Preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale

Questo rapporto descrive i metodi per generare un modello di epilessia del lobo temporale basato sull'accensione elettrica di topi transgenici VGAT-Cre. I topi Kindled VGAT-Cre possono essere utili per determinare ciò che causa l'epilessia e per lo screening di nuove terapie.

È stato scoperto che l'accensione elettrica dei topi VGAT-Cre ha portato alle crisi motorie ed elettrografiche spontanee. Un recente articolo si è concentrato su come i topi VGAT-Cre unici sono stati utilizzati nello sviluppo di crisi ricorrenti spontanee (SRS) dopo l'accensione e un probabile meccanismo - l'inserimento di Cre nel gene VGAT - ha interrotto la sua espressione e ridotto il tono GABAergico. Il presente studio estende queste osservazioni a una coorte più ampia di topi, concentrandosi su questioni chiave come per quanto tempo l'SRS continua dopo l'accensione e l'effetto del sesso e dell'età dell'animale. Questo rapporto descrive i protocolli per i seguenti passaggi chiave: realizzazione di cuffie con elettrodi di profondità ippocampali per la stimolazione elettrica e per la lettura dell'elettroencefalogramma; intervento chirurgico per fissare saldamente l'auricolare sul cranio del topo in modo che non cada; e dettagli chiave del protocollo di accensione elettrica come la durata dell'impulso, la frequenza del treno, la durata del treno e la quantità di corrente iniettata. Il protocollo di accensione è robusto in quanto porta in modo affidabile all'epilessia nella maggior parte dei topi VGAT-Cre, fornendo un nuovo modello per testare nuovi farmaci antiepilettogeni.

L'epilessia è un grave disturbo neurologico con significativi oneri economici e umani. NINDS stima che ci siano 3 milioni di americani con epilessia. Circa 0,6 milioni di questi pazienti sono affetti da epilessia del lobo temporale (TLE)¹. Sfortunatamente, il trattamento medico del TLE fallisce in un terzo dei pazienti a causa dell'inefficacia, dello sviluppo di resistenza ai farmaci o dell'intolleranza agli effetti collaterali². Chiaramente, c'è una significativa necessità di sviluppare nuove terapie per TLE, una conclusione condivisa dall'American Epilepsy Society Basic Science Committee, dall'International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery e dal National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council ^3,4.

Gli attuali modelli animali di epilessia del lobo temporale utilizzano chemioconvulsivanti (ad esempio, kainato, pilocarpina) o stimolazione elettrica prolungata per indurre uno stato epilettico di lunga durata ^5,6,7. Molti animali muoiono durante la procedura (10% -30% nei ratti, fino al 90% nei topi⁸). Gli animali che sopravvivono e sviluppano l'epilessia mostrano una morte neuronale estesa in tutto il cervello ^9,10. Questa morte innesca una cascata di risposte, a partire dall'attivazione di microglia, astrociti e monociti infiltranti. Le risposte neuronali includono la riorganizzazione dei circuiti (ad esempio, la germinazione delle fibre muschiose), la nascita di nuovi neuroni che non riescono a integrarsi correttamente nei circuiti (ad esempio, cellule granulari ectopiche) e cambiamenti intrinseci che portano all'ipereccitabilità (ad esempio, sovraregolazione dei canali Na⁺). Un modello di epilessia senza morte neuronale significativa faciliterà la ricerca di nuovi farmaci antiepilettici.

Durante il test dell'ipotesi GABA dell'epilessia, è stato scoperto che il trattamento dei topi VGAT-Cre con un lieve protocollo di accensione elettrica ha portato alle crisi motorie ed elettrografiche spontanee¹¹. In generale, l'accensione elettrica dei roditori non porta a convulsioni spontanee che definiscono l'epilessia, sebbene possa, in caso di eccesso di accensione¹¹. I topi VGAT-Cre esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del gene trasportatore vescicolare GABA (VGAT), che è specificamente espresso nei neuroni inibitori GABAergici. È stato riscontrato che l'inserimento di Cre ha interrotto l'espressione di VGAT a livello di mRNA e proteine, compromettendo così la trasmissione sinaptica GABAergica nell'ippocampo. Si è concluso che i topi VGAT-Cre accesi potrebbero essere utili per studiare i meccanismi coinvolti nell'epilettogenesi e per lo screening di nuove terapie¹¹. Il presente rapporto fornisce in dettaglio i metodi utilizzati per generare il modello.

L'uso degli animali ha seguito le linee guida ARRIVE¹² ed è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia.

1. Realizzazione di cuffie con due elettrodi bipolari (Figura 1)

Figura 1: Passaggi chiave nella fabbricazione delle cuffie EEG. (A) Aspetto degli elettrodi nelle varie fasi del protocollo (numeri nella fase di corrispondenza sinistra). (B) Un'immagine del prodotto finale montata in un supporto fatto in casa che si adatta al telaio stereotassico. Nota, il supporto termina con un gruppo di perni del collare che si inserisce nel piedistallo dell'auricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Tagliare 3,5 cm di filo di acciaio inossidabile rivestito in politetrafluoroetilene.
2. Rimuovere circa 1 mm del rivestimento isolante dal filo su entrambe le estremità. Non avere troppo filo sverniciato.
3. Metti due perni su un portamorsa con la parte inferiore del perno che ha una fessura più lunga rivolta verso il basso.
4. Applicare il flusso sulle estremità spogliate del filo e sulla parte superiore dei perni.
5. Tappare la parte spogliata del filo con una saldatura sufficiente per rivestirla.
6. Aggiungere una quantità minima di saldatura alla parte superiore del perno senza traboccare sui lati.
7. Posizionare un'estremità delle estremità spogliate del filo nel perno il più profondo possibile mentre la saldatura viene fusa.
   NOTA: C'è un foro laterale dove il filo può uscire - non lasciare che il filo esca dal perno. Tutto il filo strappato deve rimanere all'interno del perno.
8. Ripetere i passaggi 1.6-1.7 per il secondo perno, ora con le altre estremità spogliate del filo.
9. Lasciare riposare i perni per 30 secondi per impostarli, rimuoverli dal supporto della morsa, quindi tirarli per assicurarsi che la connessione tra il filo e i perni sia forte e tiene.
10. Risciacquare i perni in acqua fredda e quindi asciugare.
11. Verificare la conduttanza tra il pin 1 e il pin 2 utilizzando un ohmmetro.
12. Portare i perni alle estremità del filo insieme; Tienili paralleli e vicini. Morsetti un emostatico al centro del filo. Quindi, ruotare l'emostato, in modo che il filo si attorcigli su se stesso abbastanza stretto. Rimuovere l'emostato.
13. Bloccare una pinza sul filo intrecciato 2 mm sotto i perni e piegare il filo a 90°.
14. Spingere nuovamente lo stesso filo di 90° indietro sopra la pinza creando un'altra curva a 1 mm dalla prima.
15. Tagliare il filo intrecciato con un angolo di 45° sotto la curva a 3,5 mm con piccole forbici affilate.
16. Preparare due di questi elettrodi bipolari (a doppio perno intrecciato) per ogni auricolare (opzionale, il secondo è il backup in caso di problemi elettrici con il primo).
17. Preparare un singolo elettrodo di riferimento tagliando in due un filo con perni saldati su entrambe le estremità (passaggi 1.1-1.17, Figura 1A).
18. Tagliare il filo a 7 mm.
19. Piegare l'estremità 1 mm sotto la punta.
20. Quindi, coprire la punta piegata di 1 mm del filo con una pinza e ruotare il filo stretto attorno alla pinza per creare un piccolo anello (1 mm di diametro).
21. Piegare l'anello perpendicolarmente alla parte diritta del filo per far sì che la punta del filo riguardi verso l'esterno.
22. Assemblare i due elettrodi bipolari e il singolo elettrodo di riferimento nel piedistallo a sei pin in modo che gli elettrodi bipolari siano affiancati con una distanza di 6 mm tra loro e che l'elettrodo di riferimento sia posizionato nel foro esterno centrale (Figura 1B).
    NOTA: Un metodo alternativo consiste nell'impiantare gli elettrodi, cementarli in posizione e quindi inserire i loro perni nel piedistallo.

2. Impianto di elettrodi stereotassici

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e l'assemblaggio dell'elettrodo a sei pin mediante autoclave prima dell'intervento. Durante l'intervento chirurgico deve essere mantenuto un campo chirurgico sterile e devono essere utilizzati guanti chirurgici sterili. Si raccomandano teli sterili (ad esempio, Press n' Seal) per coprire l'animale ad eccezione dell'area chirurgica.
2. Utilizzare topi VGAT-Cre di 8 settimane (di età corrispondente, sia maschi che femmine) per interventi chirurgici 4 settimane dopo lo svezzamento. Registrare il peso dell'animale prima dell'intervento chirurgico per consentire la misurazione della perdita di peso post-chirurgica.
3. Utilizza un vaporizzatore a isoflurano certificato o un sistema di anestesia a basso flusso dotato di una pompa a siringa di precisione, vaporizzatore digitale integrato e termoforo di feedback.
   NOTA: I sistemi a basso flusso sono in grado di erogare l'anestesia a basse portate proporzionate alle dimensioni dell'animale in una camera a induzione o attraverso un cono nasale sul telaio stereotassico (70 ml / min, la concentrazione di isoflurano nell'aria è del 4% per l'induzione e del 2% per la chirurgia). L'uso di meno anestesia non solo avvantaggia l'animale durante gli interventi chirurgici, ma riduce anche il rischio di esposizione del personale di laboratorio all'isoflurano.
4. Posizionare l'animale anestetizzato su un tampone riscaldato a 37 °C per mantenerlo caldo durante l'intervento chirurgico. Se si utilizza un sistema di temperatura controllato da feedback, inserire la sonda di temperatura leggermente lubrificata nel retto dell'animale per il monitoraggio della temperatura durante l'intervento chirurgico.
5. Montare l'animale sul telaio stereotassico posizionando delicatamente le barre auricolari nelle orecchie e i denti superiori anteriori nella barra incisiva. Posizionare il cono del naso sopra il naso per una corretta erogazione dell'anestesia. Assicurarsi che la testa sia livellata e centrata e non possa essere spostata quando leggermente sondata.
6. Iniettare per via sottocutanea 0,5 ml di normosol per l'idratazione.
7. Applicare lubrificante oculare per prevenire l'essiccazione corneale.
8. Monitorare la profondità dell'anestesia dall'assenza del riflesso di ritiro dopo aver pizzicato un dito posteriore, quindi ridurre l'isoflurano all'1,5% -2,0% durante l'intervento chirurgico.
9. Rimuovere i peli in corrispondenza e intorno all'area chirurgica strappando o utilizzando tagliacapelli (rasatura) o crema depilatoria e disinfettare la pelle con tre cicli di applicazione alternata di iodio ed etanolo, finendo con iodio. La rimozione dei peli dal sito chirurgico è raccomandata solo se ci sono mezzi per mantenere l'anestesia in quella posizione. Se necessario, utilizzare applicatori di punta di cotone imbevuti di alcol per rimuovere i peli dall'area circostante la testa. Iniettare 0,05 mL di bupivacaina analgesica locale (0,25%) per via sottocutanea.
10. Fai un'incisione sul cranio usando un bisturi, quindi ritaglia una parte della pelle con forbici chirurgiche affilate, esponendo il cranio. Spingendo la pelle da parte, usando un batuffolo di cotone, pulire il cranio da tutti i muscoli e i tessuti sottostanti che ostruiscono la vista.
    NOTA: Per fermare l'emorragia accidentale, applicare pressione sul sito di sanguinamento con un batuffolo di cotone sterile fino a quando non si ferma.
11. Pulire il cranio con perossido di idrogeno usando tamponi di cotone sterili per rendere visibili le suture del cranio e sia il bregma che la lambda.
12. Asciugare accuratamente il cranio, quindi applicare una goccia di adesivo dentale autoincisivo utilizzando il suo applicatore. Spazzolarlo nel cranio, attendere 60 secondi e curare con una luce UV dentale per 40 secondi. Una superficie lucida indica che l'adesivo è stato efficacemente reticolato con il cranio.
    NOTA: questo passaggio è fondamentale per il fissaggio sicuro dell'auricolare.
13. Utilizzare una punta da 0,031" (0,79 mm) per praticare bilateralmente due fori di bava per l'impianto di elettrodi di profondità dell'ippocampo (circa 5.000 giri/min). Praticare un foro di bava extra per l'elettrodo di riferimento sopra il cervelletto dietro la lambda.
    NOTA: Durante la perforazione, fare attenzione ad abbassare lentamente il trapano ed evitare di perforare il cervello.
14. Le coordinate per gli elettrodi sono le seguenti (da bregma in mm): elettrodi ippocampali a 3 mm posterior, 3 mm lateralmente e 3 mm di profondità; ed elettrodo cerebellare di riferimento a 6 mm posteriormente, 0 mm lateralmente e 0 mm di profondità (subdurale).
15. Per aumentare la precisione, utilizzare un trapano montato stereotassicamente, azzerare il manipolatore stereotassico dell'asse X / Y quando si tocca bregma - questo è il punto di riferimento per le coordinate.
16. Assemblare una cuffia inserendo tutti gli elettrodi nel piedistallo a sei pin, assicurandosi che i perni siano spinti fino in fondo nel piedistallo. Montare il piedistallo nel supporto dell'elettrodo su un telaio stereotassico (Figura 1B).
17. Allineare gli elettrodi sopra i fori di bava corrispondenti. Impiantare stereotassicamente elettrodi bipolari intrecciati in filo di acciaio inossidabile nell'ippocampo destro e sinistro e nell'elettrodo di riferimento nel cervelletto abbassando lentamente l'auricolare e guidando gli elettrodi nei fori di bava.
18. Quando l'elettrodo di torsione ippocampale si trova proprio sopra il foro, azzerare l'asse Z e abbassarsi lentamente fino a -3,0 mm.
19. Coprire la superficie del cranio e gli elettrodi con cemento dentale e riempire lo spazio tra la superficie del cranio e il fondo del piedistallo. I bordi della pelle saranno adiacenti al cemento dentale in modo tale che nessun tessuto sottostante rimanga esposto. Attendere che il cemento si asciughi e si indurisca. Quindi staccare il supporto dell'elettrodo dal braccio stereotassico e rimuovere il supporto dal piedistallo.
20. Iniettare 0,1 mL di ketoprofene (1 mg/mL, SC) per l'analgesia e una seconda dose di 0,5 mL di normosol (SC) per l'idratazione e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.
21. Posizionare un tampone isotermico preriscaldato a 37 °C all'interno di una gabbia vuota coperta da un tovagliolo di carta. Una volta che è completamente sveglio, metti l'animale in una gabbia pulita con lettiere e cibo morbido e restituiscilo al vivaio. Gli animali sono alloggiati singolarmente da questo punto in poi per evitare di masticare le cuffie l'uno dell'altro. Le tramogge della barra metallica non vengono utilizzate per evitare che le cuffie si blocchino e, invece, le bottiglie d'acqua sono legate alla parte inferiore delle cime della gabbia e il chow è presente nella biancheria da letto.
22. Dai da mangiare all'animale del cibo morbido per 72 ore dopo l'intervento chirurgico e monitora la perdita di peso e il punteggio delle condizioni corporee. Agli animali disidratati possono essere somministrati 0,5 ml di normosol per via sottocutanea se disidratati (perdita di peso, aumento del turgore cutaneo, occhi infossati). Ketoprofene può essere somministrato per via sottocutanea una volta al giorno per altri 2 giorni dopo l'intervento chirurgico (seguire il regime di analgesia secondo le linee guida IACUC locali). Consentire agli animali di riprendersi completamente nelle loro gabbie per 4-7 giorni prima di essere trasferiti al sistema di registrazione EEG.

3. Protocollo di accensione elettrica

1. Collegare i mouse al sistema di registrazione EEG utilizzando un cavo flessibile che si adatta alle prese sulla testa del mouse e sul commutatore (vedere l'elenco dei materiali ). Lasciare che gli animali si acclimatino per un giorno prima di procedere con il protocollo di stimolazione elettrica riportato di seguito. Monitorare la loro salute generale e l'acclimatazione su base giornaliera e rimuoverli dal sistema quando ci sono segni di malattia, angoscia e / o perdita di peso corporeo continua superiore al 25%
2. Collegare entrambi i cavi dall'elettrodo stimolante all'uscita di uno stimolatore a corrente costante.
   NOTA: È molto utile avere un circuito stampato che commuta questi elettrodi lontano dal registratore EEG e allo stimolatore.
3. Impostare lo stimolatore in modo da erogare impulsi di 1 ms a 50 Hz per una durata del treno di 2 s.
4. Impostare l'uscita dello stimolatore a 20 microampere (μA) ed erogare il 1^{° impulso} .
5. Monitorare l'EEG per una caratteristica post-scarica di picchi ad alta frequenza che durano più a lungo dell'impulso di stimolazione elettrica.
6. Se non si osserva alcuna scarica, aumentare la quantità di corrente iniettata con incrementi di 20 μA fino a quando non viene attivata una scarica post-scarica. La quantità di corrente richiesta è la soglia di post-scarica (ADT).
7. Gli ADT tipici sono 20-50 μA. Se non si osserva alcuna scarica anche dopo l'aumento a 200 μA, è necessario risolvere i problemi dei collegamenti elettrici e del cablaggio delle cuffie con un ohmmetro ad alta sensibilità. Se il problema è nell'elettrodo stimolante, prova a stimolare con gli altri elettrodi di profondità.
8. Gli animali vengono accesi stimolando 2 volte o 6 volte al giorno utilizzando una corrente che è 1,5 volte il valore ADT per quel mouse.
9. Monitorare la risposta comportamentale alla stimolazione, che sale dal cambiamento di stato alle crisi tonico-cloniche bilaterali con caduta. Punteggio utilizzando un sistema di classi Racine modificato¹¹. Per evitare convulsioni toniche fatali evocate, l'accensione dovrebbe essere interrotta se stimoli successivi portano a un aumento della gravità e della durata delle convulsioni fino al punteggio Racine modificato 6 (corsa e salto)

Animali
Il modello è stato originariamente sviluppato utilizzando topi VGAT-Cre (Slc32a1^tm2(cre)Lowl/J)¹³ su sfondo misto. Tuttavia, è stato applicato anche al ceppo VGAT-Cre che è congenito con C57BL / 6J. Nessuna differenza è stata osservata nell'epilessia che si sviluppa tra i ceppi. Entrambi i ceppi esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore del trasportatore vescicolare GABA. Questi topi sono stati generati bussando in una cassetta IRES-Cre dopo il codone di arresto nel gene Vgat . Questi topi si riproducono normalmente, quindi sono mantenuti come omozigoti. Per prevenire la deriva genetica della colonia, acquista allevatori e usa solo topi di generazione F1 per esperimenti. Tutti i topi sono stati ospitati in un vivaio accreditato AAALAC. Ai topi è stato dato libero accesso a cibo e acqua, cicli luce/buio di 12 ore e un ambiente arricchito. Per la registrazione elettroencefalografica (EEG), i topi sono stati alloggiati individualmente in gabbie di plastica trasparente (fatte in casa), consentendo il monitoraggio video simultaneo. Usa topi maschi e femmine per gli esperimenti. Non è stata osservata alcuna differenza in termini di tasso di accensione o frequenza delle crisi tra i sessi. La maggior parte di questi studi ha utilizzato topi di 8 settimane al momento della chirurgia dell'auricolare. Tuttavia, si possono anche usare topi che hanno tra 4-20 settimane. A 4 settimane, il cranio del topo è ~ 90% della sua dimensione finale¹⁴, quindi l'apposizione di un auricolare ha un effetto minimo sulla crescita. Il tempo tra l'intervento chirurgico e l'inizio del protocollo di accensione non è critico, anche se i topi devono essere osservati attentamente durante il recupero dall'intervento chirurgico per 72 ore.

Parametri di accensione
Il protocollo di stimolazione elettrica è stato sviluppato da Lothman e collaboratori e descritto in dettaglio nel^{loro articolo} 15 del 1989. In breve, l'elettrodo ippocampale è collegato a uno stimolatore a corrente costante e un impulso bifasico a onda quadra di 1 ms viene erogato a 50 Hz su 2 s. Sono stati testati vari parametri del protocollo di accensione¹⁶. Utilizzare un'intensità di corrente pari a 1,5 volte la quantità minima di corrente richiesta per innescare un attacco elettrografico per quel mouse (soglia post-scarica, ADT). I topi vengono stimolati elettricamente due volte al giorno a giorni alterni (2x, metà mattina e primo pomeriggio). La figura 2A mostra una panoramica del protocollo di accensione e delle proprietà chiave di sequestro. Tuttavia, è efficace anche un protocollo di accensione rapida, qui i topi vengono stimolati sei volte al giorno a giorni alterni (6x, un'ora tra le stimolazioni). È interessante notare che i tassi di accensione sono simili tra i protocolli 2x e 6x in termini di numero di stimolazioni necessarie per raggiungere lo stato di accensione (Figura 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, media ± SEM, P = 0,3). I topi sono considerati completamente accesi quando un totale di cinque stimolazioni evocano crisi tonico-cloniche con perdita di controllo posturale, che è un punteggio comportamentale di 5 su una scala Racine modificata¹⁷. L'accensione oltre questo livello, la cosiddetta over-kindling, può essere eseguita, ma comporta il rischio di un attacco tonico fatale o SUDEP¹⁸. La mortalità in questo protocollo VGAT-Cre è ~ 13% (15 su 119 topi); Ciò include topi di entrambi i sessi che sono morti dopo convulsioni evocate o spontanee (8 maschi, 7 femmine).

Proprietà convulsive
Il sistema di registrazione utilizzato in questi studi è stato interrotto. I fornitori alternativi di configurazioni di registrazione EEG in uso presso l'unità di monitoraggio dell'epilessia dei roditori dell'Università della Virginia sono forniti nella tabella dei materiali. La figura 2A mostra una panoramica del protocollo di accensione e delle proprietà chiave di sequestro.

Figura 2: Proprietà convulsive dei topi VGAT-Cre accesi. (A) Diagramma schematico del corso temporale di un esperimento. (B) La distribuzione del numero di stimolazioni elettriche necessarie per raggiungere lo stato completamente acceso. Lo stato acceso si ottiene quando le stimolazioni evocano cinque crisi motorie tonico-cloniche bilaterali. (C) La distribuzione della latenza al primo attacco spontaneo dopo l'ultima stimolazione elettrica. (D) La distribuzione della frequenza delle crisi osservate, che è calcolata come il numero totale di crisi diviso per il numero di giorni registrati. (E) La distribuzione di quanto tempo i topi sono stati epilettici come definito da crisi spontanee che si verificano con un intervallo inter-crisi inferiore a 5 giorni. Tutti i grafici utilizzano grafici a violino in cui la mediana è mostrata con una linea scura e il 25 ° e 75^° quartile sono mostrati con linee chiare. Il numero di animali in ogni trama è mostrato sull'asse X. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I topi VGAT-Cre raggiungono tipicamente il criterio dello stato acceso dopo 15 stimolazioni (protocolli aggregati 2x e 6x, media ± SD di 7,4 stimolazioni, Figura 2B). Come si può vedere dalla trama a violino dei dati, molti animali richiedono meno stimoli (10) e molti richiedono di più (18). Non è stato possibile trovare un fattore che determini la differenza, escludendo sesso, età, valore ADT o posizionamento degli elettrodi. Entro poche settimane dall'accensione, la maggior parte dei topi sviluppa convulsioni spontanee multiple (90%), che definisce l'epilessia. La latenza alle crisi ricorrenti spontanee (SRS) è di 10,7 ± 6,3 giorni (Figura 2C). Una frazione dei topi sviluppa SRS prima di raggiungere lo stato acceso. Come notato in precedenza¹¹, i topi VGAT-Cre non sono spontaneamente epilettici e richiedono una stimolazione elettrica per sviluppare l'epilessia. Una volta iniziate le convulsioni, si verificano con una frequenza di 1,3 ± 0,6 convulsioni al giorno (Figura 2D). Tutte le crisi elettrografiche sono accompagnate da crisi motorie tonico-cloniche. Gli studi iniziali erano a breve termine (la frequenza delle crisi spontanee misurata 1-2 settimane), ma quando il periodo di registrazione è stato esteso si è scoperto che la frequenza delle crisi diminuiva con il tempo. Utilizzando un cut-off arbitrario di 5 giorni consecutivi senza un attacco, si verificano convulsioni affidabili per 23 ± 11 giorni. Nel loro insieme, questo definisce il periodo in cui i topi VGAT-Cre sono utili per le campagne di screening dei farmaci. L'analisi della potenza utilizzando queste SD e una dimensione dell'effetto di riduzione del 50% mostra che sono necessari 16 topi per gruppo per effetti statisticamente significativi sulle stimolazioni all'accensione, sulla frequenza delle crisi e sulla durata dell'epilessia.

Una caratteristica del modello VGAT-Cre acceso che lo distingue dai modelli epilettici post-stato è l'assenza di morte neuronale. Questo è stato analizzato utilizzando due metodi accettati (Figura 3): uno, contando i nuclei nello strato CA1 colorati con anticorpo anti-NeuN; e due, misurando la quantità di colorazione Fluoro-Jade C nei sottocampi ippocampali che sono vulnerabili alla morte cellulare indotta da chemioconvulsivanti (dentato, CA1 e corteccia entorinale).

Figura 3: Morte neuronale come saggiata mediante colorazione anti-NeuN o colorazione Fluoro-Jade C . (A) Grafico di neuroni anti-NeuN-positivi in vari sottocampi dell'ippocampo e della corteccia entorinale. Le abbreviazioni sono le seguenti: DGC, strato di cellule granulari dentate; hilus si riferisce all'ilo dentato, CA1, cornus ammonis strato piramidale I; e EC, corteccia entorinale; L2, strato 2; e L3, strato 3. Due fette orizzontali di cervello corrispondenti a -4 mm sotto il bregma sono state colorate da ciascun animale (topi naïve di controllo, n = 7; epilettico VGAT-Cre, n = 13; vedi Straub et al. per i dettagli¹¹). I dati sono stati normalizzati alla conta neuronale media determinata nei topi VGAT-Cre naïve nel rispettivo sottocampo. Immagini della colorazione Fluoro-Jade C da un topo epilettico VGAT-Cre (B) e da un ratto post-stato (C) (modello Li/pilocarpina, vedi Dey et al. per dettagli e analisi¹⁰). L'analisi della colorazione Fluoro-Jade C dei topi VGAT-Cre è stata presentata in Straub et ^al.11). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Questo rapporto descrive un protocollo in cui l'accensione elettrica dei topi porta all'epilessia. Poiché l'elettrodo stimolante è posizionato nell'ippocampo, questa è un'epilessia limbica focale che modella l'epilessia del lobo temporale (TLE) nei pazienti. Un passo fondamentale in questo protocollo è quello di utilizzare topi VGAT-Cre, che a causa dell'inserimento di una cassetta di ricombinasi IRES-Cre nel gene Vgat , mostra alterate correnti inibitorie GABA¹¹. C57BL / 6 non sviluppano l'epilessia dopo l'accensione con questo protocollo, anche se è possibile che altri ceppi di topi lo facciano.

Il protocollo è stato sviluppato utilizzando il posizionamento degli elettrodi di profondità stimolanti nell'ippocampo. Le coordinate hanno fornito al bersaglio le proiezioni del percorso perforante dalla corteccia entorinale quando entrano nel sottocampo CA1. Il campo elettrico indotto dalla stimolazione elettrica non è stato definito, quindi la posizione precisa degli elettrodi non è critica. In effetti, i roditori possono essere accesi elettricamente ovunque nel circuito limbico, ad esempio l'amigdala e la corteccia piriforme¹⁹. I seguenti sono passaggi critici nel protocollo: uno, corretta saldatura delle cuffie EEG per garantire una bassa resistenza alla corrente stimolante; due, utilizzando un adesivo dentale che è in uso nelle cliniche dentali per legarsi al cranio e fornire una superficie per l'adesione del cemento dentale; e tre, l'uso di un amplificatore a corrente costante per fornire gli impulsi elettrici descritti.

La risoluzione dei problemi è in genere limitata al controllo dei collegamenti elettrici, che includono i collegamenti nell'auricolare, l'auricolare al cavo, il cavo al commutatore e il commutatore al dispositivo di registrazione. L'utilizzo di un ohmmetro ad alta sensibilità è fondamentale.

Le limitazioni alla tecnica includono il requisito di competenze e attrezzature appropriate per eseguire gli interventi chirurgici e registrare l'EEG.

Un vantaggio del modello rispetto ai modelli animali esistenti di TLE è che c'è una morte minima dei neuroni¹¹. Gli altri modelli di TLE sono modelli epilettici post-stato, che innescano la morte neuronale estesa¹⁰. Questa morte porta ad un'ampia attivazione di microglia, astrociti e infiltrazione da parte dei monociti circolanti. Presi insieme, diventa difficile distinguere i meccanismi che causano l'epilessia dai meccanismi innescati dallo stato epilettico prolungato. Si prevede che i topi VGAT-Cre accesi saranno utili per lo sviluppo di nuove terapie che sono sia anti-sequestro che anti-epilettiche. Questo rapporto fornisce metriche chiave e analisi della potenza che possono guidare i futuri sforzi di sviluppo di farmaci utilizzando questi topi.

Un altro vantaggio del modello VGAT-Cre acceso è l'alta percentuale di animali che sviluppano epilessia (90%) e la regolarità delle crisi spontanee. Gli svantaggi del modello sono una frequenza di crisi relativamente bassa (1,5 / giorno) e che la frequenza delle crisi diminuisce dopo 3 settimane, e in alcuni casi le crisi sembrano fermarsi. Sono in corso sforzi per affrontare questi problemi.

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Gli autori ringraziano John Williamson per le utili discussioni su questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH/NINDS NS112549.