Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

Qui descritto è un protocollo per la determinazione di quattro diversi metaboliti del triptofano generati nella via della cinurenina (cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido xanturenico, acido 3-idrossiantranilico) nel mezzo raccolto dalle colture cellulari tumorali analizzate dalla cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo.

La via della cinurenina e i cataboliti di triptofano chiamati kynurenine hanno ricevuto una maggiore attenzione per il loro coinvolgimento nella regolazione immunitaria e nella biologia del cancro. Un saggio di coltura cellulare in vitro viene spesso utilizzato per conoscere il contributo di diversi cataboliti di triptofano in un meccanismo di malattia e per testare strategie terapeutiche. Il mezzo di coltura cellulare ricco di metaboliti secreti e molecole di segnalazione riflette lo stato del metabolismo del triptofano e di altri eventi cellulari. Si desidera nuovi protocolli per la quantificazione affidabile di più cinurenine nel mezzo di coltura cellulare complesso per consentire un'analisi affidabile e rapida di più campioni. Questo può essere realizzato con cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa. Questa potente tecnica è utilizzata in molti laboratori clinici e di ricerca per la quantificazione dei metaboliti e può essere utilizzata per misurare le cinurenine.

Qui è presentato l'uso della cromatografia liquida accoppiata con una singola spettrometria di massa quadrupolo (LC-SQ) per la determinazione simultanea di quattro cinurenine, cioè cinurenina, 3-idrossichinurenina, acido 3-idrossiantranilico e xantiurenico nel mezzo raccolto da cellule tumorali coltivate in vitro. Il rilevatore SQ è semplice da usare e meno costoso rispetto ad altri spettrometri di massa. Nell'analisi SQ-MS, più ioni del campione vengono generati e separati in base al loro specifico rapporto massa-carica (m/z), seguito dal rilevamento utilizzando una modalità SIM (Single Ion Monitoring).

Questo documento richiama l'attenzione sui vantaggi del metodo riportato e indica alcuni punti deboli. Si concentra su elementi critici dell'analisi LC-SQ, inclusa la preparazione del campione insieme alla cromatografia e all'analisi della spettrometria di massa. Vengono inoltre discussi il controllo di qualità, le condizioni di calibrazione del metodo e i problemi relativi agli effetti della matrice. Abbiamo descritto una semplice applicazione della 3-nitrotirosina come uno standard analogico per tutti gli aaliti bersaglio. Come confermato da esperimenti con ovaie umane e cellule tumorali del seno, il metodo LC-SQ proposto genera risultati affidabili e può essere ulteriormente applicato ad altri modelli cellulari in vitro.

La via della kynurenina (KP) è la principale via del catabolismo triptofano (Trp) nelle cellule umane. L'indoloammina-2,3-diossigenasi (IDO-1) nelle cellule extraepatiche è il primo e limitante enzima di KP e converte il Trp in N-formilchinurenina¹. Ulteriori passaggi all'interno di KP generano altri metaboliti secondari, vale a dire le cinurenine che mostrano varie proprietà biologiche. La cinurenina (Kyn) è il primo catabolita Trp stabile che mostra proprietà tossiche e regola gli eventi cellulari dopo il legame con il recettore degli idrocarburi arilici (AhR)². Successivamente, Kyn viene trasformato in diverse molecole spontaneamente o nei processi mediati dall'enzima, generando tali metaboliti come 3-idrossichinurenina (3HKyn), acido antranilico (AA), acido 3-idrossiantranilico (3-HAA), acido cinurenico (Kyna) e acido xanturenico (XA). Un altro metabolita a valle, 2-ammino-3-acido carbossimuconico-6-semialdeide (ACMS), subisce ciclizzazione non enzimatica in acido čolinico (QA) o acido picolinico (PA)¹. Infine, il QA viene ulteriormente trasformato in nicotinammide-adenina dinucleotide (NAD⁺)³, il metabolita del punto finale KP che è un importante cofattore enzimatico. Alcune kynurenine hanno proprietà neuroprotettive come Kyna e PA, mentre le altre, cioè 3HAA e 3HKyn, sono tossiche⁴. L'acido xantinonico, che si forma da 3HKyn, presenta proprietà antiossidanti e vasorelaxation⁵. XA si accumula nelle lenti che invecchiano e porta all'apoptosi delle cellule epiteliali⁶. KP, descritto a metà del XX secolo, ha^guadagnato maggiore attenzione quando è stato dimostrato il suo coinvolgimento in vari disturbi. L'aumento dell'attività di questa via metabolica e l'accumulo di alcune cinurenine modulano la risposta immunitaria e sono associate a diverse condizioni patologiche come depressione, schizofrenia, encefalopatia, HIV, demenza, sclerosi laterale amiotrofica, malaria, Alzheimer, malattia di Huntington e cancro^4,7. Alcuni cambiamenti nel metabolismo Trp si osservano nei microambientati tumorali e nelle^{cellule tumorali 2,8}. Inoltre, le cinurenine sono considerate marcatori di malattia promettenti⁹. Nella ricerca sul cancro, i modelli di coltura cellulare in vitro sono ben consolidati e ampiamente utilizzati per la valutazione preclinica delle risposte ai farmaci anticancro¹⁰. I metaboliti Trp sono secreti dalle cellule nel mezzo di coltura e possono essere misurati per valutare lo stato della via della cinurenina. Pertanto, è necessario sviluppare metodi appropriati per il rilevamento simultaneo del maggior numero possibile di metaboliti KP in una varietà di campioni biologici con un protocollo facile, flessibile e affidabile.

In questo articolo, descriviamo un protocollo per la determinazione simultanea di quattro metaboliti della via della cinurenina: Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA da LC-SQ in un mezzo post-coltura raccolto dalle cellule tumorali. In un moderno approccio analitico, la cromatografia^{liquida 13,14,15,16} è preferita per il rilevamento simultaneo e la quantificazione dei singoli cataboliti di triptofano, a differenza dei saggi biochimici non specifici che utilizzano il reagente di Ehrlich^11,12. Attualmente, ci sono molti metodi disponibili per la determinazione delle cinurenine in campioni umani, principalmente basati sulla cromatografia liquida con rivelatori ultravioletti o a fluorescenza^13,17,18,19. La cromatografia liquida accoppiata con un rivelatore di spettrometria di massa (LC-MS) sembra più adatta per questo tipo di analisi, a causa della loro maggiore sensibilità (limiti inferiori di rilevamento), selettività e ripetibilità.

I metaboliti Trp sono già stati determinati nel siero umano, plasma e urina^{13,20,21,22,23}, tuttavia, sono desiderati anche i metodi per altri campioni biologici, come il mezzo di coltura cellulare. In precedenza, l'LC-MS era usato per composti derivati dal Trp in un mezzo raccolto dopo la coltura di cellule di glioma umano, monociti, cellule dendritiche o astrociti trattati con gamma di interferone (IFN-γ)^24,25,26. Attualmente, sono necessari nuovi protocolli convalidati che possono consentire una valutazione di diversi metaboliti in diversi mezzi di coltura, cellule e trattamenti utilizzati nei modelli di cancro.

Lo scopo del metodo sviluppato è quello di quantificare (all'interno di una serie analitica) quattro principali cinurenine che possono indicare anomalie in KP. Ecco le fasi critiche del nostro protocollo recentemente pubblicato per l'analisi quantitativa LC-SQ di alcune cinurenine significative selezionate utilizzando uno standard interno (3-nitrotirosina, 3NT) nel mezzo raccolto da cellule tumorali umane coltivate in vitro ²⁷. Per quanto ne siamo a conoscenza, è il primo protocollo LC-SQ per la quantificazione simultanea di 3HKyn, 3HAA, Kyn e XA in un mezzo di coltura ottenuto dalle cellule coltivate in vitro. Dopo alcune modifiche, il metodo potrebbe essere ulteriormente applicato per studiare i cambiamenti nel metabolismo Trp in una gamma più ampia di modelli di coltura cellulare.

1. Preparazione di soluzioni standard standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA standard stock

1. Pesare i reagenti in una fiala con la massima precisione (0,3 mg ciascuno). Per una migliore precisione, scalare i reagenti, regolando il volume del solvente in base al passaggio 1.2.
2. Sciogliere i reagenti in 300 μL del solvente per ottenere una soluzione stock di 1 g/L. Sciogliere 3NT in acido formico 1% (v/v) (FA) in acqua; Kyn, 3HAA e XA in solfossido di dimetile (DMSO); 3HChin in acqua acidificata a pH 2,5 con acido cloridrico (HCl).
   ATTENZIONE: 3HAA irrita occhi, naso, gola e polmoni. È dannoso se inalato, a contatto con la pelle e se ingerito. Indossare una protezione appropriata, ad esempio guanti e maschera.
3. Chiudere saldamente il flaconcino e posizionarlo in un bagno ad ultrasuoni per 1 minuto per accelerare la dissoluzione.
   NOTA: Conservare le soluzioni stock a -20 °C e ridurre al minimo il congelamento/scongelamento (3 cicli al massimo) a causa dell'instabilità delle soluzioni stock.

2. Preparazione del mezzo di coltura trattato a carbone

1. In un tubo pesare 280 mg di carbone attivo e aggiungere 5 ml del mezzo liquido preparato per coltivare le cellule di interesse.
2. Agitare il tubo con il supporto e il carbone su un rocker a sega trasparente per 2 ore, a temperatura ambiente (impostare la velocità su 50 oscillazioni / min). Quindi, centrifugare i tubi a 6000 x g per 15 minuti.
3. Rimuovere il tubo dalla centrifuga e raccogliere con cura il supernatante senza disturbare il sedimento. Ripetere la centrifugazione, se necessario, per rimuovere tutti i residui di carbone.
4. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro siringa da 0,45 μm.
5. Assicurarsi che il mezzo di coltura pretrattato a carbone sia privato delle tracce di cinurenine eseguendo un campione pilota su LC-MS come descritto al passaggio 6.3.2. In caso contrario, ripetere i passaggi 2.1-2.4.
   NOTA: Se il mezzo di coltura completo inizialmente non contiene cinurenine, la fase di purificazione con carbone potrebbe essere omessa. In questo caso, preparare standard di calibrazione e campioni di controllo qualità utilizzando il mezzo completo solitamente preparato per la coltivazione cellulare.
6. Conservare il mezzo preparato a 4 °C fino all'analisi.

3. Realizzare le soluzioni di calibrazione e le curve di calibrazione

1. A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e aggiungere quattro standard (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) almeno a sei diverse concentrazioni per coprire gli intervalli di calibrazione. Mantenere il volume finale di ciascun campione a 150 μL. Utilizzare tubi di centrifuga da 1,5 ml per la preparazione del campione.
   NOTA: Punti di calibrazione suggeriti per 3HKyn: 0,018, 0,045, 0,22, 1,12, 2,23, 4,46 μmol/L; per Kyn: 0,0096, 0,048, 0,24, 1,20, 2,40, 3,84 μmol/L; per 3HAA: 0,033, 0,16, 0,65, 3,27, 6,53, 13,06 μmol/L; per XA: 0,019, 0,13, 0,49, 1,22, 3,65, 4,87 μmol/L.
2. Aggiungere 150 μL di metanolo freddo (mantenuto a -20 °C) contenente l'1% (v/v) di acido formico in ciascun tubo per la deproteinizzazione del campione. Chiudere saldamente bene i tubi e il vortice.
3. Incubare i campioni a -20 °C per 40 min.
4. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Rimuovere i tubi dalla centrifuga. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il sedimento.
5. Trasferire 270 μL del supernatante nel flaconcino di vetro utilizzando una pipetta automatica. Mettere le fiale nell'evaporatore ed evaporare delicatamente fino a quando non si asciuga. Utilizzare il programma appropriato per le frazioni acqua/metanolo per evaporare i componenti volatili. Non applicare temperature superiori a 40 °C ed evitare un'asciugatura troppo.
   NOTA: Le fiale di vetro a fondo piano, cioè le fiale cromatografiche facilitano un'evaporazione più rapida e recuperi più elevati rispetto ai tubi conici in plastica.
6. Dopo 30 minuti, controllare lo stato di evaporazione. Se necessario, continuare l'evaporazione (ad esempio, aggiungere altri 10 minuti). Evitare un'asciugatura troppo.
7. Rimuovere le fiale dall'evaporatore. Ricostituire ciascun campione in 60 μL dello 0,1% (v/v) di acido formico in acqua. Aggiungere il solvente nel flaconcino contenente il materiale residuo. Chiudere saldamente le fiale e il pozzo del vortice.
8. Trasferire il campione in un tubo da 1,5 ml e girare a 14.000 x g per 15 minuti a 4 °C per separare la proteina precipitata.
9. Senza disturbare il pellet proteico, trasferire i supernatinanti in flaconcini cromatografici con inserti in vetro conico con pipetta automatica. Chiudere saldamente le fiale.
10. Verificare la presenza di bolle d'aria nel flaconcino inserto e rimuoverle se necessario (ad esempio, mediante vortice).
11. Trasferire i flaconcini cromatografici contenenti campioni nell'autocampionatore LC. Registrare la posizione dei campioni inseriti in un vassoio di campionamento automatico.

4. Preparazione di campioni di controllo qualità (QC)

1. A picco il mezzo di coltura pretrattato a carbone (preparato in un tubo centrifugo da 1,5 ml) con 0,75 μL di soluzione 0,1 g/L 3NT e standard di quattro cinurenine (3HKyn, 3HAA, Kyn, XA) ad una concentrazione selezionata dall'intervallo lineare delle curve di taratura. Mantenere il volume finale del campione a 150 μL.
   NOTA: Se applicabile, preparare più campioni di QC a diverse concentrazioni che rientrano nell'intervallo lineare della curva di calibrazione.
2. Seguire il protocollo descritto nella sezione 3 (passaggi 3.2-3.11).

5. Configurazione del sistema LC-MS

1. Preparare i solventi di fase mobile: Solvente A: formato ammonio da 20 mmol/L in acqua ultrapura (pH 4.3 regolato con acido formico); Solvente B: acetonitrile al 100%.
   NOTA: Utilizzare solo bottiglie di vetro borosilicato. Risciacquare le bottiglie con acqua ultrapura prima di riempirle. Non utilizzare bottiglie pulite con detergenti.
   ATTENZIONE: Acetonitrile provoca gravi effetti sulla salute o morte. È facilmente infiammabile dal calore. Acetonitrile liquido e vapore possono irritare occhi, naso, gola e polmoni.
   1. Preparare 5 mol/L di soluzione stock di formato ammonio sciogliendo un reagente cristallino (15,77 g) in 50 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro. Mescolare fino a quando tutti i residui si dissolvono. Filtrare attraverso la membrana di 0,45 μm per rimuovere eventuali detriti residui (ad esempio, utilizzando un filtro per siringhe di nylon). Conservare la soluzione stock a 4 °C.
   2. Preparare il solvente A aggiungendo 4 ml di formato ammonio 5 mol/L in acqua a 980 ml di acqua ultrapura in una bottiglia di vetro ambrato e mescolare bene. Immergere una barra di agitazione e mettere la bottiglia con il solvente su un agitatore magnetico. Immergere un elettrodo di pH nella soluzione e controllare il pH sotto agitazione. Aggiungere la soluzione di stock di acido formico (98%-100%) dropwise utilizzando una pipetta automatica con punta da 0,2 mL per ottenere pH 4.3, regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura e mescolare bene.
      NOTA: Preparare i solventi almeno una volta alla settimana per prevenire qualsiasi crescita microbica.
      ATTENZIONE: L'acido formico (FA) è tossico se inalato, provoca ustioni cutanee e danni agli occhi. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.
   3. Filtrare tutte le soluzioni attraverso la membrana da 0,22 μm (ad esempio, filtro siringa di nylon) per rimuovere eventuali detriti residui. Facoltativamente, utilizzare i filtri di ingresso del solvente dedicati ai serbatoi di solvente LC per proteggere il sistema dalle particelle in arrivo.
2. Avviare il software di controllo e acquisizione dati LC-MS.
3. Eliminare il sistema LC con la fase mobile per rimuovere le bolle e innescare tutti i canali del solvente.
4. Ensemble una colonna di guardia per proteggere la colonna analitica dall'intasamento.
5. Lavare la protezione e la colonna analitica (C18, 2,1 x 100 mm, 1,8 μm) con acetonitrile al 100% per circa 30 minuti, e quindi con solvente al 100% A fino a quando non si osserva una pressione stabile nella colonna. Controllare le prestazioni del sistema utilizzando il software di controllo.
6. Impostare i parametri LC appropriati nel software di acquisizione dati.
   1. Impostare il programma di gradiente: 0-8 min solvente B 0%; 8-17 min solvente B 0-2%; 17-20 min solvente B 2%; 20-32 min solvente B 10-30%; 32-45 min solvente B 0%.
   2. Impostare la portata di fase mobile a 0,15 mL/min, il tempo di esecuzione totale dell'analisi per 45 minuti, la temperatura della colonna a +40 °C e il volume di iniezione a 10 μL.
7. Impostate i parametri di acquisizione del rivelatore di spettrometria di massa.
   1. Applicare parametri di ionizzazione: monitoraggio ionica singola (SIM), ionizzazione positiva, pressione nebulizzatore di 50 psi, +350 °C temperatura del gas di essiccazione, flusso di gas di essiccazione di 12 L /min e tensione capillare di 5500 V.
   2. Selezionare gli ioni di monitoraggio degli aliti: per 3HKyn m/z 225.0 (periodo di scansione: 2-6 min, fragmentor voltage: 100 V); per Kyn m/z 209.0 (periodo di scansione: 6-12 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3HAA m/z 154,0 (periodo di scansione: 12-18 min, tensione frammentaria: 80 V); per 3NT m/z 227,0 (periodo di scansione: 18-23 min, tensione frammentaria: 100 V); per XA m/z 206.0 (periodo di scansione: 23-45 min, tensione frammentaria: 100 V).
8. Costruire un worklist ed eseguire esempi nel sistema LC.
9. In un primo momento, prima dell'analisi dei campioni sperimentali, eseguire un campione vuoto (solvente A) almeno in triplicati, seguito da un campione di QC.
10. Aprire il software di analisi dei dati e caricare i risultati ottenuti per il campione qc.
11. Controllare la posizione dei picchi di aliti sul cromatogramma. Quando i segnali si spostano oltre la posizione prevista, regolare i cancelli del tempo per un'adeguata raccolta di segnali di aliti. Consultare il manuale del software per istruzioni sull'integrazione del segnale.

6. Costruire la curva di calibrazione

1. Nel software di acquisizione dati aggiungere standard di calibrazione nell'elenco di lavoro ed eseguire gli standard nei triplicati.
2. Integrare e misurare l'area di picco corrispondente a 3HKyn, Kyn, 3HAA, 3NT e XA al tempo di ritenzione di circa 4,4 min, 10 min, 16 min, 21 min e 30 min, rispettivamente.
3. Costruisci curve di calibrazione individuali per ogni metabolita utilizzando un programma di fogli di calcolo.
   1. Per creare il grafico di calibrazione, tracciare il valore per un rapporto tra l'area di picco dell'aalita sull'area di picco 3NT e la concentrazione dell'a analitico.
   2. Analizzare il campione vuoto (mezzo di coltura pretrattato a carbone puntato solo con 3NT) per assicurarsi che non vi sia traccia degli aliti studiati nel mezzo. In caso contrario, sottrarre il valore ottenuto da ogni punto di calibrazione.
   3. Controllare la linearità di ogni curva di calibrazione.
      1. Individualmente, per ogni a analitico, creare un'equazione lineare di intercetta di pendenza (y = ax +b), dove y corrisponde al rapporto tra l'area di picco dell'a analitico e l'area di picco 3NT, a è la pendenza, x è la concentrazione di a analitici (μmol/L), e b si riferisce all'intercetta della curva. Tracciando il grafico 'y' contro 'x' verrà generato la curva di calibrazione.
      2. Aggiungere una linea di tendenza lineare al grafico, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico. Assicurarsi che il coefficiente di regressione sia > 0,990. In caso di standard di calibrazione non corrispondenti, prepararli e/o analizzarli ancora una volta. Facoltativamente, modificare l'intervallo di concentrazione della curva di calibrazione.
   4. Analizzare i campioni qc per verificare le prestazioni del sistema prima di analizzare i campioni sperimentali. In caso di incompatibilità (± 20% dal valore di riferimento), preparare le nuove curve di calibrazione.

7. Coltura cellulare in vitro e raccolta di campioni per l'analisi

1. Placcare le cellule tumorali studiate (MDA-MB-231 o SK-OV-3) in DMEM (Medium dell'Aquila Modificata di Dulbecco) contenenti 4,5 g/L di ᴅ-glucosio, 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 2 mmol/L ʟ-glutammina e 1 U penicillina/streptomicina e coltura a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO₂ per espanderli per l'esperimento. Passare le cellule all'80% della confluenza.
2. Staccare le cellule dal piatto di coltura usando tripina, seme per l'esperimento su piastre a 12 po 'ad una densità di 0,3 × 10^{6 cellule} per pozzo e posto in un'incubatrice durante la notte.
3. Il giorno dopo, aspirare il mezzo di coltura e aggiungere DMEM fresco con o senza l'aggiunta dei composti studiati, a seconda del design sperimentale.
4. Dopo 48 ore, raccogliere il mezzo dall'alto delle cellule (circa 500 μL) in un tubo da 1,5 ml. Centrifuga a 14.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. Raccogliere il supernatante e conservare a -80 °C fino all'analisi.
5. Salvare il pellet cellulare dal passaggio 7.4 per la stima delle proteine. Congelare i campioni a -20 °C.
   NOTA: I risultati ottenuti per un mezzo da pozzi diversi devono essere normalizzati al contenuto proteico totale per tenere conto della variabilità del numero di cellule nei singoli pozzi. La concentrazione proteica può essere valutata come descritto nella fase 9.

8. Preparare campioni per l'analisi LC-MS

1. Scongelare il campione congelato a temperatura ambiente e mescolare bene. Trasferire 149,25 μL del mezzo di coltura in un tubo di centrifugazione (1,5 ml).
2. Aggiungere 0,75 μL di 0,1 g/L di soluzione 3NT (standard interno). Chiudere bene i tubi e il vortice.
3. Aggiungere 150 μL di metanolo refrigerato a -20 °C contenente 1% (v/v) FA per la deproteinizzazione del campione. Chiudere bene i tubi e il vortice.
4. Continuare con la preparazione del campione come descritto nella sezione 3 (passaggi 3.3-3.11).
   NOTA: Alcune cellule tumorali come SK-OV-3 secernono grandi quantità di Kyn in un mezzo di coltura. Per inserire i dati in un intervallo lineare della curva di calibrazione, è necessaria una diluizione di circa 100 volte del campione. In questo caso, diluire una porzione del campione con 0,1% (v/v) FA in acqua e analizzare oltre al campione non diluito. I campioni di riferimento delle norme per la curva di taratura devono essere preparati in un terreno di coltura completo diluito 100 volte. In alternativa, aggiungere più punti nella curva di calibrazione (se si ottengono una corretta solubilità e linearità) per adattarlo al livello di concentrazione di Kyn nel campione sperimentale.
5. Analizzare i campioni per LC-MS come descritto nella sezione 5. Costruire un elenco di lavoro ed eseguire ogni esempio in triplice copia.
6. Una volta completato l'elenco di lavoro, misurare l'area di picco dell'alita.
7. Generare un foglio di calcolo utilizzando il software disponibile e ottenere dati numerici.
8. In una colonna del foglio di calcolo calcolare il rapporto dell'area di picco dell'alyte sull'area di picco 3NT.
9. Utilizzare una singola equazione di calibrazione lineare dedicata per ogni alita (dal passaggio 6.3.) per calcolare le concentrazioni di aliti presenti nei campioni sperimentali.

9. Valutazione del contenuto proteico e normalizzazione dei dati

1. Resopendare il pellet cellulare dal passaggio 7.5 con 100 μL di salina tamponata da fosfati (PBS) in tubo da 1,5 ml.
   NOTA: Preparare la soluzione di PBS sciogliendo 8 g di cloruro di sodio, 0,2 g di cloruro di potassio, 1,44 g di dibasico di fosfato di sodio, fosfato di diidrogeno di potassio in 950 mL di acqua ultrapura. Mescolare bene. Regolare il pH a 7,4 con acido cloridrico (dropwise). Regolare il volume fino a 1 L con acqua ultrapura. Mescolare bene fino a omogeneo.
   ATTENZIONE: L'acido cloridrico è altamente corrosivo e deve essere maneggiato con adeguate precauzioni di sicurezza. Il contatto con la pelle umana può causare arrossamento, dolore, ustioni cutanee. Lavorare sotto la cappa dei fumi; indossare guanti protettivi e cappotto.
2. Congelare i campioni a -20 °C e poi scongelarsi sul ghiaccio. Ripetere questo passaggio 3x.
3. Centrifugare i campioni a 14.000 x g per 15 min a 4 °C. Raccogli i supernatanti nei nuovi tubi. Non disturbare il pellet.
4. Diluire i supernatanti 10x con PBS.
5. Costruire una curva di calibrazione da 0 a 2 μg della proteina per intervallo di pozzi.
   1. Preparare la soluzione standard di albumina di siero bovino (BSA) per la calibrazione. Sciogliere 1,23 μg di BSA in 1 mL di acqua ultrapura e pozzo vortice.
   2. Su una piastra da 96 pozza, caricare diverse quantità di soluzione standard BSA (1,23 μg/mL): 0 μL, 2 μL, 4 μL, 5 μL, 7 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL.
   3. Riempire il pozzo con PBS al volume finale di 50 μL.
6. Caricare 10 - 15 μL di lire cellulare dal passo 9.4 sulla stessa piastra da 96 pozzi. Riempire i pozzi con PBS per raggiungere il volume finale di 50 μL.
   NOTA: Se necessario, regolare il volume dell'aliquota di lysate della cella in ogni pozzo per adattarlo all'intervallo lineare della curva di calibrazione. Mantenere il volume finale a 50 μL del campione per pozzo.
7. Aggiungere 200 μL di un reagente di Bradford (diluito 5 volte con acqua ultrapura) ad ogni pozzo.
8. Incubare il patè da 96 pozzi per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Inserire la piastra in un lettore di micropiastrine. Misurare l'assorbanza a λ = 595 nm.
9. Costruire una curva di calibrazione utilizzando un programma di foglio di calcolo. Tracciare la quantità di BSA (μg) rispetto all'assorbanza. Aggiungere una linea di tendenza lineare, visualizzare l'equazione della curva di calibrazione e il coefficiente di regressione nel grafico.
10. Usa l'equazione lineare (y = ax +b, dove y corrisponde all'assorbanza a λ = 595 nm, a è la pendenza, x è un contenuto proteico (μg), e b si riferisce all'intercetta della curva) per calcolare la quantità proteica nel campione.
    NOTA: si consideri un fattore di diluizione del campione nei calcoli.
11. Utilizzare il contenuto proteico stimato per normalizzare la quantità di cinurenina nel campione per 1 mg di proteine. Per fare questo, dividere la concentrazione di cinurenine determinata nella fase 8.9 con il contenuto proteico totale dal passo 9.10.

LC-MS presenta indiscutibili vantaggi nella quantificazione di molecole biologicamente attive, anche se alcuni componenti di campioni complessi causano i cosiddetti effetti matriciali e compromettono la ionizzazione degli aaliti. Porta alla soppressione degli ioni o al miglioramento degli ioni, diminuendo fortemente l'accuratezza e influenzando un limite di rivelazione /quantificazione della LC-MS, che è considerato un punto "debole" del metodo. Nel nostro protocollo, gli ioni sono generati dalla ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità positiva, che è stata utilizzata anche in altri studi sulla determinazione dei metaboliti Trp¹³. L'ESI, tuttavia, è più soggetta agli effetti matriciali rispetto alla ionizzazione chimica della pressione atmosferica (APCI)²⁸. Pertanto, per una quantificazione accurata dei metaboliti Trp in un mezzo di coltura cellulare, abbiamo utilizzato una calibrazione interna standard e a matrice per compensare gli effetti dipendenti dalla matrice sul segnale dell'alita e per correggere la perdita dei composti bersaglio durante una fase di preparazione del campione. Abbiamo applicato lo stesso standard interno (3NT) per tutti gli aaliti studiati (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA). 3NT non è stato trovato nel mezzo originale e fresco utilizzato per la coltura cellulare e mostra un comportamento simile come i composti bersaglio nelle condizioni analitiche applicate. Ciò rende 3NT lo standard interno appropriato²⁷. Inoltre, per semplificare il protocollo, al fine di renderlo più accessibile a un ampio gruppo di utenti, proponiamo solo una fase di preparazione del campione che comporta la rimozione delle proteine mediante trattamento con metanolo contenente 1% (v/v) FA.

All'interno del protocollo presentato, si consiglia di preparare le curve di calibrazione utilizzando il mezzo completo utilizzato per la coltura cellulare. Tuttavia, il mezzo di coltura potrebbe contenere Kyn endogeno che disturba una corretta stima dell'area di picco dell'alita, specialmente nelle soluzioni di calibrazione a basse concentrazioni. La figura 1A illustra i risultati LC-SQ ottenuti durante l'analisi di DMEM contenente 4,5 g/L D-glucosio (DMEM-HG) e FBS al 10% (v/v) utilizzato dal nostro gruppo per una coltura di cellule tumorali. Abbiamo scoperto che il nuovo mezzo di coltura completo contiene inizialmente alcuni Kyn che possono essere rimossi per purificazione con carbone attivo (Figura 1B). Durante l'analisi dei campioni sperimentali, il mezzo di coltura DMEM-HG completo è stato anche analizzato come campione di controllo, e l'area di picco di Kyn è stata sottratta dall'area di picco registrata per Kyn in ogni campione testato.

Figura 1: Risultati rappresentativi LC-SQ del mezzo di coltura DMEM-HG completo (A) prima e (B) dopo il pretrattamento su carbone attivo. Campioni di terreno di coltura sono stati picchiati con la stessa quantità dello standard interno (3NT). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel passaggio seguente è stato stabilito un tempo di conservazione per ogni alyte di destinazione (vedere un cromatogramma nella figura 2A). La buona pratica nell'analisi LC-MS è eseguire un campione qc prima dei campioni effettivi per confermare i tempi di conservazione appropriati degli aliti. Occasionalmente, si può osservare uno spostamento dei segnali LC e tendono ad accadere disallineamenti. La figura 2B mostra una leggera variazione dei tempi di ritenzione degli aliti, che tuttavia non disturba le misurazioni corrette. D'altro canto, la figura 2C presenta un cambiamento significativo in una posizione dei picchi target. Come visto, il segnale 3NT è stato significativamente spostato verso un tempo di ritenzione più breve ed è uscito dal cancello del tempo impostato. In questo caso, un'analisi quantitativa appropriata era impossibile perché il segnale standard interno non può essere misurato correttamente. Ciò potrebbe essere dovuto a diversi fattori, vale a dire l'insufficiente equilibrazione della colonna, l'errata miscelazione dei solventi nella pompa, l'uso di diluenti del campione inappropriati o la contaminazione della fase stazionaria della colonna. La figura 2D,tuttavia, rappresenta una situazione in cui i picchi registrati soffrono di intensità gravemente basse. Ciò può essere il risultato di un guasto all'iniezione, di una perdita nel sistema o di un danno ms. Inoltre, i componenti della matrice di co-eluizione possono generare ioni con m/z selezionati per gli analiti di destinazione, come nella figura 3A, dove viene mostrato il risultato dell'analisi del supporto di coltura delle celle MDA-MB-231. Al tempo di ritenzione di circa 25 minuti, è stato osservato un segnale forte derivato da una componente della matrice sconosciuta (composto X). Il picco appare nel periodo di scansione, quando è stato monitorato lo ione di m/z 206 (selezionato per XA). Tuttavia, questo segnale non corrisponde all'alita a causa dell'incompatibilità del tempo di ritenzione. Per evitare errori durante la massima integrazione, si consiglia anche un confronto del tempo di conservazione con quello registrato per i campioni qc.

Figura 2. Esempi di risultati corretti e errati. I cromatogrammi corretti dell'analisi del campione QC a livellidi concentrazione (A)medi e (B) bassi registrati in giorni diversi. Esempio del cromatogramma errato derivante da una modifica significativa dei tempi di ritenzione degli analiti (C) e da intensità insoddisfacenti dei picchi (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati rappresentativi del mezzo di coltura raccolto da diverse linee cellulari tumorali. Il mezzo di coltura delle cellule (A) MDA-MB-231 (cancro al seno umano) e (B) SK-OV-3 (cancro all'ovaio umano) è stato analizzato utilizzando LC-SQ. Il composto X indica il segnale di un composto sconosciuto presente nel mezzo di coltura che co-eluisce con l'alita e gli ionizza per formare uno ione con m/z selezionato per l'alita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il mezzo di coltura utilizzato per le cellule tumorali (DMEM) contiene quantità significative di Trp. Il suo isotopo⁽¹³C-Trp) condivide lo stesso ione di XA(m/z 206) e potrebbe interferire con la determinazione XA. Tuttavia, nelle condizioni cromatografiche applicate, il segnale da Trp è ben separato dal segnale XA. Pertanto, la Corte ha concluso che il Trp presente in DMEM non influisce sulla quantificazione xa e sull'accuratezza del metodo (figura 4).

Figura 4. Posizione dei segnali di triptofano (Trp) e acido xanthurenico (XA) sul cromatogramma MS. Soluzioni standard di Trp (49,0 μmol/L) e XA (48,8 μmol/L) sono state preparate in formato solvente A (20 mmol/L di ammonio in acqua, pH 4,3) in condizioni LC-SQ ottimizzate. Gli ioni di m/z 205 (corrispondenti a [Trp+H]⁺) e m/z 206 (corrispondenti a [XA+H]⁺) sono stati monitorati rispettivamente per Trp e XA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il metodo analitico presentato ha superato con successo il test di validazione in termini di linearità, precisione (coefficienti di variazione ≤15%), accuratezza (96-104%), recupero (96-119%) ed effetti matriciali per tutti gli a analitici, come è stato descritto in dettaglio nel nostro precedente articolo ^27.

Infine, abbiamo confermato l'applicazione dell'approccio analitico descritto a un mezzo raccolto dalle cellule tumorali umane coltivate in vitro. I nostri dati hanno confermato che un livello di cinurenine può variare significativamente in un mezzo di coltura raccolto da diversi tipi di cellule (Figura 3). Abbiamo analizzato il mezzo di coltura da 2 tipi di linee tumorali, ad esempio le cellule MDA-MB-231 e SK-OV-3 derivate rispettivamente dal cancro al seno e alle ovaie. Le linee selezionate sono spesso utilizzate come modelli per studiare eventi molecolari e per test anti-cancro. Come abbiamo osservato, le cellule coltivate in un mezzo standard di controllo hanno rilasciato diverse quantità di metaboliti di triptofano, cioè, le cellule MDA-MB-231 hanno rilasciato una quantità quantificabile di Kyn e XA a bassa concentrazione di nmol/L (Figura 3A), mentre le cellule SK-OV-3 hanno mostrato significativamente più Kyn, secrezione molto bassa di XA e nessuna secrezione di altre cinurenine studiate come indicato dall'intensità dei picchi corrispondenti (Figura 3B).

Questo documento presenta un protocollo dettagliato LC-SQ per la quantificazione simultanea di quattro principali metaboliti Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) che vengono misurati in un mezzo da cellule tumorali umane coltivate in vitro. Particolare attenzione è rivolta alla preparazione del campione, alla procedura cromatografica/spettrometrica di massa e all'interpretazione dei dati, i punti più importanti all'interno dell'analisi.

In generale, l'analisi LC-MS, a causa dell'elevata sensibilità, richiede i più alti standard di rigore e purezza del protocollo dei materiali usati. Si riferisce a un'applicazione di vetrerie pulite e adeguatamente lavate, nonché prodotti chimici di alta qualità durante la procedura standard. È molto importante utilizzare solventi a base di acqua dolce di una fase mobile per evitare contaminazioni microbiche che in questo approccio sensibile potrebbero influenzare drasticamente l'analisi. Prima di iniettare in un sistema LC, i campioni analizzati devono essere attentamente esaminati per la presenza di particelle insolubili. È importante notare che la colonna deve essere sufficientemente equilibrata prima dell'analisi del campione. Il mancato rispetto di queste regole può comportare la contaminazione dei campioni, del sistema LC e della colonna analitica o una ionizzazione insufficiente del campione nella sorgente MS, causando infine uno spostamento dei segnali.

Ci sono 2 punti chiave all'interno del protocollo che devono essere enfatizzati per ottenere risultati ottimali. La parte più critica nel protocollo presentato è la fase di preparazione del campione. L'uso di una procedura inadeguata causa una perdita di composti bersaglio e di conseguenza una quantificazione imprecisa. Nel nostro approccio, durante lo sviluppo del metodo, la fase di preparazione del campione è stata attentamente ottimizzata insieme alla selezione del solvente per la rimozione delle proteine. Come abbiamo determinato, il trattamento del campione con metanolo contenente l'1% (v/v) di acido formico ha prodotto i migliori recuperi per tutte le cinurenine studiate. È stato inoltre valutato l'impatto di una composizione di fase mobile sull'entità della ionizzazione degli aliti. Abbiamo controllato le fasi mobili costituite da formato ammonio da 0-20 mmol/L o acetato di ammonio a diverso pH regolato con acido formico o acetico. La fase mobile contenente 20 mmol/L formato ammonio in acqua (pH 4.3, solvente A) e acetonitrile (solvente B) ha fornito le migliori condizioni possibili per la quantificazione simultanea di Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA²⁷. Un altro passo importante nell'analisi LC-MS è il picco di integrazione. Alcune cinurenine si trovano in un campione a livelli di concentrazione molto bassi. In questo caso, i segnali di composti co-eluizzanti potrebbero sovrapporsi al segnale dell'alita bersaglio o generare un picco in un tempo di ritenzione simile. Un utente inesperto di questo metodo può trovare alcune difficoltà con una corretta integrazione di picco, come esemplificato nella figura 2C. Pertanto, è necessario e altamente raccomandato controllare il tempo di conservazione per gli aaliti e confrontarsi con un campione di QC.

Una buona prassi analitica comprende la scelta di uno standard interno appropriato per un'analisi quantitativa. Nel presente documento, proponiamo un approccio semplice ed economico utilizzando un solo standard interno (3NT) come analogo di quattro kynurenine. I risultati hanno confermato che 3NT presenta un comportamento cromatografico simile ai composti bersaglio e di conseguenza consente di ottenere una buona precisione e precisione del metodo²⁷. Nelle condizioni LC applicate, il picco 3NT è ben separato dai segnali degli altri aliti e facile da misurare. Ci rendiamo conto che gli standard interni etichettati isotopicamente (ILIS) utilizzati in^{tali analisi 14,15 forniranno} una migliore compensazione degli effetti matriciali e un migliore controllo di tutte le variabili che possono portare a risultati falsi. D'altra parte, gli ILIS per tutti gli aliti target non sono sempre facilmente disponibili, per non parlare del loro costo elevato. Inoltre, gli ILIS sono dedicati piuttosto a LC-MS/MS che a LC-SQ con modalità SIM (Single Ion Monitoring) utilizzata in questo documento.

L'uso di 3NT come standard interno potrebbe essere considerato qui come una limitazione del metodo a causa della possibilità di formazione di 3-nitrotirosina sulle proteine²⁹. Tuttavia, nel caso di un mezzo di coltura, non abbiamo osservato alcuna 3-nitrotirosina endogena libera. Ci ha permesso di riconoscere 3NT come uno standard interno adatto. Tuttavia, raccomandiamo una valutazione preliminare di un livello 3NT endogeno iniziale, specialmente quando si studiano altri tipi di cellule rispetto a quelli testati in questo rapporto.

In sintesi, quando si seleziona un analogo di qualsiasi alita, è necessario considerare molte caratteristiche, ad esempio la somiglianza chimica e l'assenza iniziale in una matrice campione. Inoltre, una stabilità dello standard interno analogico in una matrice campione, la sua efficienza di recupero e ionizzazione in presenza di componenti matriciale potrebbero differire dai composti bersaglio. Pertanto, tutte queste caratteristiche dovrebbero essere considerate e attentamente studiate durante lo sviluppo del metodo.

Il sistema analitico nel metodo presentato che comprende un rilevatore MS ci ha permesso di raggiungere bassi limiti di rilevamento (0,0033 – 0,0108 μmol/L)²⁷. In questo modo misurazioni simultanee di 3HKyn, Kyn, 3HAA, XA all'interno degli intervalli di concentrazione di 0,018 - 4,46 μmol/L, 0,0096 - 3,84 μmol/L, 0,033 - 13,06 μmol/L e 0,019 - 4,87 μmol/L, rispettivamente. La limitazione principale di qualsiasi analisi LC-SQ è associata a una corretta separazione dei componenti del campione su una colonna LC. Una scarsa separazione contribuisce a ridurre la selettività rispetto al rilevamento con una spettrometria di massa quadrupolo tandem che utilizza ioni prodotto e modalità di monitoraggio a reazione multipla (MRM). Per evitare interferenze da altri componenti della matrice che condividono ioni uguali o simili con una molecola bersaglio, le condizioni di separazione LC devono essere attentamente ottimizzate. Ad esempio, ¹³isotopi C Trp (presenti in tracce) generano lo stesso ione di m/z 206 selezionato per il monitoraggio XA. L'interpretazione errata è stata evitata ottimizzando le condizioni cromatografiche e la separazione soddisfacente di Trp e XA eluito dalla colonna(figura 4).

Nelle applicazioni future, alcune modifiche al protocollo possono essere implementate. Un potenziale utilizzatore può modificare una concentrazione della norma interna (3NT) quando si prevede che i livelli di cinurenine studiate diminuiranno rispetto alle concentrazioni qui presentate. È importante sottolineare che la concentrazione di 3NT dovrebbe essere la stessa sia negli standard di taratura che nei campioni sperimentali. In caso di un livello di analita estremamente elevato, come Kyn osservato nelle cellule SK-OV-3, si consiglia di lavorare con una concentrazione più elevata di 3NT. Se è necessaria la diluizione del campione, questa deve essere eseguita nella fase finale del protocollo, prima dell'iniezione del campione sulla colonna LC.

In letteratura, ci sono alcuni protocolli proposti per l'analisi quantitativa LC-MS/MS delle cinurenine in un mezzo di coltura da cellule diverse. Un protocollo fornisce una determinazione simultanea di 3 metaboliti, cioè Kyn, 3HKyn e 3HAA ma è meno sensibile (limite di quantificazioni (LOQ) a livelli superiori), a differenza del nostro metodo²¹. Un altro rapporto ha presentato un metodo che consente la quantificazione di 4 kynurenine, tra cui Kyn, 3HKyn, 3HAA e XA con LOQ^{25 simili.} Nessuno di loro, tuttavia, è stato ottimizzato per il rilevamento delle cinurenine generate da cellule tumorali coltivate in vitro. I componenti di una matrice campione influenzano la ionizzazione degli aliti nella sorgente MS diminuendo o aumentando il segnale, che è una causa di risultati inaffidabili. Per ottenere dati più accurati, abbiamo proposto di utilizzare uno standard interno analogico (3NT) in combinazione con una calibrazione abbinata a matrice per una migliore compensazione degli effetti dipendenti dalla matrice.

Utilizzando la metodologia presentata, abbiamo potuto osservare che Kyn era il metabolita Trp più abbondante in un mezzo di coltura raccolto dai tipi di cellule tumorali analizzate, mentre gli altri metaboliti studiati in condizioni di coltura di controllo non sono stati rilevati (escluso XA presente in tracce ma quantità rilevabili). Tuttavia, quando le cellule sono state stimolate con un potente attivatore immunitario - lipopolysaccharide batterico, è stata secreta una maggiore quantità di XA oltre a Kyn.  D'altra parte, i 3HKyn e i 3HAA rilevati che si formano a monte di XA all'interno di KP erano ancora sotto LOQ²⁷. Ciò suggerisce che alcuni metaboliti KP presenti in piccole quantità in un mezzo di coltura potrebbero essere difficili da misurare utilizzando l'approccio LC-SQ proposto. Tuttavia, il protocollo presentato è utile per identificare le modifiche in KP quantificando i metaboliti Trp chiave accumulati. L'utilizzo di questa metodologia in studi futuri per coinvolgere un sistema di coltura cellulare in vitro fornirà nuovi biomarcatori di malattie immunitarie e cancro. Il nostro approccio offre un test convalidato e affidabile con sensibilità pertinente per i modelli cellulari che sono impegnativi a causa delle basse concentrazioni dei metaboliti KP a valle. Le istruzioni fornite consentiranno ai ricercatori di diversi campi di utilizzare questo approccio per la quantificazione delle principali cinurenine legate al cancro e ad altre malattie. I nostri dati (inediti) mostrano che è utile per studiare la modulazione KP nelle cellule esposte a diversi prodotti di glicazione, ma dovrebbe anche trovare un'applicazione in altri campi di ricerca e malattie con componente immunitaria, cioè in biologia endometria e riproduzione³⁰.

Il protocollo presentato può essere ulteriormente ampliato per determinare ulteriori aliti che potrebbero accumularsi in un mezzo di coltura durante diverse condizioni sperimentali. Le norme di riferimento appropriate degli aliti dovrebbero essere utilizzate per la convalida del metodo in termini di accuratezza, precisione, linearità, recupero o selettività prima di essere utilizzate per analisi quantitative. Inoltre, a seconda dello scopo della ricerca, il protocollo potrebbe essere utilizzato per le singole kynurenine (3HKyn, Kyn, 3HAA o XA). In questo caso, gli ioni corrispondenti ai composti che non sono considerati per l'analisi, potrebbero essere rimossi dalle impostazioni MS. Le modifiche adatte nel programma gradiente LC aiuteranno a tagliare i tempi di analisi.

Quando si studia KP, è rilevante valutare l'attività dell'enzima IDO. Questo potrebbe essere stimato semplicemente misurando il consumo di Trp e il rilascio di Kyn in un mezzo di coltura o calcolando un rapporto concentrazione di cinurenina-triptofano ([Kyn]/[Trp])³¹. Nel nostro approccio, non abbiamo misurato una concentrazione Trp, tuttavia, il protocollo potrebbe essere ampliato aggiungendo questo obiettivo nell'analisi LC-SQ. Come approccio più biochimicamente appropriato, si consiglia di esprimere l'attività enzimatica IDO come quantità di Kyn prodotta da cellule per milligrammo di proteine al minuto come presentato altrove³². Abbiamo notato un vantaggio nell'utilizzare questo approccio nei nostri altri studi sulle cellule tumorali (manoscritto in preparazione) e raccomandiamo questo metodo quando si utilizza il modello di coltura cellulare in vitro.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Unione Europea dal Fondo europeo di sviluppo regionale nell'ambito del programma operativo sviluppo della Polonia orientale 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), dalla Facoltà di Biotecnologie e Scienze Ambientali dell'Università Cattolica Giovanni Paolo II di Lublino (sovvenzione giovani scienziati per Ilona Sadok), Centro nazionale di scienze polacco, OPUS13 (25/2017/B/NZ4/01198 per Magdalena Staniszewska, Principle Investigator).  Gli autori ringraziano la Prof.ssa Agnieszka Ścibior del Laboratorio di Stress Ossidativo, Centro per la Ricerca Interdisciplinare, JPII CUL per aver condiviso le attrezzature per la recupero cellulare e la quantificazione delle proteine.