Method Article
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Questo protocollo stabilisce un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti e misurando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici.
I difetti della cartilagine dell'articolazione del ginocchio causati da traumi sono una lesione articolare sportiva comune nella clinica e questi difetti provocano dolori articolari, movimenti alterati e, infine, artrosi del ginocchio (kOA). Tuttavia, c'è poco trattamento efficace per i difetti della cartilagine o addirittura kOA. I modelli animali sono importanti per lo sviluppo di farmaci terapeutici, ma i modelli esistenti per i difetti della cartilagine sono insoddisfacenti. Questo lavoro ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti, e il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici sono stati utilizzati come esperimenti di lettura. Dopo l'intervento chirurgico, la soglia di ritiro meccanico è diminuita, i condrociti nel sito danneggiato sono stati persi, l'espressione della metalloproteinasi MMP13 della matrice è aumentata e l'espressione del collagene di tipo II è diminuita, coerentemente con i cambiamenti patologici osservati nei difetti della cartilagine umana. Questa metodologia è facile e semplice da eseguire e consente un'osservazione grossolana immediatamente dopo l'infortunio. Inoltre, questo modello può imitare con successo i difetti clinici della cartilagine, fornendo così una piattaforma per lo studio del processo patologico dei difetti della cartilagine e lo sviluppo di farmaci terapeutici corrispondenti.
La cartilagine articolare è un tessuto altamente differenziato e denso costituito da condrociti e matrice extracellulare1. Lo strato superficiale della cartilagine articolare è una forma di cartilagine ialina, che ha una superficie liscia, basso attrito, buona resistenza ed elasticità ed eccellente tolleranza alle sollecitazioni meccaniche2. La matrice extracellulare comprende collagene proteoglicano e acqua, e il collagene di tipo II è il principale componente strutturale del collagene, in quanto rappresenta circa il 90% del collagene totale3. Poiché non esistono vasi sanguigni o nervi nel tessuto cartilagineo, manca la capacità di auto-ripararsi dopo l'infortunio4. Pertanto, i difetti della cartilagine causati da traumi sono sempre stati una malattia articolare intrattabile nelle cliniche; Inoltre, questa malattia articolare tende a colpire i giovani e l'incidenza globale è in aumento 5,6. L'articolazione del ginocchio è il sito più comune di difetti della cartilagine, e i difetti qui sono accompagnati da dolori articolari, disfunzione articolare e degenerazione della cartilagine articolare, che alla fine porta all'artrosi del ginocchio (kOA)7. I difetti della cartilagine dell'articolazione del ginocchio comportano oneri economici e fisiologici per i pazienti e influenzano seriamente la qualità della vita dei pazienti8. Questa malattia rappresenta una sfida clinica importante e urgente senza soluzioni imminenti. Attualmente, la chirurgia è il cardine del trattamento per i difetti della cartilagine, ma il suo esito a lungo termine rimane insoddisfacente9.
I difetti clinici della cartilagine alla fine portano al kOA e, quindi, i modelli animali di kOA sono comunemente usati per lo studio patologico dei difetti della cartilagine e dello sviluppo di farmaci. La creazione di modelli animali è importante per comprendere il processo fisiopatologico di riparazione dei difetti cartilaginei che possono essere utilizzati per osservare la rigenerazione della cartilagine e l'alterazione tra fibrocartilagine e cartilagine ialina10. Tuttavia, i modelli animali kOA comunemente usati, come i modelli chirurgici di transezione del legamento crociato anteriore (ACLT), destabilizzazione del menisco mediale (DMM), ovariectomia (OVX) e Hulth, di solito richiedono una modellazione a lungo termine e consentono solo valutazioni patologiche e del dolore, il che pone limiti all'efficienza dello sviluppo del farmaco11. Oltre ai modelli chirurgici, anche i modelli chimici, come il monoiodoacetato (MIA) e l'iniezione di papaina, provocano difetti della cartilagine, ma il grado del difetto non può essere ben gestito e le condizioni sono lontane dalla realtà clinica11. La collisione è un altro approccio ai difetti della cartilagine modello negli animali più grandi, ma questo metodo dipende dall'uso di strumenti specifici e viene applicato raramente12.
In sintesi, i modelli di kOA esistenti non sono ideali per studiare la patogenesi dei difetti della cartilagine o sviluppare nuovi farmaci ed è necessario un modello specifico e standardizzato per i difetti della cartilagine. Questo studio ha stabilito un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore (FTCD) praticando fori nel solco trocleare femorale nei ratti. Sono stati condotti l'osservazione grossolana, i test sul comportamento del dolore e l'analisi istopatologica per la valutazione del modello. A differenza di altri modelli animali di kOA, questo modello ha scarso effetto sulle condizioni generali dei ratti. Questo approccio modellistico è accessibile, può essere ben gestito e supporta la comprensione della progressione dai difetti della cartilagine al kOA e lo sviluppo di terapie efficaci. Questo modello può anche essere utilizzato per testare terapie che prevengono il kOA curando i difetti nelle articolazioni pre-osteoartritiche.
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Medical Standards and Ethics Committee della Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, che è conforme alla legislazione cinese sull'uso e la cura degli animali da laboratorio. Nel presente studio, sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di 6 settimane del peso di 150-180 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi la tabella dei materiali).
1. Definizione di un modello di difetti della cartilagine a tutto spessore nei ratti
2. Soglia di prelievo meccanico (MWT)
NOTA: Il MWT del plantare posteriore bilaterale dei ratti è stato misurato con il classico metodo di misurazione del dolore del filamento di von Frey14.
3. Analisi istopatologiche e immunoistochimiche
In questo lavoro, è stato stabilito un modello di ratto di FTCD praticando fori nel solco trocleare femorale e rilevando il successivo comportamento del dolore e i cambiamenti istopatologici. Come mostrato nella Figura 1, 3 giorni dopo la modellazione, rispetto al gruppo sham, il MWT dei ratti nel gruppo modello è stato significativamente ridotto, suggerendo iperalgesia causata dalla FTCD. A 17 giorni dalla modellazione, la soglia di ritiro meccanico dei ratti nel gruppo modello è rimasta a un livello basso, indicando che la sensibilizzazione al dolore potrebbe durare almeno 17 giorni. I risultati della colorazione istopatologica hanno mostrato che, nel gruppo fittizio, la struttura della cartilagine articolare era chiara, la superficie della cartilagine era intatta, i condrociti erano distribuiti uniformemente e il collagene di tipo II era altamente espresso. Al contrario, nel gruppo modello, la superficie della cartilagine ha formato una depressione, i condrociti sono stati persi, l'espressione della metalloproteinasi della matrice MMP13 è aumentata e l'espressione del collagene di tipo II è diminuita (Figura 2 e Figura 3).
Figura 1: Sviluppo di MWT dopo difetti della cartilagine. Le soglie di prelievo meccanico delle zampe posteriori sono state valutate dopo che sono stati indotti difetti della cartilagine. n = 8 ratti/gruppo. I valori sono presentati come media ± SEM. **P < 0,01 rispetto al gruppo sham, ***P < 0,001 rispetto al gruppo sham. È stato eseguito un test t dello studente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Osservazione istopatologica (colorazione HE, SO, TB e Masson) e punteggio di Mankin delle articolazioni del ginocchio del ratto il giorno 17 dopo il trattamento dei difetti della cartilagine. (A) Immagini istologiche rappresentative di un ratto FTCD. Le frecce nere indicano i difetti della cartilagine. Barra di scala = 200 μm. (B) Analisi statistica dei punteggi dell'osteoartrite nei gruppi sham e modello. n = 6 ratti/gruppo. I valori sono presentati come media ± SEM. ***P < 0,001 rispetto al gruppo fittizio. È stato eseguito un test t dello studente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Osservazione immunoistochimica dell'espressione di Col1, Col3, Col2 e MMP13 e colorazione negativa nella cartilagine del ratto il giorno 17. Immagini istologiche rappresentative di un ratto FTCD. Le frecce nere indicano i difetti della cartilagine. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Immagini rappresentative dell'induzione di difetti della cartilagine a tutto spessore mediante perforazione nel solco trocleare femorale del ratto. (A) Ratto fittizio. (B) Ratto modello. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Valutazione istologica che mostra il riempimento completo dei difetti della cartilagine a tutto spessore nei ratti. (A) Un'immagine rappresentativa il giorno 17. (B) Un'immagine rappresentativa del giorno 56. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Questo studio descrive un modello animale per imitare i difetti clinici della cartilagine praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti (Figura supplementare 1). Dopo la lesione della cartilagine, l'eccitabilità o la reattività dei nocicettori periferici è migliorata, il che può comportare una diminuzione della soglia del dolore e il miglioramento della reattività alla stimolazione18. Negli studi preclinici, la modellazione dei difetti della cartilagine in diverse specie di animali ha sempre causato dolore19. La ricerca clinica ha anche dimostrato che i punteggi della scala analogica visiva del dolore (VAS) dei pazienti con lesioni della cartilagine sono significativamente inferiori a quelli di individui sani20. Abbiamo utilizzato il modello FTCD per testare l'effetto del trattamento FTCD e i risultati hanno mostrato che la diminuzione del MWT non era transitoria e che la MWT non si è ripresa rapidamente in un breve periodo di tempo. Dopo un periodo di trattamento, il MWT nel gruppo modello era ancora significativo, mentre il gruppo di trattamento era alleviato (dati non mostrati). L'efficacia clinica viene generalmente valutata sulla base di un ciclo di trattamento di 1 mese, quindi anche se il recupero avviene dopo alcuni mesi, non influisce sull'applicazione sperimentale di questo modello. Inoltre, la colorazione patologica e l'immunoistochimica sono state applicate per osservare i difetti della superficie della cartilagine e dimostrare l'istituzione di FTCD.
Questo metodo per modellare FTCD presenta i seguenti vantaggi: (1) il funzionamento facile e semplice; (2) il breve tempo di modellazione; (3) l'elevato tasso di successo; e (4) la presenza di progressione visibile attraverso l'osservazione grossolana. A differenza di altri modelli animali, questo modello può essere standardizzato. La profondità di foratura e il diametro del modello FTCD sono facili da controllare, il che è vantaggioso per standardizzare il modello FTCD e aumentarne la ripetibilità. In secondo luogo, il diametro del foro di perforazione è un fattore chiave che determina l'efficienza della riparazione. I difetti osteocondrali con un diametro di 1,4 mm possono auto-recuperare spontaneamente, portando al fallimento nella valutazione appropriata dei trattamenti terapeutici21. Per superare queste carenze e raggiungere la standardizzazione, sono stati condotti esperimenti preliminari ed è stato determinato che i difetti della cartilagine non si sarebbero riparati spontaneamente fino a 17 giorni dopo l'intervento chirurgico se l'intervento FTCD fosse stato eseguito sulla superficie della cartilagine articolare con fori di 1,6 mm di diametro. Nel corso del tempo, la FTCD causata dalla perforazione mostra la riparazione della cartilagine e la cartilagine difettosa viene in gran parte riparata entro 8 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura supplementare 2). In termini di applicazioni, questo modello potrebbe essere utilizzato non solo per studiare i difetti della cartilagine causati da kOA, ma anche per studiare i difetti traumatici della cartilagine, in particolare l'artrosi post-traumatica22. La cartilagine autoriparata forma sempre fibrocartilagine piuttosto che cartilagine ialina nel sito danneggiato, e questo modello potrebbe anche essere adatto per studiare la patogenesi e il trattamento della fibrosi cartilagineo23.
In termini di limitazioni di questo modello, sono stati scelti ratti immaturi, poiché i difetti della cartilagine causati da traumi nella pratica clinica tendono a verificarsi nei giovani. Tuttavia, nei ratti immaturi nella fase di sviluppo scheletrico, la cartilagine è più sottile di quella dei ratti maturi, il che può influenzare i risultati dell'esperimento24. Ricerche precedenti hanno dimostrato che la capacità delle cellule staminali di rigenerarsi dopo il danno alla cartilagine è ridotta nei topi adulti rispetto ai topi giovani25. Abbiamo selezionato ratti di 6 settimane per l'esperimento, e questi ratti potrebbero anche essere usati per osservare i meccanismi di riparazione delle cellule staminali; Inoltre, gli effetti terapeutici nei ratti di 6 settimane sono più pronunciati rispetto ai ratti adulti (dati non mostrati). Abbiamo anche bisogno di modellare FTCD nei ratti più anziani, e si potrebbe ipotizzare che la riparazione possa essere più lenta nei ratti anziani a causa di una ridotta capacità rigenerativa delle cellule staminali. La ricerca ha dimostrato che la cartilagine articolare che circonda i difetti osteocondrali possiede attività catabolica, e l'espressione di IL-1β e FGF2 e un disturbo nell'equilibrio FGFr1/FGFr3 sono importanti nell'avviare il processo di malattia osteoartritica precoce21. Tuttavia, il modello FTCD ha ancora limitazioni nella valutazione della riparazione dei difetti pre-osteoartritici. Un'altra limitazione di questo studio è stata la mancanza di misurazione dei MWT dopo 17 giorni di modellazione.
In conclusione, questo modello sarebbe un modello animale ideale e standardizzato per imitare i difetti della cartilagine praticando fori nel solco trocleare femorale dei ratti. Questo modello non solo imita la presenza e lo sviluppo di FTCD clinici, ma fornisce anche un modello animale affidabile per valutare i trattamenti terapeutici contro FTCD.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo studio è stato sostenuto dalla Zhejiang Natural Science Foundation (numero di sovvenzione LQ20H270009), dalla Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82074464 e 82104890), dalla Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (numero di sovvenzione 2020ZA039, 2020ZA096 e 2022ZB137) e dal Medical Health Science and Technology Project della Commissione sanitaria provinciale di Zhejiang (numero di sovvenzione 2016KYA196).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3, 3 '-diaminobenzidine | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9019 | The dye for IHC staining |
Anti-Collagen III antibody | Novus | NB600-594 | Primary antibody for IHC |
Anti-Collagen II antibody | Abcam (UK) | 34712 | Primary antibody for IHC |
Anti-Collagen I antibody | Novus | NB600-408 | Primary antibody for IHC |
Bouin solution | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
Celestite blue | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
Corncob paddings | Xiaohe Technology Co., Ltd | Bedding for animal | |
Eosin | Sigma-Aldrich | 861006 | The dye for HE staining |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | The dye for SO staining |
Goat anti-mouse antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9002 | Secondary antibody for IHC |
Goat anti-rabbit antibody | ZSGQ-BIO (Beijing, China) | PV-9001 | Secondary antibody for IHC |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3163 | The dye for HE staining |
Masson | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
Microdrill | Rwd Life Science Co., Ltd | 78001 | Equipment for surgery |
MMP13 | Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA) | 69926 | Primary antibody for IHC |
Modular tissue embedding center | Thermo Fisher Scientific (USA) | EC 350 | Produce paraffin blocks |
Neutral resin | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9555 | Seal for IHC |
Nonabsorbable suture | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd. | 4-0 | Equipment for surgery |
Pentobarbital sodium | Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd. | WBBTN5G | Anesthetized animal |
phosphomolybdic acid | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
Ponceau fuchsin | Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd. | R20381 | The dye for Masson staining |
Rotary and Sliding Microtomes | Thermo Fisher Scientific (USA) | HM325 | Precise paraffin sections |
Safranin-O | Sigma-Aldrich | S2255 | The dye for SO staining |
Scalpel blade | Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd. | 11 | Equipment for surgery |
Sodium citrate solution (20x) | Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK1222 | Antigen retrieval for IHC |
Sprague Dawley (SD) rats | Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd. | SD | Experimental animal |
Tissue-Tek VIP 5 Jr | Sakura (Japan) | Vacuum Infiltration Processor | |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | The dye for TB staining |
Von Frey filament | UGO Basile (Italy) | 37450-275 | Equipment for MWT assay |
Wire mesh platform | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | Equipment for MWT assay |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon