Dimostrazione dell'allineamento delle sequenze per prevedere lo strumento di suscettibilità tra le specie per una rapida valutazione della conservazione delle proteine

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare l'ultima versione dello strumento SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Suceptibility) dell'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti. Questo protocollo dimostra l'applicazione dello strumento online per analizzare rapidamente la conservazione delle proteine e fornire previsioni personalizzabili e facilmente interpretabili della suscettibilità chimica tra le specie.

Lo strumento SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Suceptibility) dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti è un'applicazione di screening online veloce e disponibile gratuitamente che consente ai ricercatori e alle autorità di regolamentazione di estrapolare informazioni sulla tossicità tra le specie. Per i bersagli biologici in sistemi modello come cellule umane, topi, ratti e zebrafish, sono disponibili dati di tossicità per una varietà di sostanze chimiche. Attraverso la valutazione della conservazione del bersaglio proteico, questo strumento può essere utilizzato per estrapolare i dati generati da tali sistemi modello a migliaia di altre specie prive di dati sulla tossicità, fornendo previsioni di suscettibilità chimica intrinseca relativa. Le ultime versioni dello strumento (versioni 2.0-6.1) hanno incorporato nuove funzionalità che consentono la rapida sintesi, interpretazione e utilizzo dei dati per la pubblicazione oltre a grafici di qualità di presentazione.

Tra queste funzionalità ci sono visualizzazioni di dati personalizzabili e un rapporto di riepilogo completo progettato per riassumere i dati SeqAPASS per facilitare l'interpretazione. Questo documento descrive il protocollo per guidare gli utenti attraverso l'invio di processi, la navigazione nei vari livelli di confronto delle sequenze proteiche e l'interpretazione e la visualizzazione dei dati risultanti. Vengono evidenziate le nuove funzionalità di SeqAPASS v2.0-6.0. Inoltre, vengono descritti due casi d'uso incentrati sulla conservazione della transtiretina e della proteina del recettore oppioide utilizzando questo strumento. Infine, i punti di forza e i limiti di SeqAPASS sono discussi per definire il dominio di applicabilità per lo strumento ed evidenziare diverse applicazioni per l'estrapolazione cross-specie.

Tradizionalmente, il campo della tossicologia si è basato fortemente sull'uso della sperimentazione animale intera per fornire i dati necessari per le valutazioni della sicurezza chimica. Tali metodi sono in genere costosi e richiedono molte risorse. Tuttavia, a causa del gran numero di sostanze chimiche attualmente utilizzate e del rapido ritmo con cui vengono sviluppate nuove sostanze chimiche, a livello globale vi è una riconosciuta necessità di metodi più efficienti di screening chimico ^1,2. Questa necessità e il conseguente cambiamento di paradigma dalla sperimentazione animale ha portato allo sviluppo di molti nuovi metodi di approccio, tra cui saggi di screening ad alto rendimento, trascrittomica ad alto rendimento, sequenziamento di prossima generazione e modellazione computazionale, che sono promettenti strategie di sperimentazione alternative ^3,4.

Valutare la sicurezza chimica attraverso la diversità delle specie potenzialmente influenzate dalle esposizioni chimiche è stata una sfida duratura, non solo con i test di tossicità tradizionali, ma anche con nuovi metodi di approccio. I progressi nella tossicologia comparativa e predittiva hanno fornito quadri per comprendere la sensibilità relativa delle diverse specie e i progressi tecnologici nei metodi computazionali continuano ad aumentare l'applicabilità di questi metodi. Nell'ultimo decennio sono state discusse diverse strategie che sfruttano i database di sequenze geniche e proteiche esistenti, insieme alla conoscenza di specifici bersagli molecolari chimici, per supportare approcci predittivi per l'estrapolazione tra specie e migliorare le valutazioni di sicurezza chimica oltre i tipici organismi modello 5,6,7,8.

Per far progredire la scienza in azione, basarsi su questi studi fondamentali in tossicologia predittiva, dare priorità agli sforzi di test chimici e supportare il processo decisionale, è stato creato lo strumento SeqAPASS (Sequence Alignment to Predict Across Species Suceptibility) dell'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti. Questo strumento è un'applicazione pubblica e liberamente disponibile basata sul web che utilizza archivi pubblici di informazioni sulla sequenza proteica in costante espansione per prevedere la suscettibilità chimica attraverso la diversità delle specie⁹. Sulla base del principio che la suscettibilità intrinseca relativa di una specie a una particolare sostanza chimica può essere determinata valutando la conservazione dei bersagli proteici noti di quella sostanza chimica, questo strumento confronta rapidamente le sequenze di amminoacidi proteici di una specie con sensibilità nota a tutte le specie con dati di sequenza proteica esistenti. Questa valutazione è completata attraverso tre livelli di analisi, tra cui (1) sequenza aminoacidica primaria, (2) dominio funzionale e (3) confronti critici dei residui di amminoacidi, ognuno dei quali richiede una conoscenza più approfondita dell'interazione chimica-proteina e fornisce una maggiore risoluzione tassonomica nella previsione della suscettibilità. Uno dei principali punti di forza di SeqAPASS è che gli utenti possono personalizzare e perfezionare la loro valutazione aggiungendo ulteriori linee di evidenza verso la conservazione del target in base alla quantità di informazioni disponibili per quanto riguarda l'interazione chimica-proteina o proteina-proteina di interesse.

La prima versione è stata rilasciata nel 2016, che ha permesso agli utenti di valutare sequenze di amminoacidi primari e domini funzionali in modo semplificato per prevedere la suscettibilità chimica e conteneva capacità minime di visualizzazione dei dati (Tabella 1). Le differenze individuali di amminoacidi hanno dimostrato di essere importanti determinanti delle differenze tra specie nelle interazioni chimico-proteiche, che possono influenzare la suscettibilità chimica delle specie^10,11,12. Pertanto, sono state sviluppate versioni successive per considerare gli amminoacidi critici che sono importanti per l'interazione chimica diretta¹³. In risposta al feedback delle parti interessate e degli utenti, questo strumento è stato sottoposto a rilasci annuali con nuove funzionalità aggiuntive progettate per soddisfare le esigenze sia dei ricercatori che delle comunità normative per affrontare le sfide nell'estrapolazione tra specie (Tabella 1). Il lancio della versione 5.0 di SeqAPASS nel 2020 ha portato avanti funzionalità incentrate sull'utente che incorporano opzioni di visualizzazione e sintesi dei dati, collegamenti esterni, tabelle di riepilogo e opzioni di report e funzionalità grafiche. Nel complesso, i nuovi attributi e le nuove capacità di questa versione hanno migliorato la sintesi dei dati, l'interoperabilità tra database esterni e la facilità di interpretazione dei dati per le previsioni di suscettibilità tra specie.

1. Per iniziare

NOTA: il protocollo qui presentato è incentrato sull'utilità dello strumento e sulle funzionalità chiave. Descrizioni dettagliate di metodi, caratteristiche e componenti sono disponibili sul sito Web in una Guida utente completa (Tabella 1).

Tabella 1: Evoluzione dello strumento SeqAPASS. Un elenco di funzionalità e aggiornamenti aggiunti allo strumento SeqAPASS dalla sua distribuzione iniziale. Abbreviazioni: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie; ECOTOX = ECOTOXicology knowledge base. Clicca qui per scaricare questa tabella.

1. Vai a https://seqapass.epa.gov/seqapass utilizzando Chrome. Selezionare Login per utilizzare un account esistente o seguire le istruzioni per creare un account SeqAPASS, che consentirà agli utenti di eseguire, archiviare, accedere e personalizzare i lavori completati.
2. Prima di condurre un'analisi, identificare una proteina di interesse e una specie mirata o sensibile esaminando la letteratura esistente o i dati preesistenti (Figura 1). Poiché SeqAPASS contiene collegamenti a risorse esterne per aiutare a identificare la proteina della query, fare clic sui pulsanti a discesa sotto Identificare un target proteico per accedere alle risorse pertinenti.

Figura 1: Formulazione del problema SeqAPASS: diagramma schematico delle informazioni preliminari necessarie per un'analisi di successo. Abbreviazioni: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie; LBD = dominio legante il ligando. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Interoperabilità di SeqAPASS tra database. Diagramma schematico di strumenti esterni, database e risorse integrati in SeqAPASS. Abbreviazioni: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie; AOP = via degli esiti avversi; NCBI = Centro nazionale per l'informazione biotecnologica; ECOTOX = ECOTOXicology knowledge base. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 2: Collegamenti, risorse e strumenti integrati nello strumento SeqAPASS. Un elenco delle varie fonti di dati, collegamenti e risorse sfruttate nello strumento SeqAPASS. Abbreviazione: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Sviluppo ed esecuzione di una query SeqAPASS: Level 1

NOTA: In un'analisi di livello 1, l'intera sequenza di amminoacidi primari di una proteina di query viene confrontata con le sequenze di amminoacidi primari di tutte le specie con informazioni di sequenza disponibili. Questo strumento utilizza algoritmi per estrarre, raccogliere e compilare dati disponibili pubblicamente per allineare e confrontare rapidamente le sequenze di amminoacidi tra le specie. Il backend memorizza le informazioni dai database del National Center for Biotechnology Information (NCBI) e utilizza strategicamente le versioni standalone del Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)⁵⁴ e del Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)⁵⁵.

1. In Confronta sequenze di amminoacidi primari fare clic su Per specie o Per accesso. Utilizzare la selezione Per specie per digitare o selezionare da un elenco di specie per scegliere il target proteico di interesse.
2. Inviare direttamente le accessioni proteiche (ad esempio, l'ID proteina NCBI) inserendo l'adesione o le adesioni nella casella di testo Per adesione .
3. Selezionare Esegui richiesta per inviare la query. Una volta inviato, attendi che venga visualizzata una notifica nell'angolo in alto a destra della finestra del browser che indica un invio riuscito.
4. Selezionare la scheda SeqAPASS Run Status nella parte superiore della pagina per visualizzare un elenco di tutte le esecuzioni di SeqAPASS condotte con quell'account utente e controllare la percentuale di completamento.
   1. Fare clic su Aggiorna dati mentre è selezionato il pulsante di opzione appropriato per verificare lo stato delle esecuzioni di livello 2 e livello 3.
5. Seleziona la scheda Visualizza report SeqAPASS nella parte superiore della pagina per accedere a un elenco di tutti i report completati con quell'account.
6. Nella scheda Visualizza report SeqAPASS , selezionare la proteina di query di interesse. Fare clic su Richiedi report selezionato per aprire la pagina Informazioni sulle proteine query di livello 1 e visualizzare i risultati, le opzioni di personalizzazione dei dati, le visualizzazioni e i report di riepilogo.
7. Per impostazione predefinita, selezionare Visualizza report per visualizzare i dati nel Web browser. In alternativa, selezionare Salva report per scaricare i dati non elaborati come file .zip.
   NOTA: il tempo necessario per un'analisi di livello 1 varia (in media 23 minuti per la versione 5.1) a seconda della domanda globale degli utenti in quel momento, del numero di processi inviati alla coda e della quantità di informazioni sulle proteine esistenti per un processo inviato. Se un bersaglio proteico è stato precedentemente completato, i dati saranno disponibili in pochi secondi dopo l'invio.

3. Sviluppo ed esecuzione di una query SeqAPASS: Level 2

NOTA: Poiché l'intera sequenza proteica non è direttamente coinvolta in un'interazione chimica, un'analisi di livello 2 confronta solo la sequenza amminoacidica del dominio funzionale per fare previsioni di suscettibilità a ranghi tassonomici inferiori (ad esempio, classe, ordine, famiglia).

1. Dalla pagina Informazioni sulle proteine della query di livello 1, fare clic sul segno più + accanto all'intestazione di livello 2 per popolare il menu Query di livello 2 .
2. Identificare i domini appropriati nella proteina di interesse (proteina di query).
   1. Se un dominio non è stato identificato, fare clic sul collegamento integrato al database dei domini conservati (CDD) NCBI (Tabella 1), che può aiutare nell'identificazione della selezione del dominio appropriato.
      NOTA: in genere, solo i domini di hit specifici vengono selezionati come query nel livello 2.
3. Fare clic sulla casella Seleziona dominio per popolare automaticamente un elenco di domini funzionali per la proteina della query.
4. Selezionare le accessioni al dominio dall'elenco a discesa e avviare la query di livello 2 facendo clic sul pulsante Richiedi esecuzione dominio . Una volta inviato, attendi che venga visualizzata una notifica che indica che l'invio è stato eseguito correttamente.
5. Fare clic su Aggiorna esecuzioni di livello 2 e 3 per popolare i dati di livello 2, che saranno disponibili entro pochi secondi dall'invio.
6. In Visualizza dati di livello 2, selezionare le accessioni al dominio completate dall'elenco a discesa e fare clic sul pulsante Visualizza dati di livello 2 per aprire i risultati in una nuova pagina.

4. Accesso e comprensione dei dati: SeqAPASS Livello 1 e Livello 2

1. Scorri fino alla fine della pagina Query Protein Information per visualizzare un report dei risultati: per impostazione predefinita viene fornito un report primario con analisi di livello 1 e 2. Selezionare il pulsante di opzione Report completo per visualizzare un report più dettagliato che fornisce tutti i riscontri della sequenza e le metriche di allineamento. Fare clic sull'accesso/ID/nome appropriato in entrambi i report per accedere alle informazioni trasparenti sull'allineamento delle proteine e sulla tassonomia nel database NCBI.
2. Scorrere fino al lato destro della tabella dei risultati per visualizzare la colonna ECOTOX . Fare clic sui collegamenti alla knowledge base di ECOTOXicology (ECOTOX) per raccogliere rapidamente i dati di tossicità corrispondenti per le specie con previsioni di suscettibilità.
   NOTA: ECOTOX è una knowledge base completa e pubblicamente disponibile che fornisce singoli dati sulla tossicità chimica per piante acquatiche e terrestri e fauna selvatica. SeqAPASS v6.0 include un widget ECOTOX per connettersi più rapidamente con i dati ECOTOX rilevanti per sostanza chimica e specie di interesse.
3. Fare clic su Scarica tabella per salvare la tabella come file di foglio di calcolo. Fare clic sul pulsante Visualizza report di riepilogo per visualizzare e scaricare una tabella di report di riepilogo che presenta i dati ordinati per gruppo tassonomico.
   NOTA: le tabelle di riepilogo dei dati sono disponibili sia per i report primari che per quelli completi e forniscono una panoramica delle previsioni per una determinata destinazione.

5. Manipolazione delle impostazioni dei dati: SeqAPASS Livello 1 e Livello 2

NOTA: In entrambe le analisi di livello 1 e livello 2, si presume che maggiore è la somiglianza proteica, maggiore è la probabilità che una sostanza chimica interagisca con la proteina in modo simile alla specie / proteina interrogata, rendendole suscettibili ai potenziali impatti delle sostanze chimiche con questo bersaglio molecolare. A causa della somiglianza di questi dati, i passaggi per comprendere i dati di livello 1 e 2 sono delineati insieme in un unico protocollo.

1. Fare riferimento ai sottomenu nella parte superiore di Query Protein Information per accedere e manipolare le impostazioni del report e utilizzare le impostazioni predefinite per tutte le opzioni di report per la maggior parte delle analisi. Se esiste una giustificazione scientifica per modificare l'impostazione predefinita, attenersi alla seguente procedura facoltativa:
   1. (FACOLTATIVO) Fare clic sul segno più + accanto a Soglia di suscettibilità per visualizzare e regolare le impostazioni di interruzione della suscettibilità in una nuova scheda. Selezionare un nuovo valore limite da un elenco a discesa o immettere un valore limite definito dall'utente.
   2. (FACOLTATIVO) Modificare il numero nel campo E-Value (il numero di diversi allineamenti previsti per caso) se si desidera qualcosa di diverso da quello predefinito.
      NOTA: Qualsiasi proteina con un valore E maggiore del numero nella casella verrà eliminata dal rapporto primario.
   3. (FACOLTATIVO) Utilizzare l'opzione Ordina per gruppo tassonomico per scegliere il livello della gerarchia tassonomica da visualizzare nella colonna Gruppo tassonomico filtrato della tabella dei risultati.
      NOTA: la modifica della gerarchia tassonomica altererà anche la previsione della suscettibilità basata sulle specie di ciascun gruppo filtrato che si trovano al di sopra del limite.
   4. (FACOLTATIVO) Modificare il campo Common Domain (quanti domini comuni una proteina deve condividere con la proteina di query da includere nei risultati) se si desidera qualcosa di diverso da quello predefinito.
      Nota : poiché l'impostazione predefinita è 1, qualsiasi sequenza che non condivide almeno un dominio comune con la proteina di query verrà esclusa.
   5. (FACOLTATIVO) Selezionare No in Specie Read Across per ottenere le previsioni di suscettibilità di Y solo se la percentuale di somiglianza è maggiore o uguale al cutoff o se il hit viene identificato come candidato ortologo.
      NOTA: per impostazione predefinita questa impostazione è Sì, il che significa che verrà riportata una previsione di suscettibilità di Y per tutti i candidati ortologi, tutte le specie elencate sopra il cutoff di suscettibilità e tutte le specie al di sotto del cutoff dello stesso gruppo tassonomico con una o più specie al di sopra del cutoff.
2. Fare clic sul pulsante Scarica impostazioni report correnti per scaricare un file che acquisisce le impostazioni correnti applicate.
   NOTA: il livello di valutazione specifico (1, 2 o 3) selezionato determinerà le impostazioni presentate nel report.

6. Visualizzazione dei dati: SeqAPASS Livello 1 e Livello 2

1. Fare clic sul segno più + accanto a Visualizzazione e fare clic sul pulsante Visualizza dati per aprire una scheda separata che visualizza le informazioni definite dall'utente e l'opzione per selezionare un grafico interattivo dei risultati.
2. Fare clic su Boxplot per aprire i controlli boxplot e plot interattivi e consentire l'aggiornamento attivo della visualizzazione boxplot per riflettere le modifiche apportate alla tabella dati e fornire grafica di qualità di pubblicazione e presentazione.
   NOTA: il boxplot predefinito visualizza i gruppi di specie sull'asse x e la somiglianza percentuale sull'asse y. I boxplot mostrano il cutoff di suscettibilità (linea tratteggiata), la somiglianza percentuale tra le specie rispetto alle specie di query e i valori medi e mediani per ciascun gruppo tassonomico insieme al 25 ° e 75 ° percentile e all'intervallo interquartile. A seconda dell'obiettivo dell'analisi e delle esigenze dell'utente, molte caratteristiche del boxplot possono essere modificate attraverso i seguenti passaggi opzionali.
   1. (FACOLTATIVO) Per personalizzare i gruppi tassonomici visualizzati, fare riferimento alla casella Gruppi tassonomici nella sezione Controlli . Rimuovi i gruppi scorrendo i nomi e selezionando x o utilizzando il menu a discesa Gruppi tassonomici .
   2. (FACOLTATIVO) Per aggiungere una legenda che indichi una specie di interesse o specifici gruppi predefiniti (ad esempio, specie in via di estinzione o minacciate), passa il mouse sopra il nome di un gruppo tassonomico sull'asse x per attivare una finestra pop-up che elenca le prime tre specie ordinate in base alla più alta percentuale di somiglianza. Passa il mouse sopra le specie nella legenda per generare una finestra popup con le informazioni sulle specie corrispondenti. Fare clic sulla casella relativa a un gruppo tassonomico specifico per generare una tabella riassuntiva scaricabile che elenca specie e previsioni.
3. Fare clic su Scarica Boxplot per scegliere un tipo di file, personalizzare la risoluzione di larghezza/altezza e salvare la visualizzazione.

7. Sviluppo ed esecuzione di un'analisi SeqAPASS: Level 3

NOTA: Un'analisi di livello 3 valuta i residui di amminoacidi identificati dall'utente all'interno della proteina di query e confronta rapidamente la conservazione di questi residui tra le specie. Si presume che le specie in cui questi residui sono conservati abbiano maggiori probabilità di interagire con una sostanza chimica in modo simile alla specie/proteina modello. Poiché il livello 3 si concentra sui singoli amminoacidi, un'analisi può essere eseguita solo quando è disponibile una conoscenza dettagliata dei residui di amminoacidi critici per l'interazione chimica-proteina o proteina-proteina.

1. Fare clic sul segno più + accanto all'intestazione di livello 3 nella pagina Informazioni sulle proteine della query di livello 1 per popolare il menu Query di livello 3.
2. Fare clic sul segno più + accanto a Esplora riferimenti per aprire lo strumento Esplora riferimenti, che genera una stringa booleana predefinita per interrogare la letteratura disponibile e aiuta gli utenti a identificare la letteratura appropriata per supportare l'identificazione di amminoacidi critici da utilizzare nella valutazione di livello 3 (Tabella 2 e Figura 2).
   1. (FACOLTATIVO) Una volta che la query protein si popola automaticamente, utilizzare la funzione Add Protein Name per aggiungere altre proteine.
3. Fai clic sul link Genera Google Scholar per aprire un popup contenente una stringa di ricerca generata automaticamente che include termini di ricerca pertinenti.
4. Fai clic su Cerca in Google Scholar per eseguire query nel database della letteratura utilizzando la stringa di ricerca.
   1. In alternativa, fare clic su Copia negli Appunti e personalizzare la stringa di ricerca aggiungendo o rimuovendo termini utilizzando le funzioni di Esplora riferimenti.

8. Identificare i residui critici di aminoacidi utilizzando la letteratura identificata

1. Selezionare la sequenza di modelli a cui verranno allineate le specie selezionate dall'utente nel menu Query di livello 3.
   NOTA: Questa sequenza modello viene comunemente scelta in base alla letteratura per la quale sono stati identificati gli amminoacidi critici e può essere la stessa specie o una specie diversa da quelle interrogate nel livello 1 e nel livello 2.
   1. (FACOLTATIVO) Utilizzare la casella Confronti aggiuntivi per confrontare eventuali accessioni/sequenze non visualizzate nelle tabelle Report primario/completo.
2. Immettere un nome definito dall'utente per l'esecuzione di livello 3 nella casella di testo Immettere il nome dell'esecuzione di livello 3 per identificare l'esecuzione di livello 3 completata. Scegli un nome univoco per ogni valutazione.
3. Selezionare il gruppo tassonomico di interesse nel campo Scegli gruppo tassonomico. Selezionare un gruppo tassonomico per filtrare automaticamente la tabella in base a tale gruppo tassonomico.
4. Nella tabella dei risultati, fare clic manualmente sulla casella di controllo accanto a qualsiasi specie da allineare alla sequenza del modello.
   NOTA: per garantire un allineamento appropriato, è necessario confrontare un gruppo tassonomico alla volta con il modello. Selezionare solo proteine annotate in modo simile per le specie di interesse. Quando si selezionano le sequenze per il confronto, è importante prestare attenzione a determinate sequenze (ad esempio, ipotetiche, BASSA QUALITÀ o parziali). A meno che non vi sia una giustificazione trasparente per l'inclusione, è meglio escludere queste sequenze in quanto potrebbero distorcere le previsioni a causa di informazioni di sequenza incomplete o inappropriate.
5. Ripetere i passaggi per allineare tutti i gruppi tassonomici di interesse.
6. Fare clic su Aggiorna esecuzioni di livello 2 e 3 una volta che tutte le specie sono state allineate per popolare il menu Seleziona nome esecuzione livello 3 con i processi di livello 3 completati e ottenere immediatamente i dati da un allineamento di livello 3.
7. Fare clic su Combina dati di livello 3 per combinare allineamenti da più gruppi tassonomici.
   1. In alternativa, per visualizzare un singolo report, selezionare il nome definito dall'utente in Scegli query da visualizzare e fare clic su Visualizza dati di livello 3.
8. Selezionare il modello di livello 3 da utilizzare come base per il confronto dei residui di amminoacidi nel menu Combina report di livello 3 e fare clic su Avanti.
9. In Processi di livello 3, selezionare i processi completati per il confronto e fare clic su Avanti. Utilizzare la funzione Processi di livello 3 dell'ordine per riordinare i gruppi tassonomici, se lo si desidera. Fare clic su Visualizza dati di livello 3 per creare una pagina di report di livello 3 con i gruppi tassonomici combinati allineati.
10. Selezionare le posizioni degli amminoacidi identificate in precedenza per la specie modello digitando le posizioni degli amminoacidi, separate da virgole, nella casella Immetti posizioni dei residui di amminoacidi e quindi selezionando Copia nell'elenco dei residui . Selezionare direttamente i residui nella sequenza del modello dalla casella shuttle.
11. Fare clic su Aggiorna report per aggiornare la pagina e visualizzare le previsioni di suscettibilità di livello 3.
    NOTA: Il livello 3 utilizza un semplice insieme di regole derivate da descrittori di base delle proprietà funzionali della catena laterale (ad esempio, alifatiche, aromatiche) e delle dimensioni molecolari (differenze di peso molecolare >30 g / mol) per determinare se le differenze nelle posizioni chiave possono influenzare le interazioni proteiche¹³.

9. Visualizzazione dei dati SeqAPASS di livello 3

NOTA: come nei livelli precedenti, sono disponibili i report primari e completi. Oltre ai dati identici ai dati di livello 1 e 2, il rapporto primario visualizza le posizioni degli amminoacidi, le abbreviazioni e una suscettibilità sì/no (Y/N) simile alla previsione del modello. Allo stesso modo, il rapporto completo contiene informazioni sulla classificazione delle catene laterali degli aminoacidi e sul peso molecolare.

1. Nella pagina Report livello 3 scorrere fino in fondo per visualizzare un report dei risultati. Fare clic su Scarica tabella nella parte inferiore del report per salvare la tabella .
2. Fare clic su Visualizza report di riepilogo di livello 3 per visualizzare e scaricare una tabella di report di riepilogo che presenta i dati ordinati per gruppo tassonomico. Fare clic sul segno più + accanto a Visualizzazione nella pagina Report di livello 3 per aprire una scheda del browser separata che visualizza le informazioni definite dall'utente e l'opzione per visualizzare i risultati sotto forma di una mappa termica interattiva.
3. Fare clic su Mappa termica nella pagina Informazioni di visualizzazione per aprire l'elemento grafico e i controlli interattivi e consentire l'aggiornamento attivo della visualizzazione della mappa di calore per riflettere le modifiche apportate alla tabella dati. Eseguire i seguenti passaggi facoltativi per personalizzare la mappa di calore.
   1. (FACOLTATIVO) Selezionare Opzioni report per passare da un report semplice, che visualizza la posizione dell'amminoacido, l'abbreviazione di una lettera e la somiglianza tra amminoacidi, o un report completo, che visualizza informazioni dettagliate su ogni amminoacido selezionato.
   2. (FACOLTATIVO) Selezionare Opzioni report per modificare la modalità di visualizzazione delle specie, in base al nome comune o al nome scientifico.
      NOTA: all'interno del rapporto semplice, gli amminoacidi sono classificati come Corrispondenza totale (blu scuro), Corrispondenza parziale (azzurro, sostituzioni che soddisfano un solo criterio) o Non corrispondenza (giallo, sostituzioni che non soddisfano nessuno dei due criteri) all'amminoacido del modello. Il report completo visualizza i confronti come Corrispondenza totale (blu scuro) o Non corrispondenza (giallo).
   3. (FACOLTATIVO) Selezionare Selezioni facoltative per evidenziare informazioni utili quali candidati ortologi, specie minacciate, specie minacciate o organismi modello comuni.
   4. (FACOLTATIVO) Seleziona Impostazioni mappa termica per selezionare ulteriori opzioni di personalizzazione, tra cui l'aggiunta o la rimozione di colonne, legende e testo.
4. Fare clic su Scarica Boxplot per scegliere un tipo di file e salvare la visualizzazione.

10. Interpretazione dei risultati di SeqAPASS: linee di prova per la conservazione delle proteine

NOTA: per facilitare l'interpretazione, questo strumento include un rapporto di riepilogo delle decisioni (DS Report) progettato per integrare i dati tra i livelli. Il DS Report contiene i risultati (cioè tabelle di dati e/o visualizzazioni) selezionati dall'utente e consente la rapida valutazione delle previsioni di suscettibilità su più livelli per più specie contemporaneamente.

1. Fare clic su Push Level # to DS Report nelle pagine dei risultati o della visualizzazione dei dati e attendere che i dati vengano "spinti" e che la scheda DS Report diventi attiva.
   NOTA: se i risultati o le modifiche non sono stati inviati al report DS, il report Push Level # to DS rimarrà attivo fino a quando non sarà selezionato. Se un'impostazione è stata modificata, verrà visualizzato il testo Fare clic per eseguire il push di nuove modifiche finché non verranno inviate le modifiche al report. Le visualizzazioni possono essere inviate al DS Report in qualsiasi momento durante la valutazione.
2. Selezionare la scheda DS Report in qualsiasi momento per accedere alla pagina DS .
   NOTA: Per tutte le specie allineate nel livello 1, la tabella del rapporto riassuntivo della decisione finale contiene i dati importanti e le previsioni di suscettibilità per ciascuna analisi. Se una specie nella tabella DS non è stata inclusa nel rapporto di livello 3 ma è stata trovata in lavori di livello 1 e/o livello 2, la cella nella tabella riceverà una designazione non applicabile (NA) per la previsione di suscettibilità di livello 3.

Per dimostrare l'applicazione dello strumento SeqAPASS ed evidenziare nuove funzionalità, vengono descritti due casi di studio che rappresentano casi in cui la conservazione delle proteine prevede che ci siano differenze nella suscettibilità chimica tra le specie (transtiretina umana) e che non ci siano differenze (μ recettore oppioide [MOR]). Il primo di questi esempi affronta la sequenza proteica / confronti strutturali per prevedere il dominio di applicabilità per le vie di esito avverso (AOP, vedi Tabella 2 per la definizione), mentre il secondo è focalizzato sullo sviluppo di ipotesi di ricerca rilevanti per la suscettibilità cross-specie agli oppioidi presenti nelle acque reflue. Gli approcci di base descritti in questi casi di studio possono essere applicati a qualsiasi sostanza chimica e dimostrano l'ampia utilità di questo strumento per il processo decisionale e la ricerca.

Gli ormoni tiroidei sono essenziali per la normale crescita e sviluppo. Sono sintetizzati nella ghiandola tiroidea e secreti nel flusso sanguigno dove si legano alle proteine di distribuzione e sono fatti circolare in tutto il corpo 14,15,16,17,18. Studi recenti hanno dimostrato che i contaminanti ambientali, come i policlorobifenili (PCB), gli eteri di difenile polibromurato (PBDE) e le sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS), possono legarsi in modo competitivo alla proteina di distribuzione transtiretina (TTR) e interrompere i normali processi tiroidei 19,20,21,22,23,24,25 . È stato sviluppato un AOP che descrive il legame competitivo con TTR che porta alla tossicità dello sviluppo neurologico umano (https://aopwiki.org/aops/152). Mentre ci sono prove che questa AOP è applicabile anche ai roditori, l'applicabilità ad altri gruppi tassonomici deve ancora essere definita. Poiché le sostanze chimiche che legano il TTR sono presenti nell'ambiente, è importante comprendere la rilevanza tassonomica di questa AOP, una sfida che può essere affrontata in parte attraverso l'analisi SeqAPASS. Utilizzando la strategia di formulazione del problema dello strumento, l'obiettivo dell'analisi può essere dichiarato come segue: con la consapevolezza che i composti leganti TTR portano a esiti avversi negli esseri umani, quali gruppi tassonomici sarebbero previsti per condividere una suscettibilità simile?

La proteina della transtiretina umana è ben caratterizzata, e ci sono diversi ligandi ben studiati noti per legarsi al sito di legame TTR umano (hTTR), rendendolo un bersaglio ottimale per l'analisi SeqAPASS ^8,9,13. Utilizzando l'adesione NCBI per la transtiretina umana, P02766.1, è stata condotta un'analisi di livello 1 con impostazioni predefinite. I risultati dell'analisi di livello 1 hanno fissato il limite percentuale di somiglianza al 49%, con mammiferi (Mammalia), uccelli (Aves), rettili (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), anfibi (Amphibia) e la maggior parte delle specie ittiche (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) che cadono al di sopra di questo limite (Figura 3). Pertanto, tutte le specie di questi gruppi tassonomici hanno portato a una previsione di suscettibilità di "Y" (cioè sì) e sono probabilmente suscettibili alle sostanze chimiche note per interagire con hTTR (Figura 3 e File supplementare 1).

Per la valutazione di livello 2 dei domini funzionali, è stato utilizzato il database NCBI Conserved Domain Database per identificare TR_THY (accession smart00095) come dominio conservato comprendente la catena matura della proteina della subunità TTR dai residui 27 a 147. Poiché la sequenza proteica del TTR riportata in NCBI include un pre-segmento di 20 aminoacidi non rilevante per l'analisi corrente, focalizzare il confronto sulla catena matura fornisce un'ulteriore, più specifica, linea di evidenza verso la conservazione di questa proteina tra le specie. Dalla valutazione di livello 2, è stato riportato un limite percentuale di somiglianza del 58%, con mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e la maggior parte delle specie ittiche che sono di nuovo al di sopra di questo limite (Figura 4). Di conseguenza, SeqAPASS ha concluso una previsione di suscettibilità di "Y" (cioè sì) per le specie di questi gruppi tassonomici, indicando che sono probabilmente suscettibili alle sostanze chimiche che interagiscono con la proteina hTTR (Figura 4 e File supplementare 1). Nel complesso, i risultati delle analisi di livello 1 e livello 2 suggeriscono che la maggior parte delle specie di vertebrati condivide la conservazione dell'hTTR e sono probabilmente suscettibili alle sostanze chimiche note per interagire con questa proteina.

Figura 3: Analisi SeqAPASS Level 1 della conservazione della transtiretina tra gruppi tassonomici con informazioni di sequenza disponibili relative alla proteina umana. La somiglianza percentuale della sequenza di amminoacidi proteici viene visualizzata sull'asse Y; Il gruppo tassonomico viene visualizzato sull'asse X. I cerchi aperti (○) indicano la sequenza di query e i cerchi chiusi (●) indicano la specie all'interno del gruppo tassonomico con la più alta somiglianza percentuale. All'interno del grafico, la parte superiore e inferiore di ogni casella rappresentano il 75 ° e il 25^° percentile, i baffi si estendono fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile e i valori medi e mediani sono rappresentati da linee nere orizzontali sulla scatola. La linea tratteggiata indica il limite per le previsioni di suscettibilità. Abbreviazioni: TTR = transtiretina; SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi SeqAPASS Level 2 della conservazione del dominio legante il ligando del recettore della transtiretina attraverso gruppi tassonomici con informazioni di sequenza disponibili relative alla proteina umana LBD. La somiglianza percentuale della sequenza di amminoacidi del dominio di legame del ligando viene visualizzata sull'asse Y; Il gruppo tassonomico viene visualizzato sull'asse X. I cerchi aperti (○) indicano la sequenza di query e i cerchi chiusi (●) indicano la specie all'interno del gruppo tassonomico con la più alta somiglianza percentuale. All'interno del grafico, la parte superiore e inferiore di ogni casella rappresentano il 75 ° e il 25^° percentile, i baffi si estendono fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile e i valori medi e mediani sono rappresentati da linee nere orizzontali sulla scatola. La linea tratteggiata indica il limite per le previsioni di suscettibilità. Abbreviazioni: TTR = transtiretina; SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Attraverso l'analisi di studi di modellazione molecolare e cristallografia proteica, sono stati identificati amminoacidi nella regione di legame del TTR che si prevede interagiscano con il ligando endogeno 3,3′,5,5′-tetraiodo-L-tironina (T4, PDB 2ROX), nonché con tre sostanze chimiche ambientali: perfluorottano sulfonato (PFOS, PDB 5JIM), tetrabromobisfenolo A (TBBPA, PDB 5HJG) e dietilstilbestrolo (DES, PDB 1TZ8)^{19, 21,22,26}. I residui di aminoacidi Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 e Thr139 sono stati tutti identificati come giocanti un ruolo chiave nelle interazioni proteina-ligando, sia attraverso interazioni dirette di legame idrogeno o interazioni di van der Waals. Questi sei residui di amminoacidi sono stati valutati in un'analisi di livello 3 tra le specie utilizzando hTTR come sequenza modello ed escludendo sequenze non omologhe, ipotetiche, parziali e di bassa qualità (file supplementare 1). Poiché in precedenza era stato stabilito che il TTR è conservato solo tra le specie di vertebrati, le specie di invertebrati sono state escluse da questa analisi (Figura 3 e Figura 4). Inoltre, è importante notare che le posizioni degli amminoacidi riportate in letteratura escludono un pre-segmento di 20 aminoacidi che è assente nella proteina hTTR matura e, per questo motivo, le posizioni presentate nel Livello 3 sono state aggiustate da quelle riportate in letteratura per garantire un allineamento accurato alla proteina modello selezionata¹⁵ (Supplemental File 1).

Nell'analisi di livello 3 del TTR, sono state selezionate 294 specie di vertebrati per l'allineamento (mammiferi, uccelli, anfibi, rettili e pesci). Delle specie valutate, 18 hanno mostrato differenze negli amminoacidi chiave con conseguente previsione della suscettibilità di "N" (cioè no). È interessante notare che cinque specie di mammiferi marini hanno presentato una sostituzione aminoacidica in posizione 2 (128A), mentre quattro specie di pesci hanno dimostrato sostituzioni in posizione 2 (128A) o posizione 6 (139T) (Figura 5). Poiché questi aminoacidi svolgono un ruolo importante nelle interazioni proteina-ligando nel canale di legame del TTR, questi dati suggeriscono che i ligandi TTR possono interagire in modo diverso in queste specie e comporterebbero una diversa suscettibilità chimica rispetto agli esseri umani.

Figura 5: Analisi SeqAPASS di livello 3 della conservazione dei residui di amminoacidi importanti per il legame TTR-chimico. (A) Tabella riassuntiva di livello 3 che mostra il numero di specie con dati di sequenza disponibili in tutti i gruppi tassonomici, il numero di specie che si prevede siano altrettanto sensibili (Y) e il numero di specie che si prevede non siano altrettanto sensibili (N). (B) Mappa di calore di livello 3 che mostra specie selezionate che si prevede non siano altrettanto sensibili rispetto alla proteina TTR della transtiretina umana, dimostrando amminoacidi completi, parziali e non corrispondenti. Abbreviazioni: TTR = transtiretina; SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

In risposta al feedback delle parti interessate e degli utenti, sono state progettate e incorporate nuove funzionalità nello strumento SeqAPASS, inclusa la possibilità di connettersi a dati empirici per diverse applicazioni. L'interoperabilità di questo strumento con la knowledge base di ECOTOX (Tabella 1) è stata ottenuta incorporando collegamenti esterni nelle tabelle di dati di livello 1 e livello 2 per le accessioni presenti in ECOTOX e creando un widget ECOTOX all'interno dello strumento per filtrare direttamente i dati di tossicità più rilevanti in ECOTOX. Attraverso i link e il widget, gli utenti possono interrogare rapidamente ECOTOX e raccogliere i dati di tossicità corrispondenti per le specie con le previsioni di suscettibilità SeqAPASS. Attualmente, le previsioni di SeqAPASS sono collegate a ECOTOX attraverso un fattore di stress chimico e specie; tuttavia, i dati di tossicità non sono ancora collegati a geni/proteine specifici, il che consentirebbe connessioni dirette con gli endpoint specifici/bersagli molecolari di interesse in SeqAPASS. Mentre collegare le previsioni ai dati di tossicità basati su un fattore di stress chimico non è l'ideale, poiché i dati potrebbero non essere specifici per un determinato percorso, stabilire una connessione per riunire i risultati è il primo passo. Come prima iterazione di un'integrazione SeqAPASS-ECOTOX, l'approccio attuale fornisce agli utenti tutti i dati di tossicità disponibili per i fattori di stress chimico e le specie a un livello ampio. Questi dati, se combinati con le previsioni di SeqAPASS, possono fornire un contesto ad ampi livelli (vertebrati vs invertebrati) e possono essere considerati nel contesto del framework AOP.

TTR presenta un buon esempio di caso per esaminare questa connessione, in quanto l'AOP esistente (AOP 152) fornisce il contesto per interpretare i dati di tossicità ECOTOX potenzialmente rilevanti. A partire dai ligandi esaminati nel livello 3 di SeqAPASS, sono stati raccolti dati di tossicità ambientale tra le specie per quattro sostanze chimiche note per interagire con il dominio di legame del ligando TTR (dietilstilbestrolo [DES], acido perfluoroesanoico [PFHxA], perfluorottano sulfonato [PFOS] e tetrabromobisfenolo A [TBBPA])19,21,23,24 . Per ogni sostanza chimica, ECOTOX è stato interrogato per i dati acquatici e terrestri dal numero CAS (Chemical Abstracts Service) utilizzando parametri di ricerca personalizzati (file supplementare 1). I dati sono stati filtrati per gruppi di specie di interesse (anfibi, uccelli, pesci, invertebrati, mammiferi, rettili). All'interno dei risultati delle query filtrate, è stata calcolata e implementata una media delle concentrazioni di effetto minimo e massimo dello studio come approssimazione della media per eventuali riscontri positivi che non hanno riportato un valore medio di concentrazione dell'effetto (Figura 6A e file supplementare 1). Nel contesto di una singola sostanza chimica, sono stati condotti test Kruskal-Wallis per confrontare le concentrazioni medie di effetti di diversi gruppi tassonomici poiché i dati non soddisfacevano le ipotesi del test ANOVA. Sono stati quindi condotti test di confronto a coppie post-hoc utilizzando il test di Dunn per tutte le sostanze chimiche, poiché i gruppi tassonomici consistevano in campioni di dimensioni disuguali. I risultati acquatici e terrestri sono stati analizzati separatamente, poiché i dati tra i due tipi di esposizioni non sono direttamente comparabili. Nell'ambito di ECOTOX, i dati sulla tossicità acquatica per le sostanze chimiche selezionate erano disponibili per anfibi, uccelli, invertebrati e specie ittiche (Figura 6A). I dati sulla tossicità terrestre per le sostanze chimiche selezionate erano disponibili solo per i mammiferi e il DES (Supplemental File 1).

Figura 6: Collegamento dei risultati di SeqAPASS con i dati empirici . (A) Concentrazioni medie degli effetti tra gruppi tassonomici con dati disponibili nella knowledge base di ECOTOXicology per sostanze chimiche selezionate note per legarsi alla proteina TTR umana. (B) Sovrapposizione del numero di specie incluse in ciascuna analisi SeqAPASS con le specie per le quali erano disponibili i dati ECOTOX. Nel pannello A, le parentesi lungo l'asse x indicano il numero di riscontri di query per i quali sono stati aggregati i dati. Gli asterischi indicano coppie di concentrazioni di effetti significativamente diverse tra gruppi di specie nel contesto di una singola sostanza chimica (test di Dunn, p < 0,05), dove un numero maggiore di asterischi indica livelli più elevati di significatività (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Le linee centrali all'interno di ogni casella rappresentano la mediana, con i bordi delle caselle che mostrano l'intervallo interquartile. I baffi si estendono fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile. I valori anomali che non rientrano in tale intervallo vengono visualizzati come singoli punti. Abbreviazioni: TTR = transtiretina; SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie; ECOTOX = ECOTOXicology knowledge base. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nel complesso, questi dati suggeriscono che la bioattività delle sostanze chimiche valutate si verifica nelle specie vertebrate ma non negli invertebrati. Mentre la mancanza di informazioni sul bersaglio biologico e sul percorso in ECOTOX rende impossibile collegare direttamente questi dati empirici al TTR, questi risultati supportano le previsioni di SeqAPASS secondo cui le specie di invertebrati non condividono la suscettibilità. Tutte le specie di vertebrati con dati disponibili hanno dimostrato suscettibilità sia al PFOS che al TBBPA, sebbene le concentrazioni medie dell'effetto fossero significativamente più elevate nei pesci e negli uccelli rispetto agli anfibi. Questi dati suggeriscono potenziali differenze di sensibilità tra gruppi tassonomici che possono essere attribuite a differenze di percorso biologico (incluso il TTR). È interessante notare che altre variabili come il metabolismo e l'escrezione possono anche svolgere un ruolo nelle differenze di sensibilità. Per PFHxA e PFOS, i pesci sono risultati significativamente più sensibili sia degli invertebrati che degli uccelli e, per il DES, gli anfibi presentavano concentrazioni di effetto medio significativamente più elevate rispetto agli invertebrati. Ancora una volta, questi dati supportano la nostra previsione SeqAPASS secondo cui gli invertebrati non condividono la suscettibilità con le specie di vertebrati. Di tutte le specie valutate utilizzando questo strumento per le quali erano disponibili dati di sequenza TTR, solo un piccolo numero aveva dati ECOTOX corrispondenti per le quattro sostanze chimiche di interesse (figura 6B, tabella supplementare S1 e tabella supplementare S2). Per quelle specie prive di dati apicali, le previsioni di suscettibilità di SeqAPASS aggiungono ulteriori linee di evidenza che le specie correlate possono comportarsi in modo simile a quelle con dati apicali. I dati per tutte le analisi SeqAPASS ed ECOTOX sono disponibili nel file supplementare 1.

Secondo i Centers for Disease Control and Prevention (CDC), nel 2017, gli oppioidi hanno contribuito a circa 47.600 morti per overdose negli Stati Uniti, un numero che continua a salire^{di 27}. Gli impianti di trattamento delle acque reflue negli Stati Uniti sono regolamentati a livello nazionale dal National Pollutant Discharge Elimination System dell'Agenzia per la protezione dell'ambiente degli Stati Uniti, che non richiede test per oppioidi o altri prodotti farmaceutici nel loro scarico²⁸. Negli ultimi anni, è stato fatto uno sforzo per utilizzare l'epidemiologia basata sulle acque reflue come strumento per mappare l'uso di oppioidi nella comunità. Gli sforzi di monitoraggio degli oppioidi hanno rilevato concentrazioni fino a 1,27 μg / L negli effluenti delle acque reflue e 0,7 μg / L nelle acque superficiali^29,30. Recenti studi di tossicità che valutano l'effetto dell'esposizione agli oppioidi sui pesci hanno riportato lo sviluppo di comportamenti di dipendenza ed effetti immunologici avversi (ad esempio, tassi di infezione più elevati, downregulation dei geni immunitari)^31,32,33. Nel complesso, questi studi suggeriscono che esiste un potenziale per esposizioni avverse agli oppioidi ambientali e sottolineano l'importanza di comprendere il rischio che queste sostanze chimiche rappresentano per le specie acquatiche. Data la gamma di specie che possono incontrare questi composti nell'ambiente, l'identificazione di specie potenzialmente sensibili utilizzando SeqAPASS può essere importante per la definizione delle priorità degli sforzi di test o monitoraggio.

Il MOR costituisce il principale bersaglio oppioide per la gestione del dolore ed è responsabile delle potenti proprietà analgesiche e di dipendenza degli alcaloidi oppiacei nell'uomo^34,35. A causa dell'importanza di questo recettore per la salute umana, i ligandi MOR sono ben noti e sono disponibili studi di cristallografia a raggi X di alta qualità, rendendo questo target ideale per l'analisi SeqAPASS 8,9,13. Utilizzando l'adesione NCBI per il recettore oppioide umano μ, ACM90349.1, è stata condotta un'analisi di livello 1 utilizzando le impostazioni predefinite. Il cutoff di suscettibilità è stato stabilito al 55% per il livello 1, con percentuali di somiglianze per mammiferi (Mammalia), uccelli (Aves), rettili (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), anfibi (Amphibia) e la maggior parte delle specie ittiche (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) che cadono al di sopra di questo limite; pertanto, le specie di questi gruppi tassonomici hanno portato a una previsione di suscettibilità di "Y" (cioè sì), indicando che sarebbero probabilmente suscettibili alle sostanze chimiche note per interagire con il MOR umano (Figura 7 e File supplementare 1). Utilizzando il NCBI Conserved Domain Database, 7tmA_Mu_opioid_R è stato identificato (adesione cd15090) come dominio funzionale comprendente tutte e sette le eliche della proteina MOR da 133 a 411, incluso un sito di legame del ligando putativo. Rispetto al livello 1, i risultati del livello 2 hanno identificato un cutoff di suscettibilità più elevato dell'88% di somiglianza, con mammiferi, uccelli, rettili, anfibi e la maggior parte delle specie di pesci trovati al di sopra di questo limite e con conseguente previsione di suscettibilità di "Y" per sì (Figura 8). Nel complesso, i risultati delle analisi di livello 1 e livello 2 suggeriscono che la maggior parte delle specie di vertebrati condivide la conservazione del MOR e sono probabilmente suscettibili alle sostanze chimiche note per interagire con la MOR umana.

Figura 7: Analisi SeqAPASS Level 1 della conservazione del recettore degli oppioidi μ attraverso gruppi tassonomici con informazioni di sequenza disponibili relative alla proteina umana. La somiglianza percentuale della sequenza di amminoacidi proteici viene visualizzata sull'asse Y; Il gruppo tassonomico viene visualizzato sull'asse X. I cerchi aperti (○) indicano la sequenza di query e i cerchi chiusi (●) indicano la specie all'interno del gruppo tassonomico con la più alta somiglianza percentuale. All'interno del grafico, la parte superiore e inferiore di ogni casella rappresentano il 75 ° e il 25 ° percentile, i baffi si estendono fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile e i valori medi e mediani sono rappresentati da linee nere orizzontali sulla scatola. La linea tratteggiata indica il limite per le previsioni di suscettibilità. Abbreviazioni: MOR = recettore mu-oppioide; SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Analisi SeqAPASS Level 2 della conservazione del dominio legante il ligando il recettore μ degli oppioidi rispetto al dominio nella proteina umana. La somiglianza percentuale della sequenza di amminoacidi del dominio legante il ligando viene visualizzata sull'asse Y; Il gruppo tassonomico viene visualizzato sull'asse X. I cerchi aperti (○) indicano la sequenza di query e i cerchi chiusi (●) indicano la specie all'interno del gruppo tassonomico con la più alta somiglianza percentuale. All'interno del grafico, la parte superiore e inferiore di ogni casella rappresentano il 75 ° e il 25 ° percentile, i baffi si estendono fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile e i valori medi e mediani sono rappresentati da linee nere orizzontali sulla scatola. La linea tratteggiata indica il limite per le previsioni di suscettibilità. Abbreviazioni: MOR = recettore mu-oppioide; SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Attraverso l'analisi di modelli molecolari e studi di cristallografia proteica, sono stati identificati amminoacidi nella regione di legame di MOR che si prevede interagiscano con ligandi noti. Sebbene il diverso insieme di ligandi che si legano bene ai recettori oppioidi si traduca in una farmacologia complessa, si osservano alcune interazioni ligando-proteina consistenti^36,37. Sulla base dell'aggancio molecolare a varie strutture cristalline MOR, sia la morfina che il fentanil, gli agonisti MOR ad alta affinità, interagiscono con D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 e Y326^36,38. I residui D147, Y148, M151 e H297 sono anche implicati nelle strutture cristalline di MOR legate all'agonista della morfina BU72, mentre D147, M151, H297 e Y326 sono anche critici nel legame con l'antagonista irreversibile della morfina β-funaltrexamine³⁷. Considerando queste linee di evidenza, sono stati selezionati nove residui (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) per la valutazione di livello 3 utilizzando MOR umano come sequenza modello ed escludendo sequenze parziali, previste, ipotetiche e di bassa qualità. È importante sottolineare che le posizioni degli amminoacidi riportate in letteratura escludono un segmento di 64 aminoacidi rispetto all'adesione della proteina NCBI e, per questo motivo, le posizioni nel livello 3 sono state selezionate per rappresentare quelle allineate con la sequenza modello per le sequenze di allineamento corrette.

Nell'analisi di livello 3 del MOR umano, sono state valutate 284 specie tra specie di vertebrati (mammiferi, uccelli, anfibi, rettili e pesci). In tutte le specie valutate, i nove amminoacidi erano una corrispondenza totale o parziale in base alla classificazione della catena laterale e al peso molecolare; di conseguenza, tutte le specie valutate hanno portato a una previsione di suscettibilità di "Y" per sì (Tabella 3 e File supplementare 1). Poiché questi aminoacidi sono importanti nel legame sia dei forti agonisti MOR che dei forti antagonisti, questi dati suggeriscono che i composti oppioidi che prendono di mira i recettori umani μ oppioidi possono interagire in modo simile con i recettori tra le specie di vertebrati. Sebbene ci siano pochi dati empirici disponibili fino ad oggi all'interno della base di conoscenze ECOTOX per i composti oppioidi, diversi studi suggeriscono che i pesci sono probabilmente sensibili^31,32,33. Nel complesso, i risultati di SeqAPASS indicano il potenziale per impatti ambientali più ampi delle sostanze chimiche che modulano la MOR tra le specie, indicando che una maggiore ricerca e forse un monitoraggio possono essere preziosi. I dati per tutte le analisi sono disponibili nel file supplementare 1.

Tabella 3: Analisi SeqAPASS Level 3 della conservazione dei residui di aminoacidi importanti per il legame chimico al recettore μ oppioidi. Tabella riassuntiva che mostra il numero di specie con dati di sequenza disponibili in tutti i gruppi tassonomici, il numero di specie che si prevede siano altrettanto sensibili (Y) e il numero di specie che si prevede non siano altrettanto sensibili, nonché amminoacidi completi, parziali e non corrispondenti. Abbreviazione: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S1: Specie con dati ECOTOX disponibili per le quattro sostanze chimiche di interesse note per legarsi alla proteina transtiretina umana. I dati disponibili per ciascuna sostanza chimica sono allineati con le previsioni SeqAPASS di suscettibilità simile tra i livelli 1, 2 e 3. Tutte le previsioni di SeqAPASS relative alla sequenza di transtiretina umana. Abbreviazioni: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie; DES = dietilstilbestrolo; PFHxA = acido perfluoroesanoico; PFOS = acido perfluorottano solfonico; TBBPA = tetrabromobisfenolo A. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S2: Numero totale di specie con dati disponibili nelle valutazioni SeqAPASS ed ECOTOX per sostanze chimiche selezionate note per legarsi alla proteina transtiretina umana. SeqAPASS fornisce mezzi per prevedere la suscettibilità delle specie in molte specie per le quali non sono disponibili dati empirici sulla tossicità. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: dati SeqAPASS ed ECOTOX per tutti i risultati rappresentativi. Il file contiene ToC seguito dalle seguenti schede tecniche: Tab 1-hTTR SeqAPASS Results Level 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Results Level 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Results Level 3, Tab 4-EcoTox data for DES, Tab 5-EcoTox data for PFOS, Tab 6-EcoTox data for PFHxA, Tab 7-EcoTox data for TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Mean Calculations, Confronto dei dati Tab 9-SeqAPASS EcoTox, Tab 10-hMOR SeqAPASS Results Level 1, Tab 11-hMOR SeqAPASS Results Level 2 e Tab 12-μ-hMOR SeqAPASS Results Level 3. Abbreviazioni: SeqAPASS = allineamento della sequenza per prevedere la suscettibilità delle specie; ToC = Sommario; hTTR = transtiretina umana; ECOTOX = base di conoscenze ecotossicologiche; DES = dietilstilbestrolo; PFOS = acido perfluorottano solfonico; PFHxA = acido perfluoroesanoico; TBBPA = tetrabromobisfenolo A; hMOR = recettore mu-oppioide umano. Clicca qui per scaricare questo file.

C'è un riconoscimento diffuso che non è possibile testare empiricamente abbastanza specie per catturare la diversità genomica, fenotipica, fisiologica e comportamentale degli organismi viventi che possono essere esposti a sostanze chimiche di interesse tossicologico. L'obiettivo di SeqAPASS è massimizzare l'uso di sequenze proteiche esistenti e in continua espansione e dati strutturali per aiutare e informare l'estrapolazione dei dati / conoscenze sulla tossicità chimica dagli organismi testati a centinaia o migliaia di altre specie attraverso confronti a livello molecolare. Lo strumento SeqAPASS è stato progettato per ridurre la complessità dei confronti delle sequenze proteiche per scienziati, valutatori del rischio e regolatori attraverso un'analisi semplificata e rapida che include tabelle riassuntive generate e scaricabili in modo trasparente, visualizzazioni interattive dei dati e la facile identificazione delle specie minacciate e in via di estinzione, nonché degli organismi modello comuni. I protocolli sono descritti qui per eseguire SeqAPASS Livelli 1, 2 e 3 per la valutazione della somiglianza della sequenza di aminoacidi primari, della conservazione del dominio funzionale e degli amminoacidi critici coinvolti nelle interazioni chimica-proteina e proteina-proteina. Le linee di evidenza raccolte da ciascun livello di analisi SeqAPASS prevedono la suscettibilità chimica tra le specie, fornendo dati coerenti e facilmente interpretabili. Ad oggi, questo strumento è stato utilizzato in un'ampia gamma di applicazioni, tra cui l'identificazione di sostanze chimiche che si legano a determinati recettori e la valutazione del potenziale di read-across per i recettori ecologici dei vertebrati con i sistemi dei mammiferi. Inoltre, due casi di studio incentrati sulla proteina di distribuzione dell'ormone tiroideo, TTR, e MOR sono descritti qui per dimostrare le nuove caratteristiche e funzionalità di SeqAPASS da v2 a v6.

Come per qualsiasi approccio computazionale, la capacità di generare previsioni della suscettibilità delle specie all'interno dello strumento SeqAPASS dipende fortemente dall'input di parametri appropriati ^8,9,13. È quindi fondamentale che, prima di condurre un'analisi, venga condotta una fase di formulazione del problema per esaminare i dati e la letteratura esistenti per l'obiettivo previsto. L'avvio di un'analisi con la conoscenza del bersaglio proteico consente all'utente di identificare i numeri di adesione proteica appropriati e le sequenze di alta qualità. Analogamente, la conoscenza di una specie sensibile o bersaglio o di organismi modello utilizzati nei saggi o nello sviluppo di AOP garantisce la selezione di una specie di interrogazione appropriata con cui vengono confrontate tutte le altre specie. La selezione dei domini funzionali per il livello 2 e dei residui di amminoacidi critici per il livello 3 sono anche passaggi critici che richiedono all'utente di identificare i parametri di input appropriati per generare previsioni. A causa di questa necessità di conoscenze preesistenti di un'interazione chimica-proteina, le versioni recenti dello strumento SeqAPASS integrano risorse user-friendly progettate per aiutare a guidare gli utenti alle informazioni rilevanti per l'avvio di una query (ad esempio, collegamenti ad altri strumenti) (Tabella 2 e Figura 2). Inoltre, messaggi informativi pop-up e avvisi sono stati integrati nello strumento per guidare l'utente attraverso l'analisi e aiutare a informare l'utente di eventuali errori che devono essere risolti.

La complessità delle interazioni chimico-biologiche presenta un limite dello strumento SeqAPASS. Quando si estrapolano dati di tossicità tra le specie, la conservazione del bersaglio molecolare è uno dei molti fattori da considerare. L'adsorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l'escrezione (ADME) di una sostanza chimica è cruciale quando si considera la tossicità chimica, poiché le sostanze chimiche possono essere attivate o disintossicate da questi processi^39,40. Altri fattori, come la via di esposizione chimica, la fase di vita dell'organismo e la storia della vita e la dieta, possono anche svolgere un ruolo importante nel determinare la sensibilità chimica tra le specie^41,42. Per affrontare questa limitazione, è importante comprendere la domanda principale che SeqAPASS pone quando si prevede la suscettibilità chimica: è probabile che il bersaglio proteico di una sostanza chimica sia presente in un'altra specie su cui la sostanza chimica possa agire? Questa domanda viene affrontata identificando i candidati ortologi e considerando la conservazione di tale bersaglio tra le specie rispetto a una specie sensibile o bersaglio nota. Queste informazioni possono essere utilizzate come linea di prova per l'estrapolazione tra specie e integrate in altri flussi di prove (ad esempio, il potenziale di esposizione) per comprendere meglio la suscettibilità delle specie ai fattori di stress chimici. Gli aggiornamenti di SeqAPASS hanno incorporato collegamenti integrati a strumenti esterni, tra cui la knowledge base US EPA^{ECOTOX 43} e l'US Fish & Wildlife Service Environmental Conservation Online System (ECOS)⁴⁴. La connessione a questi database fornisce agli utenti di SeqAPASS un facile accesso ai dati empirici sulla tossicità chimica per il confronto con le previsioni basate sulla sequenza e un mezzo per identificare le specie che potrebbero avere uno stato protetto.

Lo strumento SeqAPASS fornisce una piattaforma scientificamente fondata per le previsioni computazionali della suscettibilità intrinseca supportate da concetti di biologia evolutiva e esempi di casi che confrontano le previsioni con i risultati empirici disponibili. Inoltre, SeqAPASS è gratuito e pubblicamente disponibile su una piattaforma basata sul web ben supportata che è ampiamente accessibile (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Poiché questo strumento sfrutta i dati di sequenza e le informazioni sulle proteine dai database esistenti, la sua capacità di prevedere la suscettibilità chimica in una più ampia diversità di specie è in costante miglioramento man mano che la tecnologia di sequenziamento avanza e i genomi di nuove specie vengono sequenziati e annotati. Sebbene ciò offra vantaggi distinti per quanto riguarda la disponibilità dei dati, presenta anche una limitazione in quanto le informazioni sulle sequenze disponibili pubblicamente possono essere soggette a qualità incoerente, scarsa annotazione e incompletezza delle sequenze proteiche per alcune specie. Tuttavia, è promettente che le tecnologie e i metodi omici in bioinformatica stiano avanzando rapidamente e, pertanto, la cura e la qualità delle sequenze continueranno probabilmente a migliorare nel tempo.

Uno degli obiettivi principali dello strumento SeqAPASS è la trasparenza, fornendo accesso sotto forma di collegamenti a tutte le fonti di dati e strumenti integrati nel back-end. Tale trasparenza consente all'utente un rapido accesso alle fonti originali della sequenza o alle informazioni tassonomiche di NCBI. Il dominio di applicabilità per questo strumento è definito dalle informazioni necessarie per condurre un'analisi significativa. Poiché la conoscenza di un'interazione chimica-proteina o proteina-proteina in una specie sensibile o bersaglio nota è un elemento chiave per iniziare un'interrogazione, si deve riconoscere che le interrogazioni condotte senza queste informazioni non sono significative. Inoltre, le sostanze chimiche che hanno più bersagli biologici indefiniti o interagiscono con bersagli diversi con diversi gradi di potenza presentano anche una sfida e una limitazione dello strumento nella sua forma attuale. Si prevede che, con il miglioramento della bioinformatica, della modellazione computazionale e dello screening e della trascrittomica basati su cellule, ad alto rendimento, continuerà ad essere chiarita una maggiore conoscenza attraverso la diversità dello spazio chimico per quanto riguarda le interazioni con proteine specifiche. Si prevede che la capacità di applicare SeqAPASS a sfide più ampie di estrapolazione delle specie, relative alla comprensione del potenziale di effetti chimici avversi attraverso la diversità delle specie, continuerà a migliorare.

In conclusione, lo strumento SeqAPASS è una piattaforma accessibile che applica prontamente le informazioni molecolari per affrontare la sfida considerevole dell'estrapolazione tra specie nelle valutazioni di sicurezza chimica. Sebbene gli esempi qui evidenziati siano focalizzati sulla generazione di previsioni di suscettibilità chimica, i risultati possono anche aiutare a comprendere la conservazione complessiva dei percorsi biologici. Riunendo diverse linee di evidenza e facilitando l'accesso a più piattaforme e database, questo strumento aiuta a costruire casi trasparenti per la prioritizzazione dei test chimici e l'allocazione delle risorse. Con il continuo sviluppo delle capacità scientifiche e bioinformatiche, la potenza e l'utilità dello strumento continueranno a crescere e migliorare per soddisfare le esigenze delle comunità di ricerca e regolamentazione, riducendo al contempo le risorse necessarie per le valutazioni tra specie.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Gli autori ringraziano il Dr. Daniel L. Villeneuve (U.S. EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) e il Dr. Jon A. Doering (Department of Environmental Sciences, Louisiana State University) per aver fornito commenti su una precedente bozza del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla US Environmental Protection Agency. Le opinioni espresse in questo documento sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni o le politiche dell'Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti, né la menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali indica l'approvazione da parte del governo federale.