terreno di generazione tissutale, come per i CM, poiché verranno miscelati e coltivati nello stesso terreno.
3. Contare le cellule in una camera di Neubauer. Calcola l'esatto numero totale di cellule necessarie per seminare tutti i tessuti.
   NOTA: Questo protocollo impiega 1 milione di cellule per tessuto, composto per l'80% da CM e per il 20% da CF, ovvero 800.000 CM e 200.000 CF. Altre quantità, come i totali di 1,5 e 3 milioni per fazzoletto, sono raggiungibili con la pratica.
4. Mescolare e pellettare le cellule totali necessarie in una nuova provetta (Cell Mix), 5 minuti a 300 x g a RT. Assicurarsi che il pellet sia completamente asciutto e tenerlo in ghiaccio fino alla semina. Calcolare il volume totale di idrogel necessario per la semina di tutti i tessuti.
   NOTA: Questo protocollo richiede 35 μL per tessuto (per una dimensione dello scaffold di 6 mm di diametro) per una densità finale vicina a 30 milioni di cellule/mL, ma può essere aumentata, come già menzionato nel passaggio 6.4 sopra. Ogni idrogel di fibrina è costituito da 6 mg/mL di fibrinogeno più 5 U/mL di trombina insieme al terreno di generazione tissutale, in cui le cellule vengono risospese. Per un idrogel da 35 μL, il rapporto fibrinogeno/trombina è di 1,05 μL/1,8 μL. Si raccomanda un volume finale di idrogel del 10% in più per evitare perdite di volume dovute a errori di pipettaggio. Esempio: per 10 tessuti, risospendere le cellule in 350 μL + 10%, cioè 385 μL come volume finale totale.
5. Risospendere la miscela cellulare nel volume richiesto di terreno di generazione tissutale. Mescolate con cura, evitando la formazione di bolle.
   NOTA: Per 10 tessuti, risospendere 10 milioni di cellule (80 CM:20 CF) in 374,5 μL di terreno di generazione tissutale (volume totale di idrogel meno la quantità totale di fibrinogeno necessaria per i tessuti totali, ovvero 10,5 μL).
6. Aggiungere il volume necessario di fibrinogeno e mescolare accuratamente. Per 10 tessuti, aggiungere 10,5 μL di fibrinogeno al Cell Mix, generando il Hydrogel Mix. Tienilo su RT.
   NOTA: È essenziale evitare il pipettaggio eccessivamente ripetuto in modo che le forze di taglio non influiscano sulla vitalità di hiPSC-CM. Si consiglia di tagliare un pezzo dalla punta della punta della pipetta con un bisturi sterile e quindi risospendere la miscela di idrogel con essa per ridurre i danni da taglio.
7. Per evitare l'adesione della fibrina alla piastra, seminare la miscela di idrogel su una superficie di politetrafluoroetilene (PTFE). Pipettare metà del volume di un tessuto (17,5 μL), che rimarrà come goccia, e farlo per il numero totale di tessuti.
   NOTA: Non fare più di 10 fazzoletti alla volta, poiché possono seccarsi.
8. Posizionare un'impalcatura PCL sopra ogni goccia e aggiungere il volume rimanente (17,5 μl). Assicurarsi che l'impalcatura sia completamente immersa.
   NOTA: Prepararsi al pipettaggio con entrambe le mani, poiché la reazione è molto rapida. Un fazzoletto alla volta.
9. Aggiungere la quantità necessaria di trombina (1,8 μL) con la mano non dominante e mescolare rapidamente l'idrogel con la mano dominante (pipettando almeno 2-3 volte).
   NOTA: Miscelare preferibilmente pipettando meno del volume totale, per evitare la formazione di bolle (30 μl). Se si forma una bolla d'aria, pungerla rapidamente con un ago.
10. Ripetere il passaggio precedente per ogni fazzoletto.
    NOTA: Si consiglia di praticare questa tecnica senza celle fino a quando non si garantisce una buona manipolazione.
11. Incubare i tessuti a 37 °C per 1 ora per completare la polimerizzazione della fibrina.
12. Prelevare delicatamente ciascun tessuto dal bordo con una pinzetta sterile e posizionarlo in piastre a 12 pozzetti con 2 ml per pozzetto del terreno di generazione tissutale integrato con 33 μg/mL di aprotinina. Posizionare un fazzoletto per pozzetto.
    NOTA: Non raccoglierli per il centro dell'idrogel in modo che le cellule possano essere danneggiate dalla forza meccanica. Se necessario, utilizzare una spatola.
13. Incubare i tessuti per 24 ore a 37 °C.
    NOTA: È fondamentale mantenere l'aprotinina nel terreno di coltura tissutale dal giorno della generazione in poi, poiché è stato osservato che l'omissione dell'aprotinina durante le prime 24 ore, anche se aggiunta successivamente, porta al parziale distacco delle cellule dalla rete e dall'idrogel. Ciò compromette la copertura cellulare completa necessaria per l'integrità del tessuto finale.
14. Il giorno successivo, rinfrescare il terreno con 2 ml di terreno di mantenimento tissutale, rimuovendo i residui di KSR e Y27. Da quel momento in poi, cambia il mezzo a giorni alterni.

7. Analisi sistematica del potenziale di differenziazione cardiaca della funzione hiPSC e dei mini tessuti

1. Analisi di citometria a flusso
   NOTA: Le cellule vengono analizzate utilizzando la modalità di citometria "Fluorescence-activated Cell Sorting" (FACS) per determinare l'efficienza della differenziazione di hiPSC. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.
   1. Dissociare le colture cellulari in sospensione a singola cellula (TrypLE harvesting), sia hiPSC-CM che CF separatamente.
   2. Risospendere il pellet a 250.000 cellule/mL in tampone FACS ed erogare almeno 1 mL per provetta. Incubare per 30 minuti per evitare il legame di anticorpi non specifici.
   3. Centrifugare le celle a 300 x g a RT per 5 minuti e scartare il surnatante.
      NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite in queste condizioni.
   4. Per rilevare gli antigeni intracellulari, fissare e permeabilizzare le membrane cellulari con un kit di permeabilizzazione cellulare. Per prima cosa, incubare le cellule con Reactive A (Fix) per 30 minuti e centrifugare (come al punto 7.1.3).
   5. Quindi, incubare le cellule con Reactive B (Perm) più l'anticorpo primario per 30 minuti. Utilizzare 100 μl di reattivo per provetta.
      1. Per le hiPSC-CM, utilizzare l'anticorpo cTNT di topo (troponina T cardiaca, marcatore di CM) a 1/200 di diluizione. Per le hiPSC-CF, utilizzare l'anticorpo DDR2 di topo (recettore del collagene, marcatore della FC) a 1/500 di diluizione.
         NOTA: Per interrompere tutte le reazioni, aggiungere 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta prima della centrifugazione.
   6. Incubare per 15 minuti con l'anticorpo secondario anti-topo Alexa-Fluor 488 diluito 1/100 in tampone FACS.
   7. Lavare 3 volte con PBS, centrifugando tra un lavaggio e l'altro (seguendo le stesse condizioni del passaggio 7.1.3), e infine risospendere il pellet di cella in 400 μL di PBS. Analizzare in un citometro o in un dispositivo simile.
2. Analisi di colorazione in immunofluorescenza (IF)
   1. Per le colture cellulari cardiache 2D, seminare entrambi i tipi di cellule separatamente su un sistema di pozzetti a camera di coltura pre-rivestita di MGFr 1:80 o allo 0,1% di gelatina. Piastra a circa 80.000 cellule/cm² per raggiungere una confluenza cellulare sufficiente per l'analisi. Per i mini fazzoletti 3D, trasferiscili delicatamente con una pinzetta in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
   2. Scartare il terreno cellulare e lavare due volte le cellule o i fazzoletti con PBS. Fissare i campioni con formalina al 10% (v/v) a RT; 15 minuti per la camera dei vetrini e 1 ora per i mini fazzoletti.
      ATTENZIONE: La formalina è pericolosa se inalata e deve essere maneggiata in una cappa aspirante.
   3. Eliminare il tampone di fissaggio e lavare tre volte per 5 minuti con PBS. Conservare i campioni a 4 °C in PBS fino al loro utilizzo.
   4. Per permeabilizzare la membrana cellulare, incubare le cellule con Triton X-100 (v/v) allo 0,1% per 10 minuti o tessuti 3D con Tween-20 all'1% per 15 minuti a RT. Quindi, lavare tre volte con PBS.
   5. Per ridurre i legami anticorpali non specifici, trattare i campioni con una soluzione di albumina sierica bovina (BSA) al 3% (v/v) per 30 minuti a RT.
   6. Preparare soluzioni di anticorpi primari in PBS più 1% BSA per bloccare i legami aspecifici e incubarle per una notte a 4 °C.
      1. Per le hiPSC-CM 2D, utilizzare una diluizione di 1/400 di anticorpo di topo anti-cardiaco α-ACTN (actinina sarcomerica). Per le hiPSC-CF 2D, utilizzare una diluizione 1/500 di anticorpo di topo Anti-DDR2. Per i tessuti 3D, combinare i due anticorpi specifici per CM e CF.
   7. Il giorno successivo, aspirare la soluzione anticorpale ed eseguire 3 lavaggi con PBS a RT, 5 minuti ciascuno.
   8. Diluire gli anticorpi secondari (Alexa-Fluor 488 e Alexa-Fluor 594) a 1/200 e incubare per 1 ora a RT al buio per identificare rispettivamente gli anticorpi primari di topo e coniglio. Ripetere il lavaggio PBS tre volte.
   9. Per controcolorare i nuclei, incubare i campioni con una diluizione 1/500 di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 20 minuti a RT al buio. Ripetere il lavaggio PBS tre volte e conservare i campioni a 4 °C in PBS.
   10. Esaminare i campioni con un microscopio confocale, acquisire immagini ed elaborarle con un software adatto come Fiji.
   11. Per i mini fazzoletti 3D, trasferirli con cura con PBS tra due vetrini coprioggetti per consentire un buon imaging.
       NOTA: Si consiglia un obiettivo a immersione in olio 40x o superiore per ottenere immagini Z-stack ad alta risoluzione.
3. Analisi della vitalità cellulare
   NOTA: Il saggio Alamar Blue (AB) viene utilizzato per misurare l'attività metabolica cellulare, che è direttamente correlata alla vitalità cellulare nei mini tessuti cardiaci 3D. Eseguire l'intero processo proteggendo i campioni dalla luce e in condizioni sterili.
   1. Preparare una soluzione AB al 10% (v/v) in terreno RPMI 1640 senza rosso fenolo (in quanto potrebbe interferire con la misurazione colorimetrica).
   2. Trasferire con cura i mini tessuti cardiaci su una piastra a 48 pozzetti con pinzette sterili. Incubare i costrutti con 300 μL di soluzione AB per tessuto per 1 ora e 30 minuti (regolare il tempo sperimentalmente) a 37 °C.
      NOTA: Poiché le cellule riducono la resazurina attraverso l'azione degli enzimi metabolici, si genererà un cambiamento di colore nel terreno di coltura, che sarà misurato mediante spettrofotometria a 570 nm e 600 nm.
   3. Per la misurazione, raccogliere 100 μl per tessuto della soluzione AB metabolizzata in una piastra a 96 pozzetti e leggere le assorbanze.
      NOTA: I campioni possono essere coltivati dopo questa analisi cambiando nuovamente il terreno in terreno di mantenimento tissutale.
4. Analisi della contrazione
   NOTA: I mini tessuti cardiaci iniziano a battere spontaneamente, di solito 1-2 giorni dopo la generazione del tessuto.
   1. Misurare manualmente la frequenza di battimento osservando i tessuti al microscopio ottico (battiti/min). Se vengono misurati più tessuti contemporaneamente, mantenere le piastre calde prima di ogni lettura.
      NOTA: Quando la temperatura diminuisce, anche la velocità di battitura inizia a diminuire.
   2. Per una valutazione estesa della contrattilità cardiaca, ottenere video di microscopia ottica dei tessuti battenti. A 4x per catturare un piano più grande o a 10x da diverse aree di tessuto. Registra circa 30 secondi per video (almeno 3 battute).
   3. Usa una frequenza fotogrammi di almeno 30 fotogrammi/s e salva il video in formato .AVI.
      NOTA: Qui, i video sono stati analizzati con un algoritmo di tracciamento dei punti sviluppato su misura per MATLAB¹⁰. Con questo metodo, per ogni video è possibile ottenere la velocità di contrazione, lo spostamento massimo di contrazione (ampiezza) e la direzione di contrazione.
   4. Esegui direttamente l'algoritmo in MATLAB per i video contenuti nella cartella di analisi. Fornirà automaticamente un documento Excel dei risultati con i valori della velocità di contrazione per fotogramma, dell'ampiezza di contrazione per fotogramma, dell'angolo di contrazione (direzione) e delle rispettive deviazioni standard¹⁰.
   5. Moltiplica la "Velocità di contrazione per fotogramma" per la risoluzione della fotocamera (μm/pixel) e per la frequenza dei fotogrammi della fotocamera (fotogrammi/s). Questo darà il valore finale della velocità di contrazione (μm/s).
   6. Moltiplica l'"Ampiezza di contrazione per fotogramma" per la risoluzione della fotocamera (μm/pixel) e questo darà il valore finale dell'ampiezza di contrazione (μm).
      NOTA: Sarebbe possibile analizzare la cinetica di contrazione in modo più approfondito utilizzando software come MUSCLEMOTION, come discusso altrove^19,20. La configurazione di imaging deve acquisire almeno 60 fotogrammi/s per l'analisi con il software.

Caratterizzazione di cellule cardiache derivate da hiPSC 2D
Al fine di generare tessuti cardiaci multifenotipici, le hiPSC-CM e le hiPSC-CF sono differenziate in modo indipendente e caratterizzate in vitro. Con un'appropriata ottimizzazione e una manutenzione rigorosa, il seguente protocollo si tradurrà in una resa di hiPSC-CM di oltre l'80% intorno al giorno 9 di differenziazione, dando origine a cellule che battono spontaneamente (Figura 1A). Inoltre, l'arricchimento di purezza mediante selezione metabolica elimina in gran parte le non-hiPSC-CM, risultando in colture composte da oltre il 90% di cellule che esprimono la proteina della troponina cardiaca (cTNT⁺) al giorno 21 (Figura 1B). Questi robusti monostrati di battitura mostrano l'espressione della proteina acticina sarcomerica contrattile (ACTN) mediante colorazione IF (Figura 1C, D).

D'altra parte, il successo di questo protocollo si basa sulla generazione di fibroblasti cardiaci specifici attraverso un'induzione intermedia dello stato epicardico. Qui, dopo la riattivazione del segnale Wnt da parte di CHIR, le cellule epicardiche vengono ottenute al giorno 8 dai progenitori del mesoderma cardiaco (Figura 2A). Queste hiPSC-EpiC sono grandi cellule raggruppate in singole colonie che, quando si ricolorano con il mezzo dei fibroblasti, danno origine a cellule di fibroblasti cardiaci con morfologia a forma di fuso (Figura 2C). Pertanto, dopo 18 giorni totali di differenziazione, le hiPSC-CF presentano oltre il 90% di espressione di DDR2 mediante analisi FACS (Figura 2B). Questo recettore del collagene, caratterizzato come marcatore FC, è osservabile anche mediante colorazione IF (Figura 2D).

Figura 1: Sequenza temporale del differenziamento delle hiPSC-CM e caratterizzazione dell'immunofluorescenza e della citometria a flusso. (A) Lo schema generale del differenziamento delle CM derivate dalle hiPSC e le fasi di purificazione. (B) Quantificazione in citometria a flusso della purezza di hiPSC-CM (percentuale di cellule cTNT⁺ ) al giorno 21. (C) Immagine rappresentativa a contrasto di fase delle cellule dopo le fasi di purificazione (giorno 21). Barra della scala = 100 μm. (D) Immagine confocale di hiPSC-CM completamente differenziate colorate con ACTN (verde) e nuclei colorati con DAPI (blu). Barra della scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sequenza temporale del differenziamento delle hiPSC-CF e caratterizzazione dell'immunofluorescenza e della citometria a flusso. (A) Lo schema generale del differenziamento delle FC derivate da cellule hiPSC-epicardiche. (B) Quantificazione in citometria a flusso della purezza delle hiPSC-CF (percentuale di cellule DDR2⁺ ) al giorno 18 e immagine rappresentativa a contrasto di fase della coltura (C); barra della scala = 100 μm. (D) Immagine confocale di hiPSC-CF colorati con DDR2 (verde) e nuclei colorati con DAPI (blu). Barra della scala = 25 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Generazione di scaffold PCL da parte di MEW
Le proprietà meccaniche degli scaffold sono determinate dal numero totale di strati, dalla densità delle fibre, dal diametro, dalla distribuzione e dalla geometria dei pori. Si tratta di aspetti fondamentali che possono influenzare fortemente il comportamento cellulare. Una volta stabilita, configurata l'apparecchiatura (Figura 3A) e seguendo le impostazioni di stampa descritte in questo protocollo (7 kV, distanza del collettore di 10 mm, 2 bar, testa/ugello 80/65 °C, velocità del collettore di 1080 mm/s e punta della siringa da 23 G), sono stati generati scaffold quadrati a 15 strati con geometria dei pori quadrati di 500 μm x 500 μm (Figura 3B). Le fibre PCL sono state depositate correttamente strato per strato, presentando un diametro della fibra di circa 15 μm.

Figura 3: Fabbricazione di apparecchiature MEW e scaffold fibrillari. (A) configurazione MEW (i) e software Mach3 (ii); vista della testina di stampa e della piastra di raccolta (iii) e formazione del cono di Taylor durante la stampa (iv). (B) Immagini a contrasto di fase degli scaffold quadrati fibrillari (i) e amplificazione della precisa deposizione delle fibre (ii). Barra di scala = 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Caratterizzazione della funzionalità dei mini tessuti cardiaci 3D
Dopo la dissociazione di singole cellule, la miscela cellulare composta da 8:2 hiPSC-CMs:hiPSC-CFs è stata seminata all'interno di idrogel di fibrina sugli scaffold MEW PCL (Figura 4A). Dopo 1 ora di incubazione a 37 °C, la fibrina si forma stabilmente, con cellule distribuite uniformemente in tutto il gel, coprendo tutti i pori della rete (Figura 4B). Questo è importante poiché le hiPSC-CM sono per lo più non mitotiche e non è possibile fare affidamento sulla crescita cellulare per riempire i pori come con altri tipi di cellule. Le cellule hanno evidenziato un rapido rimodellamento della matrice circostante mediante allungamento cellulare, con un battito spontaneo localizzato già 2 giorni dopo la placcatura. L'analisi della colorazione IF ha mostrato una distribuzione cellulare mista delle cellule in tutto il gel, interagendo con la rete PCL, con la maggior parte dei CM (ACTN⁺ VIM^-) intervallati con VIM⁺ ACTN^- hiPSC-CF. Le hiPSC-CM mostrano una struttura sarcomera ben organizzata, caratterizzata da una colorazione della proteina ACTN regolarmente distanziata (Figura 4C). I tessuti cardiaci di 1 milione di cellule hanno mostrato una contrazione stabilizzata in tutta la rete, con una frequenza di battito di circa 30 bpm al giorno 7 (28,93 ± 11,2, media ± DS). Questa capacità funzionale è stata mantenuta per tutti i giorni in coltura, con un piccolo calo fino al giorno 14 (17,18 ± 12,6, media ± DS) (Figura 4D). Nell'analisi dell'attività metabolica, i tessuti hanno dimostrato di mantenere la vitalità cellulare durante la coltura, senza cambiamenti significativi, qui analizzati come giorno 7 vs. giorno 14 (Figura 4E). Infine, l'analisi dei track point dei tessuti a 1 settimana ha mostrato una velocità di contrazione di 38,53 μm/s ± 19,8 (media ± SD, n=16) e un'ampiezza di contrazione di 28,91 μm ± 15 (media ± SD, n=16) (Figura 4F).

Figura 4: Generazione di mini tessuti cardiaci umani 3D e caratterizzazione della struttura, della funzionalità e della vitalità cellulare dei tessuti. (A) Lo schema generale della generazione di tessuti che combina cellule cardiache derivate da hiPSC, scaffold stampati con MEW e incapsulamento di idrogel di fibrina. (B) Immagini rappresentative a contrasto di fase di mini tessuti battenti. Barra della scala = 250 μm. (C) Immagine confocale Z-stack dell'organizzazione 3D dei tessuti; Le hiPSC-CM sono colorate con ACTN (verde), le hiPSC-CF sono colorate con VIM (rosso) e i nuclei sono colorati con DAPI (blu). La maglia MEW è indicata da punte di freccia. Barra graduata = 250 μm. (D) Evoluzione della velocità di battitura dei tessuti dalla generazione al giorno 14. I dati sono rappresentati come media con SD di N = 3, n = 2-4. (E) Vitalità cellulare (analizzata dall'attività metabolica) dei tessuti tra il 7° e il 14° giorno. I dati sono rappresentati come media con SD di N = 3, n = 3-6. (F) Analisi della contrazione di mini tessuti cardiaci che battono spontaneamente a 1 settimana. La velocità di contrazione (μm/s) e l'ampiezza di contrazione (μm) sono rappresentate come medie con SD (n = 16). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per generare un modello 3D composito di mini-tessuto cardiaco che replichi le caratteristiche native del miocardio umano, è necessario considerare diversi fattori essenziali. Questi possono essere raggruppati in tre punti principali: (1) ottimizzare la resa e la purezza delle cellule per la fabbricazione dei tessuti, (2) stampare l'impalcatura fibrillare per imitare l'ambiente meccano-3D e (3) integrare l'idrogel di fibrina nel processo di fabbricazione.

Alcuni dei passaggi chiave per garantire un processo di differenziazione di successo includono il mantenimento delle caratteristiche di pluripotenza delle hiPSC impedendo che la confluenza superi il 90%, l'ottimizzazione della diluizione di hiPSC al passaggio per ottenere un'adeguata confluenza all'inizio della differenziazione CM o CF e la messa a punto della concentrazione di CHIR per ciascuna linea cellulare per garantire un'efficiente induzione del mesoderma^{4, 15}. È essenziale garantire che le colture raggiungano una purezza superiore al 90% e che i diversi tipi di cellule cardiache siano generati separatamente. Ciò consente la formazione di tessuti funzionali in cui i ruoli specifici di ciascun tipo di cellula possono essere adeguatamente studiati, soprattutto quando vengono utilizzati per la modellazione della malattia o per i test farmacologici. Per mantenere questo alto livello di purezza cellulare, è fondamentale effettuare rigorosamente la selezione metabolica dei cardiomiociti nel mezzo restrittivo del glucosio. D'altra parte, quando si ottengono fibroblasti cardiaci sani, la capacità di modulare il loro fenotipo e la transizione in miofibroblasti attraverso la via TGF-β offre l'opportunità di modellare condizioni come la fibrosi cardiaca, descritta altrove²¹. In questo protocollo, l'attenzione si concentra sulla generazione di fibroblasti sani e non attivati. Per raggiungere questo obiettivo, è essenziale mantenere l'inibitore del TGF-β (SB) nel terreno di coltura dopo il completamento del processo di differenziazione. Inoltre, la coltura di hiPSC-CF non dovrebbe superare i sei passaggi, poiché ciò potrebbe innescare l'attivazione e la transdifferenziazione dei fibroblasti a causa della rigidità sovrafisiologica della plastica di coltura tissutale²².

Passando al processo di generazione di scaffold 3D artificiali, MEW si distingue come una tecnologia molto promettente grazie alla sua capacità di produrre architetture di fibre su scala micro e nanometrica altamente ordinate utilizzando materiali biocompatibili. Rispetto ad altre tecnologie di produzione additiva, MEW fornisce un controllo superiore sul diametro delle fibre attraverso la regolazione dei parametri del sistema come temperatura, velocità di raccolta e tensione applicata^23,24. Tuttavia, una produzione di fibre coerente e precisa richiede un'attenta messa a punto di questi parametri per mantenere la stabilità delle fibre. Fattori ambientali come la temperatura ambiente e l'umidità possono introdurre deviazioni minori ma significative nella produzione di scaffold , sottolineando la necessità di condizioni di fabbricazione controllate. Qualsiasi squilibrio può causare alterazioni del diametro delle fibre o deposizioni imprecise, influenzando la morfologia e le proprietà meccaniche dell'impalcatura²⁴. Pertanto, l'ottimizzazione di tutti i parametri sopra menzionati è uno dei passaggi critici di questo protocollo che deve essere ottimizzato in ogni laboratorio. Qui, per fabbricare gli scaffold fibrillari integrati nei costrutti 3D, il grado medico PCL è stato selezionato come polimero di scelta per la stampa MEW, in quanto non è solo il gold standard in questo campo, ma offre anche diverse proprietà vantaggiose del materiale. Il PCL ha un basso punto di fusione (~60°C) ed è semiconduttivo, il che semplifica i requisiti di lavorazione e migliora la consistenza della formazione delle fibre durante la stampa. Da un punto di vista biomedico, il PCL è altamente biocompatibile, supportando l'adesione e la crescita cellulare, rendendolo ideale per gli scaffold di ingegneria tissutale²⁵. Le recenti innovazioni sottolineano anche l'uso di materiali come il PCL grazie alla loro capacità di bilanciare la biodegradabilità con la stabilità meccanica, garantendo che gli scaffold forniscano un supporto adeguato per la rigenerazione dei tessuti mentre si degradano gradualmente senza produrre sottoprodotti dannosi^25,26. Ciò è essenziale per la potenziale applicabilità degli attuali costrutti per gli studi di rigenerazione cardiaca in vivo. Inoltre, la sintonizzabilità delle geometrie degli scaffold MEW offre un ulteriore potenziale per lo studio sia del comportamento cellulare che delle proprietà meccaniche nei costrutti di ingegneria tissutale. Modificando la dimensione dei pori e la rigidità dello scaffold, la MEW consente la creazione di ambienti che simulano la matrice extracellulare che influenza le risposte cellulari. Ciò fornisce una piattaforma versatile per lo studio delle interazioni cellula-impalcatura e migliora il potenziale di MEW per far progredire i campi dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa 26,27,28. Rispetto ad altre tecniche come il bioprinting 3D, che offre una precisione e una risoluzione inferiori, la capacità di MEW di produrre architetture ordinate con precisione controllata aggiunge un enorme valore alla sua applicazione.

Nonostante questi vantaggi, MEW presenta alcune limitazioni rispetto ad altre tecnologie di stampa 3D, in particolare per quanto riguarda l'altezza massima delle strutture stampabili. L'accumulo di cariche elettrostatiche all'interno delle fibre depositate diventa problematico quando l'altezza dell'impalcatura supera circa 4 mm, portando a distorsioni negli strati superiori dovute alla repulsione della carica²⁹. In questo caso, la sfida nel generare tessuti più spessi non riguarda tanto la repulsione delle fibre PCL, poiché questi tessuti in genere non superano i 200 μm di spessore, quanto la ridotta disponibilità di ossigeno nei costrutti più spessi (oltre i 200-300 μm)³⁰. Questa riduzione dell'ossigeno porta all'ipossia e alla successiva morte cellulare. Per superare questo problema e rendere i costrutti 3D adatti agli studi rigenerativi in vivo, i futuri miglioramenti dello spessore dei tessuti richiederanno l'integrazione di vascolarizzazione e perfusione. Questo è fondamentale, poiché l'incorporazione di reti vascolari nei costrutti 3D garantirà un'adeguata disponibilità di ossigeno e nutrienti in tutto il tessuto, che è un obiettivo attuale nel campo dell'ingegneria dei tessuti cardiaci 30,31,32.

È noto che il miocardio nativo è costituito da varie cellule cardiovascolari, tra cui cardiomiociti, fibroblasti, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali, tutte organizzate in modo altamente strutturato e allineato⁷. Sebbene gli attuali modelli tissutali incorporino solo CM e CF, la disposizione precisa di queste cellule, ottenute da hiPSC, all'interno della struttura 3D segna un progresso significativo. L'uso di scaffold MEW gioca un ruolo cruciale nel raggiungimento di questa organizzazione, poiché gli scaffold forniscono una microstruttura ben definita che promuove il corretto allineamento e l'organizzazione cellulare. In questo modello, i cardiomiociti mostrano sarcomeri ben organizzati e dimostrano una forte contrazione, che sono caratteristiche chiave del tessuto cardiaco funzionale. Questo livello di allineamento e organizzazione cellulare è fondamentale per imitare il tessuto cardiaco nativo e rappresenta un miglioramento significativo rispetto ad altri modelli, come gli organoidi cardiaci, dove le cellule spesso mostrano un allineamento casuale³³. Questo modello, quindi, fornisce un sistema fisiologicamente più rilevante per lo studio della funzione cardiaca e delle malattie, offrendo un migliore controllo sull'organizzazione cellulare, che è essenziale per la modellazione accurata dei tessuti cardiaci.

Tuttavia, per sviluppare modelli veramente rappresentativi di malattie cardiache, una sfida significativa è superare l'immaturità dei tessuti generati. Questo problema deriva in gran parte dalla natura immatura delle hiPSC-CM ottenute in vitro³⁴. Queste cellule non replicano completamente le proprietà funzionali dei cardiomiociti adulti, quindi è essenziale migliorarne la maturazione. Ciò può essere ottenuto attraverso due approcci primari: in primo luogo, promuovendo la maturazione delle hiPSC-CM stesse e, in secondo luogo, migliorando la maturità del tessuto multifenotipico complessivo. Strategie come la stimolazione meccanica ed elettrica si sono dimostrate promettenti nel guidare la maturazione sia funzionale che strutturale, contribuendo a creare modelli di tessuto che imitano più da vicino il tessuto cardiaco adulto nativo^35,36. Questi sono applicabili al modello attuale con piccole modifiche, data la natura autoportante dei tessuti basati su MEW.

Per quanto riguarda le fasi tecniche del protocollo di fabbricazione dei tessuti, è importante notare che il rapporto CM:CF incorporato nell'idrogel di fibrina può variare. È stato riportato che per i costrutti cardiaci ingegnerizzati, è necessaria una proporzione di fibroblasti del 5%-20% per imitare il naturale comportamento di battito dei tessuti, in quanto potrebbe aumentare il tasso di propagazione del potenziale d'azione³⁷. In questo studio, è stato selezionato un livello di hiPSC-CFs del 20% per valutare meglio le risposte dei fibroblasti nei successivi studi tossicologici. Anche il numero totale di cellule seminate può essere regolato, poiché i tessuti possono essere generati regolarmente con 0, 5, 10 o 20% di hiPSC-CF. Calcola sempre questa proporzione rispetto al volume totale del tessuto, non al suo diametro. Prima del processo di incapsulamento, deve essere garantita una buona vitalità cellulare. Per questo, cerca di scartare correttamente la soluzione di TrypLE durante la raccolta delle cellule ed evita di tenerle disaggregate e pellettate in singole cellule per troppo tempo prima della semina. Inoltre, poiché i cardiomiociti sono molto sensibili alle sollecitazioni meccaniche, assicurarsi di non centrifugare a g più alti di quelli specificati o di pipettare troppo forte.

Per potenziali applicazioni terapeutiche, è essenziale incapsulare le cellule all'interno di un materiale che supporti sia la vitalità che la funzionalità. In questo contesto, la fibrina è stata scelta per la sua elevata biocompatibilità, biodegradabilità e capacità di imitare i componenti della matrice extracellulare³⁸. I limiti di questo materiale derivano dalla sua significativa variabilità da lotto a lotto e dalla resistenza meccanica relativamente bassa. Tuttavia, questi problemi vengono affrontati attraverso il rinforzo fornito dagli scaffold fibrillari MEW. Per garantire la capacità di rimodellamento delle cellule all'interno di questa matrice porosa, è importante ottenere una soluzione omogenea della Miscela di Idrogel. Per questo, assicurarsi che il pellet Cell Mix sia sufficientemente asciutto, scartare il volume rimanente che potrebbe diluire la soluzione finale di idrogel e mescolare accuratamente con trombina. Per costrutti più grandi, anche il rapporto fibrinogeno/trombina deve essere regolato in relazione al volume totale del tessuto. Evitare le bolle d'aria è fondamentale per ottenere una struttura 3D ben definita e omogenea, che permetta alle cellule di diffondersi correttamente. Poco dopo l'aggiunta di trombina, dovrebbe essere evidente un aumento della viscosità del gel, insieme a un leggero cambiamento di colore dal rosa (Tissue Generation Medium) al giallo.

Infine, uno dei passaggi più importanti per garantire il successo del processo è l'aggiunta di aprotinina al terreno in cui i tessuti vengono trasferiti dopo che il gel di fibrina si è polimerizzato per 1 ora a 37 °C. L'apretina, un inibitore della serina proteasi, previene la fibrinolisi (degradazione della fibrina) inibendo gli enzimi proteolitici come la plasmina, che vengono rilasciati nel corpo o nella coltura^17,39. Senza inibizione, questi enzimi scomporrebbero la fibrina nei suoi prodotti di degradazione. Preservando l'integrità dell'impalcatura di fibrina, l'aprotinina consente alla matrice di rimanere funzionale per periodi prolungati, mantenendo la struttura 3D essenziale per supportare la vitalità e la funzionalità cellulare a lungo termine nei tessuti ingegnerizzati.

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Questa ricerca è stata finanziata dal programma di ricerca e innovazione H2020 nell'ambito delle convenzioni di sovvenzione n. 874827 (BRAV); Ministerio de Ciencia y Universidades (Spagna) attraverso i progetti PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT), PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) e PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA) finanziati da MICIU/AEI/10.13039/501100011033 e dall'Unione Europea NextGenerationEU/PRTR; Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) e BIOHEART (0011-1411-2022-000071); Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) e Gobierno de Navarra Salud GN32/2023. Figure 1A, Figure 2A e Figure 4A vengono create con BioRender.com.