Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

El desarrollo de tejidos cardíacos humanos funcionales es muy prometedor para avanzar en aplicaciones en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y la medicina regenerativa. Este protocolo describe la fabricación escalonada de tejidos miocárdicos en 3D con mimetismo avanzado de la estructura cardíaca nativa mediante la combinación de andamios de policaprolactona (PCL) con hidrogeles de fibrina y células cardíacas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). El proceso consiste en incrustar una mezcla de cardiomiocitos (hiPSC-CM) y fibroblastos cardíacos (hiPSC-CF) dentro de una matriz de fibrina para crear minitejidos, con soporte estructural proporcionado por andamios generados por MEW. Estos andamios fibrilares se fabrican a micro y nanoescala, lo que permite un control preciso sobre la arquitectura de la fibra, que desempeña un papel clave en la organización de la distribución y alineación de las células. Mientras tanto, la matriz de fibrina promueve la viabilidad celular e imita el entorno extracelular. La caracterización de los tejidos generados revela sarcómeros bien organizados dentro de los hiPSC-CM, junto con una actividad contráctil estable. Los tejidos muestran un batido espontáneo consistente tan pronto como dos días después de la siembra, con una funcionalidad sostenida en el tiempo. La combinación de hiPSC-CF con hiPSC-CM mejora la integridad estructural de los tejidos al tiempo que apoya la viabilidad celular a largo plazo. Este enfoque ofrece un método reproducible, adaptable y escalable para crear modelos biomiméticos de tejido cardíaco, proporcionando una plataforma versátil para pruebas preclínicas de fármacos, estudios mecanicistas de enfermedades cardíacas y posibles terapias regenerativas.

La fabricación de tejidos funcionales de ingeniería cardíaca humana es muy prometedora para aplicaciones de alto impacto. Estos abarcan desde el desarrollo de modelos de cardiotoxicidad de fármacos y enfermedades cardíacas humanas hasta la generación de tejidos terapéuticos de tamaños relevantes¹. A pesar de que los últimos 15 años han sido testigos de avances significativos en el campo, la fabricación de miocardio humano altamente mimético se ve actualmente frustrada por las dificultades para reproducir la compleja organización estructural y mecánica de su contraparte natural².

Desde el punto de vista biológico, la revolucionaria tecnología de reprogramación celular abrió la posibilidad de desarrollar células terapéuticas específicas para cada paciente. En la actualidad, las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) son la única fuente de cardiomiocitos humanos en un contexto personalizado. Se puede obtener un alto rendimiento de cardiomiocitos siguiendo protocolos de diferenciación robustos ^3,4. Una cuestión clave es el grado de maduración, ya que los cardiomiocitos derivados de hiPSC humanos (hiPSC-CM) utilizados actualmente muestran un fenotipo inmaduro en condiciones convencionales de diferenciación 2D⁵. Esto está ligado al hecho de que la organización estructural del tejido cardíaco es muy compleja, absolutamente diferente a los cultivos 2D convencionales. Además, el miocardio está compuesto por diferentes células cardiovasculares, incluyendo no miocitos como los fibroblastos cardíacos, el músculo liso y las células endoteliales, dispuestas ordenadamente a través de una estructura 3D específica, lo que permite un bombeo eficiente de la sangre ^6,7. Por lo tanto, se necesitan minitejidos cardíacos humanos altamente estructurados compuestos por todos los tipos principales de células para generar tejidos biomiméticos fisiológicamente relevantes.

La aplicación de nuevos enfoques de biofabricación puede romper este estancamiento. Entre ellas, la escritura por electrohilado fundido (MEW), una tecnología avanzada de impresión 3D es capaz de proporcionar una alta precisión y resolución. En MEW, se utiliza un campo eléctrico para depositar un polímero fundido en forma de fibras en el rango de tamaño de la celda, un orden de magnitud menor que la impresión 3D convencional de modelado por deposición fundida (FDM), lo que da como resultado estructuras de andamio altamente definidas ^8,9. MEW ha demostrado ser capaz de traducir un complejo diseño in silico en una matriz impresa y ajustar las propiedades físicas en 3D para que coincidan con las del tejido cardíaco¹⁰. Utilizando la tecnología MEW, es posible imprimir mallas poliméricas con diferentes formas y estructuras que, combinadas con hidrogeles blandos amigables con las células, generan tejidos compuestos que imitan el entorno micro y macromecánico del miocardio adulto nativo^11,12. Se ha demostrado que la modificación del diseño del andamio MEW 3D altera la funcionalidad resultante (transitorios de calcio)¹⁰, estableciendo las bases para comprender la relación forma-función en este prometedor sistema de ingeniería 3D.

Aquí, se proporciona un protocolo detallado para la fabricación de mini tejidos cardíacos contráctiles humanos a partir de hiPSC-CM y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC humanos (hiPSC-CF) y su combinación dentro de un hidrogel de fibrina reforzado con estructuras impresas en MEW en 3D. La adición de fibroblastos ha sido ampliamente utilizada en diferentes sistemas de ingeniería 3D para mejorar la supervivencia de las hiPSC-CMs y mantener la estructura de los tejidos, pero su uso en sistemas 3D-MEW aún no se ha explorado¹³. La tecnología descrita aquí proporciona una plataforma versátil para los investigadores que buscan desarrollar modelos precisos de tejido cardíaco con aplicaciones como la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, la toxicología preclínica y el cribado de fármacos. Este modelo es adecuado para evaluar la cardiotoxicidad de fármacos establecidos como las antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina), los inhibidores de la tirosina cinasa y las terapias emergentes como las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T), que se han asociado con la disfunción cardíaca¹⁴. Además, el modelo tiene un potencial significativo en el avance de la medicina regenerativa al permitir la prueba de biomateriales, biotintas y terapias basadas en células destinadas a mejorar la función cardíaca y restaurar el tejido miocárdico en afecciones como el infarto de miocardio.

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Configuración de medios y reactivos

1. Pre-recubrimiento de placas de cultivo celular
   1. Preparar las alícuotas de las acciones de Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). Descongele un vial de MGFr durante la noche en el refrigerador con hielo. En una campana estéril, utilizando puntas refrigeradas y manteniendo la culata y los tubos en hielo en todo momento, realice alícuotas de volumen adecuado diluyendo la culata 1:1 en frío RPMI 1640 L-glutamina (RPMI).
      NOTA: Para el cultivo de hiPSC y la siembra de cardiomiocitos hiPSC (hiPSC-CMs), se utilizan diferentes diluciones de MGFr. La dilución del recubrimiento MGFr para hiPSC varía según la línea celular específica. Sin embargo, una vez que se alcanza la etapa de cardiomiocitos, se utiliza la dilución 1:80 independientemente de la línea celular.
   2. Para el recubrimiento de placas de cultivo celular, descongele lentamente el número requerido de alícuotas de MGFr en hielo y diluya aún más en RPMI frío, 1:180 para el cultivo de hiPSC (100 μL de MGFr en 9 mL de RPMI) y 1:80 para el rerecubrimiento de hiPSC-CM (100 μL de MGFr en 4 mL de RPMI).
      1. Agregue inmediatamente el MGFr diluido a un volumen de 1 mL por pocillo para placas de 6 pocillos (mantenimiento de hiPSC) y 0,5 mL por pocillo para placas de 12 pocillos (rechapado de hiPSC-CM). Guarde las placas a 4 °C antes de usarlas (hasta 1 semana).
         NOTA: Las placas recubiertas de MGFr deben calentarse a 37 °C durante 30 minutos antes de la siembra de las células. Antes de colocar las células, aspire el líquido de la placa recubierta de MGFr.
   3. Para el cultivo de hiPSC-CFs, recubrir los matraces T75 o T175 con gelatina al 0,1% durante al menos 15 min a temperatura ambiente (RT) antes de su uso, a un volumen de 5 mL para los matraces T75 o de 10 mL para los matraces T175. Después de la incubación, aspire el líquido antes de la siembra de las células.
2. Medios de cultivo celular
   1. Para el cultivo de hiPSC, utilice Complete Essential 8 Medium (E8 medium) añadiendo Essential 8 Supplement (50x) a Essential 8 Basal Medium.
   2. Para la diferenciación de cardiomiocitos, prepare:
      1. RPMI/B27 sin insulina (medio -INS): Mezclar 500 mL de RPMI y 10 mL de B27 sin suplemento de insulina; RPMI/B27 (B27 medio): Mezclar 500 mL de RPMI y 10 mL de suplemento de B27.
   3. Para la purificación de cardiomiocitos (medio lactato), agregue 2 mL de lactato 1 M en 500 mL de RPMI 1640 sin glucosa. El medio puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   4. Para el replanteo de cardiomiocitos (medio de replaticación), complemente el medio B27 con un 10% de reposición de suero knock-out (KSR) y 10 μM de Y27.
      NOTA: KSR es una formulación definida y sin suero que reemplaza a FBS en los protocolos de cultivo ESC e iPSC.
   5. Para la diferenciación y el mantenimiento de los fibroblastos (día 11 en adelante), prepare el medio de crecimiento de fibroblastos 3 (FGM3) completo según las especificaciones del fabricante. Añada su paquete de suplementos (0,1 mL/mL de suero fetal de ternero, 5 μg/mL de insulina humana recombinante y 1 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos, FGF2) al medio basal FGM3.
      NOTA: Para promover la proliferación de fibroblastos, se recomienda aumentar la concentración de FGF2 a 10 ng/mL.
   6. Para la generación y el uso de mantenimiento de tejido cardíaco en 3D, prepare:
      1. Medio de generación de tejidos: Suplemento del medio B27 con 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 10% de KSR y 10 μM de Y27. Medio de mantenimiento de tejidos: Prepare medio B27 con 1% de P/S y aprotinina (0,1% (peso/vol); 33 μg/mL).
         NOTA: La aprotinina permite la integridad del gel de fibrina durante el tiempo de cultivo, evitando su degradación y manteniendo las células dentro del hidrogel. Por lo tanto, es muy recomendable que se agregue al medio el mismo día que se genera el tejido.
3. Soluciones madre de moléculas pequeñas y factores de crecimiento
   1. CHIR-99021 (CHIR): Para el inhibidor de GSK3 y el activador de señalización de Wnt, prepare una solución madre de 10 mM disolviéndola en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Las líneas hiPSC pueden responder al tratamiento CHIR de manera diferente. Es posible que sea necesario optimizar la concentración de CHIR. Se recomienda una prueba CHIR de 6-10 μM.
   2. C59, inhibidor de Wnt: Prepare una solución madre de 10 mM disolviéndola en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
   3. Y-27632, inhibidor de ROCK (Y27): Prepare un stock de 10 mM disolviéndolo en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 1 mes. La concentración final depende del tipo de célula objetivo. Utilice 2 μM (1/5000) para hiPSC y 10 μM (1/1000) para hiPSC-CM, hiPSC-CF y generación de tejidos.
      NOTA: Y27 promueve la supervivencia celular al suprimir la muerte celular en suspensión durante el desprendimiento. Úselo al cosechar para evitar la muerte celular excesiva.
   4. Ácido retinoico: Preparar una solución madre de 30 mM disolviéndola en cloroformo. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 2 años.
   5. FGF2 (Factor de Crecimiento de Fibroblastos Humanos Recombinante, también FGF-b, promueve la proliferación de fibroblastos): Preparar una solución madre de 50 μg/mL disolviéndola en agua estéril. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
   6. SB431542 (SB), inhibidor de señalización de TGFß1: Prepare una solución madre de 10 mM disolviéndola en DMSO. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Añádalo al medio de fibroblastos para mantener el estado de FQ y prevenir la transición de miofibroblastos (el fenotipo patológico que surge durante la fibrosis) en el cultivo 2D.
4. Soluciones madre para hidrogel de fibrina
   1. Fibrinógeno: Prepare una solución madre de 200 mg/mL. Primero, muela los grumos de fibrinógeno hasta convertirlos en un polvo fino usando herramientas estériles dentro de una campana celular. Agregue una solución tibia de NaCl al 0,9% (peso/vol) y manténgala a 37 °C hasta que se disuelva por completo. Almacene las alícuotas a -80 °C hasta un año; a 4 °C durante 1 semana.
      NOTA: Debido a su viscosidad a 4 °C, descongélelo y manténgalo en RT en algún momento antes de la etapa de generación de tejido para que pueda pipetearse con precisión. Si una alícuota no se puede pipetear fácilmente cuando se reutiliza, se recomienda desecharla y utilizar una nueva.
   2. Trombina: Preparar una solución madre de 100 U/mL disolviendo trombina en agua estéril al 60% de PBS + 40%. Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de un año a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Antes de usarlo, descongélelo y manténgalo en hielo hasta que se complete el paso de generación de tejido.
   3. Aprotinina: Prepare una solución madre de 33 mg/mL disolviendo aprotinina en agua estéril (100 mg de polvo en 3,04 mL de agua). Almacene las alícuotas a -20 °C durante un máximo de un año.
5. Soluciones para el análisis
   1. Tampón FACS (citometría celular): Prepare una solución de PBS (libre de Mg²⁺ y Ca²⁺) más 2,5 mM de EDTA y 5% (v/v) de FBS.

2. Cultura y paso de la iPSC humana

NOTA: Los procedimientos reportados aquí se han realizado con varias líneas sanas de hiPSC, incluyendo UCSFi001-A (macho, amable regalo del Profesor Bruce Conklin, Institutos David J. Gladstone), ESi044-A (macho), ESi007-A (hembra) y ESi044-C (hembra) y ESi107-A (línea enferma femenina de amiloidosis cardíaca) con adaptaciones menores relacionadas con el medio de cultivo de hiPSC, la dilución de paso y la concentración de CHIR. Su protocolo contiene los detalles específicos del uso de UCSFi001-A. Todas las incubaciones de cultivos celulares en este protocolo se realizan a 37 °C, 5% de CO₂ y 96% de humedad.

1. Línea de cultivo hiPSC en placas de 6 pocillos prerrevestidas MGFr 1:180. Manténgalos en el medio E8 para garantizar la pluripotencia.
   NOTA: Para evitar la diferenciación espontánea, es fundamental evitar el crecimiento excesivo de las culturas. Por lo tanto, realice el paso de hiPSC cuando las células sean 80%-90% confluentes.
2. Para el paso de las células, aspirar el medio viejo, lavar los pocillos dos veces con 1 mL de solución de EDTA 0,5 mM diluida en PBS (libre de Mg²⁺- y Ca²⁺) por pocillo, e incubar durante 7 min en EDTA/PBS a RT para interrumpir las adherencias intercelulares.
3. Aspirar el EDTA/PBS y recolectar las células, separándolas mediante un pipeteo vigoroso con una micropipeta de 1000 μL con 1 mL de medio E8 sobre la superficie del pocillo hasta que se desprendan las células. Recójalos en un tubo de centrífuga estéril.
   NOTA: Evite pipetear más de 10-15 veces, ya que aumentará la muerte por hiPSC.
4. A partir de este volumen, realice diluciones 1:15-1:20 y siembre las células en placas de 6 pocillos recubiertas con MGF en medio E8 + 2 μM de Y27. Mantenga Y27 solo las primeras 24 horas después de la siembra para evitar toxicidad por sobreexposición.
   NOTA: Ajuste la proporción de división para otras líneas de hiPSC para mantener las células indiferenciadas y en una morfología saludable durante 4-5 días.
5. Después de 24 h, aspire el medio viejo y agregue un medio E8 fresco a temperatura ambiente suficiente para dos días (generalmente 3-4 mL). Después de eso, cambie el medio cada día durante 3-4 días.
   NOTA: La frecuencia de paso depende de cada línea celular; Evita alcanzar el 100% de confluencia. Las hiPSCs deben crecer en colonias grandes, planas y compactas con geometría poligonal, bordes suavizados y una alta relación núcleo/citoplasma.

3. Diferenciación de cardiomiocitos humanos

NOTA: Para la generación de cardiomiocitos a partir de hiPSCs (hiPSC-CMs), el protocolo descrito se basa en la metodología de diferenciación monocapa utilizada por Lian et ^al.3,15 y Burridge et ^al.4. Con un mantenimiento adecuado, hiPSC se puede diferenciar en 30 pasos consecutivos con una alta eficiencia de diferenciación. Los signos de comportamiento anormal se detectan por diferenciación espontánea o fallo consecutivo de más de 4 diferenciaciones. Se recomiendan controles regulares, incluidas pruebas de micoplasma.

1. Para iniciar la diferenciación cardíaca, recoja las hiPSC con una confluencia del 80%-90% como se describe en el paso de la célula anterior (paso 2). Celdas de siembra en placas de 12 pocillos recubiertas con MGFr 1:180 ajustando las diluciones divididas para lograr monocapas de celdas compactas al 90% de confluencia después de 48-72 h de siembra. Para esta línea celular, haga diluciones 1:10, y las células lograrán la confluencia a las 72 h. Cambie el medio E8 diariamente.
   NOTA: en este protocolo, las diluciones se han ajustado por volumen, no por número de células, para evitar la variabilidad dependiente del usuario. Si el estado de monocapa no se alcanza dentro de las 72 h posteriores al recubrimiento, es muy probable que el proceso de diferenciación no tenga éxito. En tal caso, es aconsejable descartar el intento y reiniciar, asegurando una eficiencia de paso óptima.
2. Cuando las monocapas se estabilizan, comienza el proceso de diferenciación, considerado a partir de ahora como el día 0. A continuación, cambie el medio a medio -INS suplementado con 8 μM de CHIR, el activador de señalización Wnt, e incube la placa durante 24 h a 37 °C (1 mL por pocillo).
   NOTA: Valore la concentración de CHIR entre 6-12 μM para cada línea de iPSC para una inducción eficiente del mesodermo. En este paso, se espera un alto nivel de muerte celular, siendo una señal de un proceso óptimo.
3. Día 1: Al día siguiente, aspire el medio de cada pocillo y lave las células con RPMI sin suplementos (0,5 ml por pocillo). A continuación, añadir 1,5 mL de medio -INS fresco e incubar las células durante 2 días.
   NOTA: Los pasos de lavado se realizan durante todos los cambios de medios para eliminar los desechos, las células muertas y los residuos de suplementos.
4. Día 3: Para inducir la especificación del linaje cardíaco, reemplace el medio con 1,5 mL de medio -INS suplementado con 5 μM de inhibidor de Wnt C59 durante 48 h.
   NOTA: Aquí, se forma el complejo GSK3 y la ß-catenina se degrada, lo que da lugar al linaje mesodérmico cardíaco. También se observa cierta muerte celular después de este paso.
5. Día 5: Lavar y reemplazar con medio -INS fresco durante 48 h a un volumen de 1,5 mL por pocillo, para promover la expansión de los progenitores cardíacos.
6. Día 7: A partir de este día, las células se mantienen en el medio B27, con cambio de medio cada 2-3 días.
   NOTA: Ajuste las cantidades de medio a 2.5 mL por pocillo para omitir el cambio de medio durante el fin de semana, pero solo una vez que se haya alcanzado este estado. Normalmente, las hiPSC-CM comienzan a latir espontáneamente en los días 7-9. Primero, la contracción se observará como grupos aislados y descoordinados, pero en unos pocos días, los cultivos de alta pureza deberían formar una monocapa de batido uniforme.
7. Una vez obtenidas, estas monocapas contráctiles (generalmente en el día 10) se someten a un proceso de selección metabólica que consta de 2 ciclos de 72 h en medio lactato separados por una etapa de resiembra para eliminar las células no cardiomiocitos y enriquecer la pureza del cultivo.
8. Día 10, primer paso de purificación (^1º Lactato): Lavar las células batidoras con medio Lactato (0,5 mL por pocillo) e incubarlas con 1 mL por pocillo de medio Lactato durante 72 h.
   NOTA: El paso de lavado debe realizarse con medio Lactato o con el RPMI 1640 basal sin glucosa para eliminar completamente todos los restos del medio glucosa anterior (B27).
9. Día 13: Lavar y dejar que las células se recuperen de la primera ronda de purificación con 1,5 mL por pocillo de medio B27 durante 2 días.
10. Día 15 (paso de reenchapado): Entre los dos ciclos de purificación, disociar las monocapas lavándolas con EDTA/PBS e incubando con TrypLE durante 10 min a 37 °C (0,5 mL por pocillo).
    NOTA: El tiempo de incubación depende de cada línea celular.
11. Separe las células con una micropipeta de 1000 μL y recupérelas con 0,5 mL por pocillo de medio B27 suplementado con 10% de KSR (v/v) en un tubo de centrífuga estéril.
    NOTA: Los cardiomiocitos son sensibles al esfuerzo cortante y al pipeteo fuerte, así que trate de evitar los pasos repetidos de pipeteo. Otras opciones para una disociación de hiPSC-CM de menor daño podrían ser el uso de TrypLE 10x o colagenasa con DNasa. Optimice el tiempo de incubación para garantizar que sea suficiente para el desprendimiento de células sin causar daño celular ni requerir un pipeteo excesivo, lo que podría comprometer la integridad de las células.
12. Centrifugar 10 min a 100 x g en RT y replatearlos en placas de 12 pocillos recubiertas con MGFr 1:80 con medio de recubrimiento. Siembrórelos en 1 mL por pocillo.
    NOTA: Esto eliminará el exceso de células muertas y la matriz depositada durante la diferenciación, ya que estas pueden tener un impacto negativo en la generación de tejido.
13. Día 16: Después de 24 h de reenchapado, retire Y27 y KSR y mantenga las células en el medio B27 antes del siguiente paso de purificación (generalmente 48-72 h).
14. Día 18: Segunda etapa de purificación (^2º Lactato). Al igual que en el primer ciclo, lavar e incubar las células con medio de lactato durante 72 h (1 mL por pocillo).
    NOTA: Los ciclos de purificación pueden mejorar la pureza del cultivo hasta en un 30%, como se observa en el análisis de citometría de flujo del marcador de cardiomiocitos cTNT (troponina T cardíaca) (no mostrado). Este proceso reduce principalmente los fibroblastos y la contaminación restante por hiPSC. Aunque no se ha determinado el nivel de pureza mínimo aceptable requerido para continuar con la generación de tejido sin comprometer el rendimiento, se recomienda utilizar cultivos con una pureza de al menos 85%-90%. Este nivel de pureza favorece la mejora de la adhesión de los cardiomiocitos, aumenta la resistencia contráctil del tejido final y favorece la reproducibilidad entre experimentos.
15. Día 21: Una vez finalizada la purificación del lactato, mantener los cardiomiocitos purificados en el medio B27 hasta su uso, con cambios frecuentes de medio (cada 2-3 días).
    NOTA: El retraso en el uso disminuirá el rendimiento de las celdas, ya que serán más difíciles de separar. De ahí que sea recomendable utilizarlos entre el día en que se finaliza la segunda purificación de lactato y menos de una semana adicional.

4. Diferenciación de fibroblastos cardíacos humanos

NOTA: Para obtener fibroblastos cardíacos humanos (hiPSC-CFs) a partir de hiPSCs, el siguiente protocolo se basa en la metodología de dos fases utilizada por Zhang et ^al.16. El primer paso es obtener células epicárdicas (hiPSC-EpiCs) mediante la reactivación de la vía de señalización Wnt después de la inducción del mesodermo cardiogénico. A continuación, los hiPSC-EpiCs se exponen a inhibidores del desarrollo vascular y FGF2 para obtener fibroblastos cardíacos en 18 días.

1. Asegure el mantenimiento, la cosecha y la densidad de siembra de hiPSC como se describe en el protocolo de diferenciación de hiPSC-CM. Cultive hiPSCs en placas de 12 pocillos recubiertas de MGFr 1:180 para iniciar la diferenciación.
2. Cuando se logren monocapas compactas de hiPSC (Día 0), agregue medio -INS suplementado con 5 μM de CHIR (1,5 mL por pocillo) durante 48 h.
   NOTA: Valore la concentración de CHIR para cada línea de hiPSC para una inducción eficiente del mesodermo.
3. Día 2: Aspirar y desechar el medio, lavar las celdas con RPMI y reemplazarlo con 1,5 mL de medio -INS fresco durante 24 h.
   NOTA: Al igual que en el protocolo hiPSC-CMs, enjuague las celdas durante cualquier cambio de medio; Dependiendo de cada paso, utilice el medio basal no suplementado correspondiente.
4. Día 3: Incubar las células con medio -INS que contenga 5 μM de C59 (inhibidor de Wnt) durante 48 h (1,5 mL por pocillo).
5. Día 5: Para el replateado de las células mesodérmicas cardíacas, separar las células lavándolas con EDTA/PBS e incubándolas con TrypLE durante 5 min a 37 °C (0,5 mL por pocillo). Recoja las células en 0,5 mL por pocillo de medio basal Advance DMEM (ADMEM) y centrifugue durante 5 min a 300 x g a RT.
6. Siembre en placas de 12 pocillos prerrevestidas con MGFr 1:180 MGFr (1 mL por pocillo) a una densidad de 20.000 células/^cm2. Para el reenchapado, use ADMEM suplementado con 5 μM de CHIR, 2 μM de ácido retinoico, 10% KSR (v/v) y 10 μM de Y27.
7. Día 6: A las 24 h después del reenchapado, refresque el medio para eliminar Y27 y disminuir el KSR al 2%. Mantener las mismas concentraciones de CHIR y ácido retinoico durante 48 h más para lograr el desarrollo de un fenotipo epicárdico.
8. Día 8: Cultivo de células con ADMEM suplementado más 2% de KSR durante 72 h para promover la generación de monocapas epicárdicas.
   NOTA: Las hiPSC-EpiCs parecen ser células grandes planas o de forma cúbica agrupadas en colonias individuales. En este momento, al realizar las primeras rondas de diferenciación, los marcadores típicos de las células epicárdicas como WT1 (antígeno nuclear), ZO1 (antígeno de membrana citoplasmática) y TCF21 (antígeno citoplasmático) podrían analizarse mediante FACS (citometría de células de flujo) o IF (tinción de inmunofluorescencia) (no mostrado).
9. Día 11: Para replantear las células epicárdicas, disociar el lavado de hiPSC-EpiCs con EDTA/PBS e incubar con TrypLE durante 5 min a 37 °C (0,5 mL por pocillo). Recoja las células en medio FGM3 (0,5 mL por pocillo) y centrifugue durante 5 min a 300 x g en RT.
10. Replatee hiPSC-EpiCs en placas de 12 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% a una densidad celular de 10.000 células/^cm2. Utilice el medio FGM3 suplementado con 10 μM de SB (un inhibidor de la señalización de TGFß1 para evitar la transición de miofibroblastos, generalmente durante el cultivo en plástico) y 10 μM de Y27 (solo durante las primeras 24 h).
11. Al día siguiente, refrescar el medio fibroblasto (FGM3 + 10 μM de SB) cada 2 días hasta obtener hiPSC-CFs, haciendo un total de alrededor de 18 días para todo el proceso.
    NOTA: los hiPSC-CF deben presentar una morfología en forma de huso. En este caso, la expresión del marcador de fibroblastos DDR2 debe analizarse mediante técnicas FACS e IF (ver pasos 7.1-7.2).
12. Una vez que el cultivo de hiPSC-CFs es confluente, realice pasajes celulares 1:3 en matraces de gelatina T75 o T175 prerrecubiertos. Las células alcanzan el 90% de confluencia en 4-6 días aproximadamente. Para separar las hiPSC-CF, utilice el protocolo de recolección de TrypLE descrito para el replateado de hiPSC-EpiCs; aquí, no se requiere Y27 para el paso.
13. Mantener las hiPSC-CF en medio FGM3 + 10 μM de SB hasta su uso o congelarlas a paso bajo a una densidad celular de 1-3 millones de células por criotubo.
    NOTA: Se recomienda mantener las hiPSC-CF durante un máximo de 6 pasos antes de descongelar nuevas células, ya que cuando se cultivan en matraces de plástico a largo plazo, las células comienzan a diferenciarse en un fenotipo de miofibroblastos más contráctil.

5. Fabricación de andamios de escritura por electrohilatura fundida (MEW)

NOTA: Este protocolo utiliza homopolímero de poli ε-caprolactona (PCL) de grado médico para imprimir andamios fibrilares, utilizando una impresora MEW especialmente diseñada para este propósito por QUT, Queensland University of Technology¹⁰.

1. Prepare un material de polímero PCL para la impresión. Cargue los gránulos de PCL en una jeringa Luer-lock de plástico de 3 ml unida a una aguja de 23 G y derrítalos a 80 °C durante 2 h en el horno, presionando suavemente el pistón para eliminar las burbujas mientras se funde el polímero. Prepare varias jeringas y guárdelas en RT, ya que el PCL se solidifica rápidamente.
2. El día de la impresión, introduzca la jeringa dentro de la cámara de calentamiento y conéctela a una tubería de suministro N₂ presurizada. Encienda el equipo MEW, ajuste los reguladores de temperatura a 80/65 °C (cámara/boquilla) y mantenga la jeringa durante 30 minutos para garantizar la fusión adecuada del polímero.
3. Debajo de la jeringa, se encuentra la placa colectora, motorizada y móvil en las direcciones XY mediante un software compatible (Mach3). Mueva la placa colectora (control de cursores de computadora) hasta que el cabezal de impresión se coloque en un borde de la placa o en cualquier ubicación deseada, y ajuste la distancia entre la cámara de calentamiento y la placa colectora (distancia del colector) manualmente a 10 mm (plano Z).
   NOTA: Esta distancia debe probarse experimentalmente para alcanzar un diámetro de fibra determinado. Cuanto más corta sea la distancia del colector, más gruesa será la fibra y viceversa.
4. Cierre la puerta del equipo, que conecta automáticamente el suministro de campo eléctrico. Ajuste el voltaje a 7 kV y la presión N₂ a 2 bares para que pueda extruir a través de la punta de 23 G al imprimir.
   NOTA: Al suministrar un alto voltaje, se crea una diferencia de potencial entre la punta de la jeringa y la placa colectora (hecha de acero inoxidable). Luego, la gota acumulada en la boquilla por la presión suministrada se carga electrostáticamente, generando el cono de Taylor, que se dirige hacia la placa colectora. El voltaje y la presión se pueden ajustar para modificar las dimensiones finales de la fibra. Los parámetros de alta presión extruirán fibras más gruesas, lo que requerirá un mayor voltaje para estabilizar la fibra. El software se basa en el control numérico por computadora (CNC), por lo que las geometrías del andamio se escriben como un código G y se alimentan al programa, que controla el movimiento X-Y y la velocidad del motor de la placa del colector. Por lo tanto, antes de imprimir los andamios definitivos, se recomienda imprimir cualquier código G como paso previo para obtener un chorro estable que construya fibras definidas sin ningún aspecto de enrollamiento o latigazo. Para ello, optimice los parámetros mediante pequeños cambios cada vez, es decir, 0,1 bar para la presión del aire, 0,1 kV para la tensión y 60-100 mm/min para la velocidad del colector; esto asegurará un comportamiento de cono de Taylor del chorro.
5. Seleccione el código G diseñado en el software para imprimir andamios con una geometría de patrón cuadrado. Este código G de ejemplo imprime mallas cuadradas de 15 capas de 6 cm x 6 cm con poros de forma cuadrada de 0,5 mm x 0,5 mm.
6. Para imprimir fibras depositadas con precisión (es decir, fibras superpuestas), ajuste la velocidad del colector a 1080 mm/min.
   NOTA: Ajuste los parámetros de voltaje, presión, velocidad del colector y distancia del colector en cada equipo MEW para definir diámetros de fibra precisos (μm). Más allá de la influencia de los parámetros mencionados anteriormente, el aumento de la velocidad del colector da como resultado fibras más delgadas, mientras que la disminución produce fibras más gruesas. La configuración de parámetros en este protocolo permite la impresión de fibras con diámetros de 10-15 micras.
7. Presione el botón START en el software para comenzar a imprimir. Retire con cuidado el andamio del colector una vez finalizada la impresión.
   NOTA: Para facilitar el manejo del andamio después de la impresión, se recomienda imprimirlo en una pieza de vidrio más grande que el andamio, asegurada a la base del colector con cinta adhesiva.
8. Corta la malla impresa con un punzón de 6 mm de diámetro para obtener los andamios finales para la fabricación de tejidos.
9. Como las mallas de PCL son altamente hidrofóbicas, trátelas durante 5 minutos con plasma de_O2/Argón para aumentar su hidrofilicidad y promover la interacción con la fibrina y las células.
   NOTA: Opcionalmente, un tratamiento de 0,1 N de NaOH durante 15 min, seguido de lavados extensos de PBS, también funciona.
10. Esterilizar las mallas por inmersión en etanol al 70% durante 30 min, lavar abundantemente con agua destilada estéril durante 30 min, y dejar secar.
    NOTA: Realice este proceso en una placa de Petri estéril y dentro de una capucha estéril. No seque completamente las mallas hasta que se utilicen para evitar su adherencia a la placa y la consiguiente deformación.

6. Generación y mantenimiento de minitejidos de fibrina

NOTA: La generación de minitejidos miocárdicos humanos en 3D se basa en la encapsulación de células cardíacas derivadas de hiPSC dentro de hidrogeles de fibrina combinados con andamios MEW que proporcionan soporte fibrilar. El siguiente protocolo ha sido adaptado de los enfoques de diseño de ingeniería utilizados por Breckwoldt et ^al.17 y Ronaldson-Bouchard et ^al.18.

1. Separe hiPSC-CM como se describe anteriormente en el paso de replateado (3.10-3.11) del protocolo de diferenciación de hiPSC-CM (recolección de TrypLE). Vuelva a suspender el pellet de células en el medio de generación de tejidos para contar las células en la cámara de Neubauer.
2. Separe los hiPSC-CF como en el paso de recolección de hiPSC-CM con TrypLE. Utilice 3 mL de TrypLE para los matraces T75, 5 mL para los matraces T175 y el mismo volumen para inactivar la incubación de TrypLE. Finalmente resuspender el pellet celular en el Medio de Generación de Tejidos, al igual que para los CMs, ya que van a ser mezclados y cultivados en el mismo medio.
3. Cuente las celdas en una cámara de Neubauer. Calcula el número total exacto de células necesarias para sembrar todos los tejidos.
   NOTA: Este protocolo emplea 1 millón de células por tejido, que consta de un 80% de CM y un 20% de CF, es decir, 800.000 CM y 200.000 CF. Otras cantidades, como totales de 1,5 y 3 millones por tejido, también se pueden lograr con la práctica.
4. Mezcle y pegue las celdas totales necesarias en un tubo nuevo (Cell Mix), 5 min a 300 x g en RT. Asegúrese de que el pellet esté completamente seco y manténgalo en hielo hasta la siembra. Calcule el volumen total de hidrogel requerido para sembrar todos los tejidos.
   NOTA: Este protocolo requiere 35 μL por tejido (para un tamaño de andamio de 6 mm de diámetro) hasta una densidad final cercana a los 30 millones de células/mL, pero se puede aumentar, como ya se mencionó en el paso 6.4 anterior. Cada hidrogel de fibrina consta de 6 mg/mL de fibrinógeno más 5 U/mL de trombina junto con el Medio de Generación de Tejidos, en el que se resuspenden las células. Para un hidrogel de 35 μL, la relación fibrinógeno/trombina es de 1,05 μL/1,8 μL. Se recomienda un 10% más de volumen final de hidrogel para evitar la pérdida de volumen debido a errores de pipeteo. Ejemplo: para 10 tejidos, resuspender las células en 350 μL + 10%, es decir, 385 μL como volumen final total.
5. Vuelva a suspender la mezcla celular en el volumen requerido del medio de generación de tejidos. Mezclar con cuidado, evitando la formación de burbujas.
   NOTA: Para 10 tejidos, resuspender 10 millones de células (80 CMs:20 CFs) en 374,5 μL de Medio de Generación de Tejidos (volumen total de hidrogeles menos la cantidad total de fibrinógeno requerida para los tejidos totales, es decir, 10,5 μL).
6. Agregue el volumen requerido de fibrinógeno y mezcle con cuidado. Para 10 tejidos, agregue 10,5 μL de fibrinógeno a la mezcla de células, generando la mezcla de hidrogel. Manténgalo en RT.
   NOTA: Es esencial evitar el pipeteo excesivamente repetido para que las fuerzas de cizallamiento no afecten a la viabilidad de los hiPSC-CM. Se recomienda cortar un trozo de la punta de la pipeta con un bisturí estéril y luego volver a suspender la mezcla de hidrogel con él para reducir el daño por cizallamiento.
7. Para evitar la adhesión de la fibrina a la placa, siembre la mezcla de hidrogel en una superficie de politetrafluoroetileno (PTFE). Pipetear la mitad del volumen de un pañuelo (17,5 μL), que quedará en forma de gota, y hacerlo para el número total de tejidos.
   NOTA: No haga más de 10 pañuelos a la vez, ya que pueden secarse.
8. Coloque un andamio PCL encima de cada gota y agregue el volumen restante (17,5 μL). Asegúrese de que el andamio esté completamente sumergido.
   NOTA: Esté preparado para pipetear con ambas manos, ya que la reacción es muy rápida. Un pañuelo a la vez.
9. Añada la cantidad necesaria de trombina (1,8 μL) con la mano no dominante y mezcle rápidamente el hidrogel con la mano dominante (pipeteando al menos 2-3 veces).
   NOTA: Mezclar preferiblemente pipeteando menos del volumen total, para evitar la formación de burbujas (30 μL). Si se forma una burbuja de aire, pínchela rápidamente con una aguja.
10. Repite el paso anterior para cada pañuelo.
    NOTA: Es recomendable practicar esta técnica sin células hasta asegurar una buena manipulación.
11. Incubar los tejidos a 37 °C durante 1 h para completar la polimerización de la fibrina.
12. Tome suavemente cada tejido por el borde con pinzas estériles y colóquelos en placas de 12 pocillos con 2 mL por pocillo del medio de generación de tejidos suplementado con 33 μg/mL de aprotinina. Coloque un pañuelo por pocillo.
    NOTA: No los recoja por el centro del hidrogel para que las células puedan dañarse por la fuerza mecánica. Si es necesario, use una espátula.
13. Incubar los tejidos durante 24 h a 37 °C.
    NOTA: Es fundamental mantener la aprotinina en el medio de cultivo de tejidos desde el día de la generación, ya que se ha observado que omitir la aprotinina durante las primeras 24 h, aunque se añada más tarde, provoca un desprendimiento parcial de las células de la malla y el hidrogel. Esto compromete la cobertura celular completa necesaria para la integridad del tejido final.
14. Al día siguiente, refresque el medio con 2 mL del medio de mantenimiento de tejidos, eliminando los residuos de KSR e Y27. Cambia el medio cada dos días a partir de ahí.

7. Análisis sistemático del potencial de diferenciación cardíaca de la función hiPSC y minitisular

1. Análisis de citometría de flujo
   NOTA: Las células se analizan utilizando la modalidad de citometría "Clasificación celular activada por fluorescencia" (FACS) para determinar la eficiencia de la diferenciación de hiPSC. Todos los pasos se realizan en condiciones de temperatura ambiente.
   1. Disociar los cultivos celulares en suspensión unicelular (recolección de TrypLE), tanto los hiPSC-CM como los CF por separado.
   2. Vuelva a suspender el pellet a 250.000 células/mL en tampón FACS y dispense al menos 1 mL por tubo. Incubar durante 30 minutos para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos.
   3. Centrifugar las células a 300 x g en RT durante 5 min y desechar el sobrenadante.
      NOTA: Todos los pasos de centrifugación se realizan en estas condiciones.
   4. Para detectar antígenos intracelulares, fije y permeabilice las membranas celulares con un kit de permeabilización celular. En primer lugar, incubar las células con Reactive A (Fix) durante 30 min y centrifugar (como en el paso 7.1.3).
   5. A continuación, incube las células con B reactivo (Perm) más el anticuerpo primario durante 30 minutos. Utilice 100 μL de reactivo por tubo.
      1. En el caso de las células fluorescentes agudas, utilice el anticuerpo cTNT de ratón (troponina T cardíaca, marcador de MC) con una dilución de 1/200. En el caso de las hiPSC-CF, utilice un anticuerpo DDR2 de ratón (receptor de colágeno, marcador de FQ) con una dilución de 1/500.
         NOTA: Para detener todas las reacciones, agregue 1 mL de tampón FACS a cada tubo antes de la centrifugación.
   6. Incubar durante 15 min con el anticuerpo secundario Alexa-Fluor 488 anti-ratón diluido 1/100 en tampón FACS.
   7. Lavar 3 veces con PBS, centrifugando entre lavados (siguiendo las mismas condiciones que en el paso 7.1.3), y finalmente resuspender el pellet celular en 400 μL de PBS. Analizar en un citómetro o un dispositivo similar.
2. Análisis de tinción de inmunofluorescencia (IF)
   1. Para cultivos de células cardíacas en 2D, siembre ambos tipos de células por separado en un sistema de pocillo de cámara de cultivo prerrecubierto con portaobjetos de gelatina 1:80 MGFr o 0,1%. Placa de aproximadamente 80.000 células/^cm2 para alcanzar una confluencia de células suficiente para el análisis. En el caso de los mini pañuelos 3D, transfiéralos suavemente con pinzas a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
   2. Deseche el medio celular y lave las células o tejidos con PBS dos veces. Fijar las muestras con formalina al 10% (v/v) en RT; 15 min para la cámara de portaobjetos y 1 h para los mini pañuelos.
      PRECAUCIÓN: La formalina es peligrosa si se inhala y debe manipularse en una campana extractora.
   3. Deseche el tampón de fijación y lave 5 min con PBS tres veces. Almacene las muestras a 4 °C en PBS hasta su uso.
   4. Para permeabilizar la membrana celular, incubar las células con Triton X-100 (v/v) al 0,1% durante 10 min o tejidos 3D con Tween-20 al 1% durante 15 min a RT. Luego, lave 5 min con PBS tres veces.
   5. Para reducir las uniones de anticuerpos inespecíficos, tratar las muestras con una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% (v/v) durante 30 min en RT.
   6. Prepare soluciones primarias de anticuerpos en PBS más 1% de BSA para bloquear uniones no específicas e incubarlas durante la noche a 4 °C.
      1. En el caso de las hiPSC-CM 2D, utilice una dilución de 1/400 del anticuerpo anticardíaco α-ACTN (actinina sarcomérica) para ratones. En el caso de las hiPSC-CF 2D, utilice una dilución de 1/500 del anticuerpo anti-DDR2 en ratones. En el caso de los tejidos 3D, combine los dos anticuerpos específicos de CM y CF.
   7. Al día siguiente, aspire la solución de anticuerpos y realice 3 lavados con PBS a RT, de 5 min cada uno.
   8. Diluir los anticuerpos secundarios (Alexa-Fluor 488 y Alexa-Fluor 594) a 1/200 e incubar durante 1 h en RT en la oscuridad para identificar los anticuerpos primarios de ratón y conejo, respectivamente. Repita el lavado de PBS tres veces.
   9. Para contrarrestar la tinción de los núcleos, incubar las muestras con una dilución de 1/500 de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 20 min a RT en la oscuridad. Repita el lavado con PBS tres veces y almacene las muestras a 4 °C en PBS.
   10. Examine las muestras con un microscopio confocal, adquiera imágenes y procéselas con un software adecuado, como Fiji.
   11. En el caso de los mini pañuelos 3D, transfiéralos cuidadosamente con PBS entre dos cubreobjetos de vidrio para permitir una buena imagen.
       NOTA: Se recomienda un objetivo de inmersión en aceite de 40x o superior para obtener imágenes de pila Z a alta resolución.
3. Análisis de viabilidad celular
   NOTA: El ensayo Alamar Blue (AB) se utiliza para medir la actividad metabólica celular, que está directamente relacionada con la viabilidad celular en mini tejidos cardíacos 3D. Realice todo el proceso protegiendo las muestras de la luz y en condiciones estériles.
   1. Prepare una solución AB al 10% (v/v) en medio RPMI 1640 sin rojo fenol (ya que podría interferir con la medición colorimétrica).
   2. Transfiera con cuidado los minitejidos cardíacos a una placa de 48 pocillos con pinzas estériles. Incubar las construcciones con 300 μL de solución AB por tejido durante 1 h 30 min (tiempo de ajuste experimental) a 37 °C.
      NOTA: A medida que las células reducen la resazurina a través de la acción de las enzimas metabólicas, se generará un cambio de color en el medio de cultivo, que se medirá por espectrofotometría a 570 nm y 600 nm.
   3. Para la medición, recoja 100 μL por tejido de la solución AB metabolizada en una placa de 96 pocillos y lea las absorbancias.
      NOTA: Las muestras se pueden cultivar después de este análisis cambiando el medio a Medio de mantenimiento de tejido una vez más.
4. Análisis de contracción
   NOTA: Los minitejidos cardíacos comienzan a latir espontáneamente, generalmente 1-2 días después de la generación del tejido.
   1. Mida manualmente la frecuencia de batido observando los tejidos bajo el microscopio óptico (latidos/min). Si se miden muchos pañuelos al mismo tiempo, mantenga las placas calientes antes de cada lectura.
      NOTA: A medida que disminuye la temperatura, la tasa de batido también comienza a disminuir.
   2. Para una evaluación prolongada de la contractilidad cardíaca, obtenga videos de microscopía óptica de los tejidos latidos. A 4x para capturar un plano más grande o a 10x desde diferentes áreas de tejido. Graba alrededor de 30 s por video (al menos 3 tiempos).
   3. Utilice una velocidad de fotogramas de al menos 30 fotogramas por segundo y guarde el vídeo en formato .AVI.
      NOTA: Aquí, los vídeos se han analizado con un algoritmo de puntos de seguimiento personalizado desarrollado para MATLAB¹⁰. Con este método, se puede obtener la velocidad de contracción, el desplazamiento máximo de contracción (amplitud) y la dirección de contracción para cada video.
   4. Ejecute directamente el algoritmo en MATLAB para los vídeos contenidos en la carpeta de análisis. Proporcionará automáticamente un documento de Excel de resultados con los valores de velocidad de contracción por fotograma, amplitud de contracción por fotograma, ángulo de contracción (dirección) y sus respectivas desviaciones estándar¹⁰.
   5. Multiplique "Velocidad de contracción por fotograma" por la resolución de la cámara (μm/píxel) y por la velocidad de fotogramas de la cámara (fotogramas/s). Esto dará el valor final de la velocidad de contracción (μm/s).
   6. Multiplique 'Amplitud de contracción por fotograma' por la resolución de la cámara (μm/píxel), y esto dará el valor final de la amplitud de contracción (μm).
      NOTA: Sería posible analizar la cinética de contracción con más profundidad utilizando un software como MUSCLEMOTION, como se discutió en otro lugar ^19,20. La configuración de imágenes debe capturar al menos 60 fotogramas/s para su análisis con el software.

Caracterización de células cardíacas derivadas de hiPSC 2D
Con el fin de generar tejidos cardíacos multifenotípicos, las hiPSC-CM y las hiPSC-CF se diferencian y caracterizan in vitro de forma independiente. Con la optimización adecuada y un mantenimiento estricto, el siguiente protocolo dará como resultado un rendimiento de hiPSC-CMs de más del 80% alrededor del día 9 de diferenciación, dando lugar a células batientes espontáneas (Figura 1A). Además, el enriquecimiento de la pureza por selección metabólica elimina en gran medida las MC-no hiPSC, lo que da lugar a cultivos compuestos por más del 90% de las células que expresan la proteína troponina cardíaca (cTNT⁺) en el día 21 (Figura 1B). Estas robustas monocapas de batido muestran la expresión de la proteína actinina sarcomérica contráctil (ACTN) mediante tinción de FI (Figura 1C, D).

Por otro lado, el éxito de este protocolo radica en la generación de fibroblastos específicos del corazón a través de una inducción del estado epicárdico intermedio. Aquí, después de la reactivación de la señalización de Wnt por CHIR, se obtienen células epicárdicas en el día 8 de progenitores del mesodermo cardíaco (Figura 2A). Estas hiPSC-EpiCs son células grandes agrupadas en colonias individuales que, al replatearse con medio fibroblasto, dan lugar a células de fibroblastos cardíacos con morfología fusiforme (Figura 2C). Por lo tanto, después de 18 días totales de diferenciación, las hiPSC-CF presentan más del 90% de expresión de DDR2 mediante análisis FACS (Figura 2B). Este receptor de colágeno, caracterizado como un marcador de FQ, también es observable mediante la tinción de FI (Figura 2D).

Figura 1: Cronología de la diferenciación de las hiPSC-CMs y caracterización de la inmunofluorescencia y citometría de flujo. (A) El esquema general de la diferenciación de las CMs derivadas de las hiPSCs y las etapas de purificación. (B) Cuantificación por citometría de flujo de la pureza de hiPSC-CMs (porcentaje de células cTNT⁺ ) en el día 21. (C) Imagen representativa de contraste de fase de las células después de los pasos de purificación (día 21). Barra de escala = 100 μm. (D) Imagen confocal de hiPSC-CMs totalmente diferenciados teñidos con ACTN (verde) y núcleos teñidos con DAPI (azul). Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cronología de la diferenciación de hiPSC-CFs y caracterización de inmunofluorescencia y citometría de flujo. (A) El esquema general de la diferenciación de las CF derivadas de las células epicárdicas hiPSC. (B) Cuantificación por citometría de flujo de la pureza de hiPSC-CFs (porcentaje de células DDR2⁺ ) en el día 18 e imagen representativa de contraste de fase del cultivo (C); barra de escala = 100 μm. (D) Imagen confocal de hiPSC-CFs teñidos con DDR2 (verde) y núcleos teñidos con DAPI (azul). Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Generación de andamios PCL por MEW
Las propiedades mecánicas de los andamios están determinadas por el número total de capas, la densidad de la fibra, el diámetro, la distribución y la geometría de los poros. Estos son aspectos fundamentales que pueden influir fuertemente en el comportamiento celular. Una vez establecido, la puesta a punto del equipo (Figura 3A) y siguiendo los ajustes de impresión descritos en este protocolo (7 kV, distancia del colector de 10 mm, 2 bar, cabezal/boquilla de 80/65 °C, velocidad del colector de 1080 mm/s y punta de jeringa de 23 G), se generaron andamios cuadrados de 15 capas con geometría de poro cuadrado de 500 μm x 500 μm (Figura 3B). Las fibras de PCL se depositaron capa por capa correctamente, presentando un diámetro de fibra de alrededor de 15 μm.

Figura 3: Fabricación de equipos MEW y andamios fibrilares. (A) Configuración de MEW (i) y software Mach3 (ii); vista del cabezal de la impresora y la placa colectora (iii), y formación del cono de Taylor durante la impresión (iv). (B) Imágenes de contraste de fase de los andamios cuadrados fibrilares (i) y amplificación de la deposición precisa de fibras (ii). Barra de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Caracterización de la funcionalidad del minitejido cardíaco en 3D
Después de la disociación de una sola célula, la mezcla de células compuesta por hiPSC-CM 8:hiPSC-CF se sembró dentro de hidrogeles de fibrina en los andamios MEW PCL (Figura 4A). Después de 1 h de incubación a 37 °C, la fibrina se forma de manera estable, con células distribuidas uniformemente por todo el gel, cubriendo todos los poros de la malla (Figura 4B). Esto es importante ya que las hiPSC-CM son en su mayoría no mitóticas, y no es posible confiar en el crecimiento celular para llenar los poros como con otros tipos de células. Las células evidenciaron una rápida remodelación de la matriz circundante por elongación celular, con un latido espontáneo localizado tan pronto como 2 días después de la siembra. El análisis de tinción de FI mostró una distribución celular mixta de las células a lo largo del gel, interactuando con la malla PCL, con una mayoría de CMs (ACTN^{+ VIM}-) interespaciadas con VIM⁺ ACTN-hiPSC-CFs. Los hiPSC-CM exhiben una estructura de sarcómero bien organizada, marcada por la tinción regular de la proteína ACTN espaciada (Figura 4C). Los tejidos cardíacos de 1 millón de células mostraron una contracción estabilizada en toda la malla, con una frecuencia de latidos de alrededor de 30 lpm en el día 7 (28,93 ± 11,2, media ± DE). Esta capacidad funcional se mantuvo a lo largo de todos los días en cultivo, con un pequeño descenso hasta el día 14 (17,18 ± 12,6, media ± DE) (Figura 4D). Al analizar la actividad metabólica, los tejidos han demostrado mantener la viabilidad celular durante todo el cultivo, sin cambios significativos, aquí analizados como día 7 vs. día 14 (Figura 4E). Por último, el análisis de los puntos de seguimiento de los tejidos a 1 semana mostró una velocidad de contracción de 38,53 μm/s ± 19,8 (media ± DE, n=16) y una amplitud de contracción de 28,91 μm ± 15 (media ± DE, n=16) (Figura 4F).

Figura 4: Generación de minitejidos cardíacos humanos en 3D y caracterización de la estructura de los tejidos, la funcionalidad y la viabilidad celular. (A) El esquema general de la generación de tejidos que combina células cardíacas derivadas de hiPSC, andamios impresos MEW y encapsulación de hidrogel de fibrina. (B) Imágenes representativas de contraste de fase de mini tejidos batientes. Barra de escala = 250 μm. (C) Imagen confocal de pila Z de organización de tejido 3D; Las hiPSC-CM se tiñen con ACTN (verde), las hiPSC-CF se tiñen con VIM (rojo) y los núcleos se tiñen con DAPI (azul). La malla MEW se indica con puntas de flecha. Barra de escala = 250 μm. (D) Evolución de la velocidad de batido de los tejidos desde la generación hasta el día 14. Los datos se representan como media con DE de N = 3, n = 2-4. (E) Viabilidad celular (analizada por actividad metabólica) de los tejidos entre los días 7 y 14. Los datos se representan como media con DE de N = 3, n = 3-6. (F) Análisis de contracción de latidos espontáneos de minitejidos cardíacos a 1 semana. La velocidad de contracción (μm/s) y la amplitud de contracción (μm) se representan como medias con SD (n = 16). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para generar un modelo de minitejido cardíaco compuesto en 3D que replique las características nativas del miocardio humano, se deben tener en cuenta varios factores esenciales. Estos se pueden agrupar en tres puntos principales: (1) optimizar el rendimiento y la pureza de las células para la fabricación de tejidos, (2) imprimir el andamio fibrilar para imitar el mecanoentorno 3D y (3) integrar el hidrogel de fibrina en el proceso de fabricación.

Algunos de los pasos clave para garantizar un proceso de diferenciación exitoso incluyen el mantenimiento de las características de pluripotencia de las hiPSC evitando que la confluencia supere el 90%, la optimización de la dilución de hiPSC al paso para lograr una confluencia adecuada al inicio de la diferenciación de CM o CF, y el ajuste fino de la concentración de CHIR para cada línea celular para garantizar una inducción eficiente del mesodermo^{4. 15} de la Constitución. Es esencial garantizar que los cultivos alcancen una pureza superior al 90% y que los diferentes tipos de células cardíacas se generen por separado. Esto permite la formación de tejidos funcionales en los que se pueden estudiar adecuadamente las funciones específicas de cada tipo de célula, especialmente cuando se utilizan para el modelado de enfermedades o pruebas farmacológicas. Para mantener este alto nivel de pureza celular, es crucial llevar a cabo rigurosamente la selección metabólica de los cardiomiocitos en el medio restrictivo de la glucosa. Por otro lado, cuando se obtienen fibroblastos cardíacos sanos, la capacidad de modular su fenotipo y transición a miofibroblastos a través de la vía TGF-β ofrece la oportunidad de modelar afecciones como la fibrosis cardíaca, descrita en otra parte²¹. En este protocolo, la atención se centra en la generación de fibroblastos sanos y no activados. Para lograr esto, es esencial mantener el inhibidor de TGF-β (SB) en el medio de cultivo una vez completado el proceso de diferenciación. Además, el cultivo de hiPSC-CFs no debe exceder los seis pasos, ya que esto podría desencadenar la activación y transdiferenciación de fibroblastos debido a la rigidez suprafisiológica del plástico de cultivo de tejidos²².

Pasando al proceso de generación de andamios artificiales en 3D, MEW se destaca como una tecnología muy prometedora debido a su capacidad para producir arquitecturas de fibra a micro y nanoescala altamente ordenadas utilizando materiales biocompatibles. En comparación con otras tecnologías de fabricación aditiva, MEW proporciona un control superior sobre el diámetro de la fibra mediante el ajuste de los parámetros del sistema, como la temperatura, la velocidad de recolección y el voltaje aplicado^23,24. Sin embargo, la producción de fibra consistente y precisa requiere un ajuste cuidadoso de estos parámetros para mantener la estabilidad de la fibra. Los factores ambientales, como la temperatura ambiente y la humedad, pueden introducir desviaciones menores pero significativas en la producción de andamios, lo que subraya la necesidad de condiciones de fabricación controladas. Cualquier desequilibrio puede resultar en alteraciones en el diámetro de la fibra o deposición inexacta, afectando la morfología del andamio y las propiedades mecánicas²⁴. Por lo tanto, la optimización de todos los parámetros mencionados anteriormente es uno de los pasos críticos de este protocolo que debe optimizarse en cada laboratorio. Aquí, para fabricar los andamios fibrilares integrados en las construcciones 3D, se ha seleccionado el grado médico PCL como el polímero elegido para la impresión MEW, ya que no solo es el estándar de oro en este campo, sino que también ofrece varias propiedades ventajosas del material. El PCL tiene un punto de fusión bajo (~60 °C) y es semiconductor, lo que simplifica los requisitos de procesamiento y mejora la consistencia de la formación de fibras durante la impresión. Desde una perspectiva biomédica, el PCL es altamente biocompatible, apoyando la unión y el crecimiento de las células, lo que lo hace ideal para andamios de ingeniería de tejidos²⁵. Las innovaciones recientes también enfatizan el uso de materiales como el PCL debido a su capacidad para equilibrar la biodegradabilidad con la estabilidad mecánica, asegurando que los andamios proporcionen un soporte adecuado para la regeneración de tejidos mientras se degradan gradualmente sin producir subproductos nocivos^25,26. Esto es esencial para la posible aplicabilidad de los constructos actuales para los estudios de regeneración cardíaca in vivo. Además, la capacidad de ajuste de las geometrías de los andamios MEW ofrece un mayor potencial para investigar tanto el comportamiento de las células como las propiedades mecánicas en las construcciones de ingeniería de tejidos. Al modificar el tamaño de los poros y la rigidez del andamio, MEW permite la creación de entornos que simulan la matriz extracelular influyendo en las respuestas celulares. Esto proporciona una plataforma versátil para estudiar las interacciones célula-andamio y mejora el potencial de MEW para avanzar en los campos de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa 26,27,28. En comparación con otras técnicas como la bioimpresión 3D, que ofrece una menor precisión y resolución, la capacidad de MEW para producir arquitecturas ordenadas con precisión controlada añade un enorme valor a su aplicación.

A pesar de estas ventajas, MEW presenta ciertas limitaciones en comparación con otras tecnologías de impresión 3D, especialmente en lo que respecta a la altura máxima de las estructuras imprimibles. La acumulación de cargas electrostáticas dentro de las fibras depositadas se vuelve problemática cuando las alturas del andamio superan aproximadamente los 4 mm, lo que provoca distorsiones en las capas superiores debido a la repulsión de carga²⁹. En este caso, el desafío en la generación de tejidos más gruesos no tiene tanto que ver con la repulsión de las fibras de PCL, ya que estos tejidos generalmente no superan los 200 μm de espesor, y más con la disponibilidad reducida de oxígeno en construcciones más gruesas (más allá de 200-300 μm)³⁰. Esta reducción de oxígeno conduce a la hipoxia y a la posterior muerte celular. Para superar este problema y hacer que las construcciones 3D sean adecuadas para estudios regenerativos in vivo, las futuras mejoras en el grosor del tejido requerirán la integración de la vascularización y la perfusión. Esto es crucial, ya que la incorporación de redes vasculares en construcciones 3D garantizará una disponibilidad adecuada de oxígeno y nutrientes en todo el tejido, que es un enfoque actual en el campo de la ingeniería de tejidos cardíacos 30,31,32.

Es bien sabido que el miocardio nativo está formado por varias células cardiovasculares, incluyendo cardiomiocitos, fibroblastos, células musculares lisas y células endoteliales, todas organizadas de manera altamente estructurada y alineada⁷. Aunque los modelos de tejidos actuales incorporan solo CMs y CFs, la disposición precisa de estas células, obtenidas a partir de hiPSCs, dentro de la estructura 3D marca un avance significativo. El uso de andamios MEW juega un papel crucial en el logro de esta organización, ya que los andamios proporcionan una microestructura bien definida que promueve la alineación adecuada y la organización celular. En este modelo, los cardiomiocitos exhiben sarcómeros bien organizados y demuestran una fuerte contracción, que son características clave del tejido cardíaco funcional. Este nivel de alineación y organización celular es crucial para imitar el tejido cardíaco nativo y representa una mejora significativa con respecto a otros modelos, como los organoides cardíacos, donde las células a menudo exhiben una alineación aleatoria³³. Este modelo, por lo tanto, proporciona un sistema fisiológicamente más relevante para estudiar la función y las enfermedades cardíacas, ofreciendo un mejor control sobre la organización celular, que es esencial para el modelado preciso de los tejidos cardíacos.

Sin embargo, para desarrollar modelos verdaderamente representativos de la enfermedad cardíaca, un desafío importante es superar la inmadurez de los tejidos generados. Este problema se deriva en gran medida de la naturaleza inmadura de las hiPSC-CM obtenidas in vitro³⁴. Estas células no replican completamente las propiedades funcionales de los cardiomiocitos adultos, por lo que es esencial mejorar su maduración. Esto se puede lograr a través de dos enfoques principales: en primer lugar, promoviendo la maduración de los propios hiPSC-CM y, en segundo lugar, mejorando la madurez del tejido multifenotípico en general. Estrategias como la estimulación mecánica y eléctrica se han mostrado prometedoras para impulsar la maduración tanto funcional como estructural, ayudando a crear modelos de tejido que imitan más de cerca el tejido cardíaco adulto nativo^35,36. Estos son aplicables al modelo actual con pequeños cambios, dada la naturaleza autopermanente de los tejidos basados en MEW.

En cuanto a los pasos técnicos del protocolo de fabricación de tejidos, es importante tener en cuenta que la relación CM:CF incrustada en el hidrogel de fibrina puede variar. Se ha reportado que para las construcciones cardíacas diseñadas, es necesaria una proporción de fibroblastos de 5%-20% para imitar el comportamiento natural de latido de los tejidos, ya que podría aumentar la tasa de propagación del potencial de acción³⁷. En este estudio, se seleccionó un nivel de hiPSC-CFs del 20% para evaluar mejor las respuestas de los fibroblastos en estudios toxicológicos posteriores. También se puede ajustar el número total de células sembradas, ya que los tejidos se pueden generar regularmente con 0, 5, 10 o 20% de hiPSC-CF. Calcule siempre esta proporción en relación con el volumen total del tejido, no con su diámetro. Antes del proceso de encapsulación, se debe garantizar una buena viabilidad celular. Para eso, trate de desechar la solución de TrypLE correctamente al cosechar células y evite mantener las células desagregadas y peletizadas en células individuales durante demasiado tiempo antes de sembrar. Además, dado que los cardiomiocitos son muy sensibles al estrés mecánico, asegúrese de no centrifugar a una g superior a la especificada ni pipetear con demasiada fuerza.

Para posibles aplicaciones terapéuticas, es esencial encapsular las células dentro de un material que favorezca tanto la viabilidad como la funcionalidad. En este contexto, la fibrina ha sido elegida debido a su alta biocompatibilidad, biodegradabilidad y capacidad para imitar componentes de la matriz extracelular³⁸. Las limitaciones de este material surgen de su importante variabilidad de un lote a otro y de su resistencia mecánica relativamente baja. Sin embargo, estos problemas se abordan a través del refuerzo proporcionado por los andamios fibrilares MEW. Para asegurar la capacidad de remodelación de las células dentro de esta matriz porosa, es importante obtener una solución homogénea de la Mezcla de Hidrogel. Para ello, asegúrese de que el pellet de Cell Mix esté lo suficientemente seco, deseche cualquier volumen restante que pueda diluir la solución final de hidrogel y mezcle bien con la trombina. Para construcciones más grandes, la relación fibrinógeno/trombina también debe ajustarse en relación con el volumen total del tejido. Evitar las burbujas de aire es crucial para lograr una estructura 3D bien definida y homogénea, lo que permite que las células se propaguen correctamente. Poco después de la adición de trombina, debería notarse un aumento en la viscosidad del gel, junto con un ligero cambio de color de rosa (medio de generación de tejidos) a amarillo.

Por último, uno de los pasos más importantes para garantizar el éxito del proceso es la adición de aprotinina al medio donde se transfieren los tejidos después de que el gel de fibrina se haya polimerizado durante 1 h a 37 °C. La aprotinina, un inhibidor de la serina proteasa, previene la fibrinólisis (degradación de la fibrina) al inhibir las enzimas proteolíticas como la plasmina, que se liberan en el cuerpo o en el cultivo^17,39. Sin inhibición, estas enzimas descompondrían la fibrina en sus productos de degradación. Al preservar la integridad del andamio de fibrina, la aprotinina permite que la matriz permanezca funcional durante períodos prolongados, manteniendo la estructura 3D esencial para respaldar la viabilidad celular a largo plazo y la funcionalidad en los tejidos diseñados.

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Esta investigación fue financiada por el programa de investigación e innovación H2020 bajo los acuerdos de subvención No 874827 (BRAV); Ministerio de Ciencia y Universidades (España) a través de los proyectos PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT), PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) y PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA) financiados por MICIU/AEI/10.13039/501100011033 y por la Unión Europea NextGenerationEU/PRTR; Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) y BIOHEART (0011-1411-2022-000071); Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) y Gobierno de Navarra Salud GN32/2023. Las figuras 1A, 2A y 4A se crean con BioRender.com.